В настоящее время рассматриваются различные, но во многом взаимосвязанные теории старения, такие как свободнорадикальная и митохондриальная, сформулирована геномная концепция, которая определяет старение как медленное угасание транскрипционной активности генома, теория ослабления систем репаративных механизмов, ликвидирующих продукты клеточного повреждения, и некоторые другие [1, 2]. Одной из общепринятых является свободнорадикальная теория старения (СРТС), согласно которой возникающий при старении дисбаланс оксидантных и антиоксидантных систем приводит к генерации, главным образом в митохондриях клеток, активных форм кислорода (АФК): супероксида (О₂^–), Н₂О₂, гидроксильного радикала (НО) и синглетного кислорода (↑О₂) в митохондриях, что вызывает множественное повреждение различных макромолекул и структур: ДНК, хроматина, белков, липидов, мембран, коллагена и др., что приводит к окислительному стрессу (ОС) и возникновению возрастных патологических процессов и заболеваний [3—7]. ОС запускает процессы апоптоза, приводящий к программируемой гибели клеток, а АФК включают механизмы окислительного повреждения ядерной и митохондриальной ДНК и ее репарацию, укорочение теломер и связанное с этими процессами клеточное старение. СРТС подтверждается многочисленными фактами. В частности, показано, что у людей в возрасте 83—85 и 90—105 лет наблюдается снижение антиокислительной и антирадикальной активности, повышение уровня продуктов перекисного окисления липидов [8]. Также показана прямая связь между видовой продолжительностью жизни и активностью супероксиддисмутазы, содержанием бета-каротина, альфа-токоферола и мочевой кислоты в сыворотке крови [9].

В последние годы получила развитие связанная с антиоксидантной концепцией митохондриальная теория старения, согласно которой в основе старения лежит прогрессирующая дисфункция митохондрий в различных тканях организма. На изменение митохондриальной энергетики при старении указывают данные об ослаблении процесса окисления янтарной кислоты и снижение активности сукцинатдегидрогеназы, ассоциированные с возрастом [10].

Отечественный оригинальный препарат Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат) в настоящее время широко применяется в клинической и амбулаторной практике для лечения различных заболеваний, связанных с синдромами ишемии и гипоксии различного генеза — патологией мозга и сердечно-сосудистой системы, в том числе инсультов и нейродегенеративных болезней. Широкий спектр эффектов Мексидола определяется его базисным политаргетным механизмом действия и мультимодальными свойствами. Мексидол обладает антиоксидантным, антигипоксическим и мембранотропным эффектами, способностью улучшать энергетический статус клетки и восстанавливать процессы в цикле Кребса, индуцировать митохондриогенез, подавлять аскорбатзависимое (неферментативное) и НАДФН₂-зависимое перекисное окисление липидов, повышать активность Se-зависимой глутатионпероксидазы, снижать активность индуцибельной NO-синтазы и связывать супероксидный анион-радикал, уменьшать глутаматную эксайтотоксичность [11—15].

Показано, что фрагмент молекулы Мексидола — 2-этил-6-метил-3-оксипиридин — при курсовом применении обладает способностью улучшать мнестические процессы и двигательные навыки у пожилых беспородных крыс [11, 16]. Установлено также, что Мексидол оптимизирует процессы обучения и памяти, нарушенные у старых мышей, улучшая как обучение, так и хранение и воспроизведение информации [17].

Таким образом, механизм действия Мексидола, связанный с воздействием на ключевые, базисные процессы повреждения клеточных структур, в том числе при старении, предполагает его позитивное влияние на возрастные изменения и продолжительность жизни.

Цель исследования — изучение влияния Мексидола на нарушенные в процессе старения когнитивные и моторные функции и пороги судорожной реакции, массу тела и продолжительность жизни у крыс-самцов линии Вистар.

Материал и методы

Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая» (Московская область) в возрасте 3 мес. Животные содержались в виварии ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» в домашних клетках, в контролируемых условиях окружающей среды (20—24 °C и 45—65% относительной влажности). В комнатах содержания животных поддерживали 12-часовой цикл освещения и 8—10-кратную смену объема воздуха в 1 ч. Крысы находились в поликарбонатных клетках, покрытых стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, по 4—6 особей в клетке. В качестве подстилки использовали древесные опилки лиственных пород деревьев. Применяли стандартный брикетный комбикорм, полнорационный для грызунов. Корм подавали ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки, фильтрованную водопроводную воду — ad libitum в стандартных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками.

Животные были разделены на 2 группы по 20 крыс, одна из которых получала воду, а другая — Мексидол. Мексидол применяли в виде 0,15% раствора, который заменял питьевую воду, 2 курсами по 2 мес крысам возраста 18—20 мес и 22—24 мес. Потребляемая крысой доза Мексидола составляла 40—75 мг/кг/сут.

Методика оценки когнитивных функций. Исследование проводили на крысах 3- и 24-месячного возраста при использовании методики условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [18]. Использовали установку УРПИ («Lafayette Instrument Co», США). Конструктивно установка состоит из подвесной маленькой платформы, освещенной специальной лампой и расположенной на расстоянии 1 м от пола, и соединенной через дверцу с темной камерой с электродным полом. Крысу помещали на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки, и животное, находящееся на неудобной освещенной платформе, быстро переходило в темную камеру. Сразу после этого отверстие закрывали и проводили обучение — наносили животному неизбегаемое электроболевое раздражение через электродный пол (сила обучающего тока составляла 0,45 мА, длительность каждого импульса — 1 с, интервал между последовательными импульсами — 2 с, 8 ударов). Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 7 дней после обучения, для чего крысу повторно помещали на освещенную платформу и определяли, помнит ли она полученное ранее в темной камере болевое раздражение, для чего в течение 200 с регистрировали латентный период первого захода крысы в темную опасную камеру. Процедуру обучения и воспроизведения УРПИ проводили у животных каждой возрастной группы.

Мексидол в виде 0,15% раствора, который заменял питьевую воду, крысы получали 2 курсами по 2 мес: в возрасте 18—20 мес и 22—24 мес. Потребляемая крысой доза Мексидола составляла 40—75 мг/кг/сут. В эксперименте с 3-месячными крысами Мексидол вводили внутрибрюшинно в дозе 150 мг/кг до обучения УРПИ и 7 дней перед воспроизведением.

Для определения судорожных порогов крысам 24-месячного возраста вводили пентелентетразол (ПТЗ) подкожно (в область холки шеи) в малой дозе 70 мг/кг. ПТЗ в этой дозе не приводит к развитию типичного клонического приступа, а вызывает только отдельные клонические подергивания отдельных мышц тела животного.

Для оценки моторных дефицитов и нарушения координации движений использовали методики вращающегося стержня и подтягивания на перекладину, описанные в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [19]. Исследование проводили на крысах 20-месячного возраста. В тесте вращающегося стержня (установка Rota Rod, Ugo Basile, Италия) крыс помещали на вращающийся горизонтальный стержень диаметром 4 см (скорость вращения горизонтального стержня 10 оборотов в 1 мин с реверсом вращения на 59-й секунде). Сначала проводили обучающий сеанс удерживания на стержне (1 мин), а затем повторно помещали крыс на стержень и регистрировали количество крыс, удержавшихся на стержне в течение 2 мин наблюдения. Тест подтягивание на перекладину использовали для оценки мышечного тонуса задних конечностей и силы передних конечностей. Установка представляет собой натянутую на высоте 40—50 см от уровня стола проволоку. Крысу подвешивали передними лапами за проволоку и регистрировали способность/неспособность животного подтянуться на перекладине.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических программ Statistica 6, Биостат 8. Различия в группах считали достоверными при p≤0,05.

Все процедуры с животными в исследовании проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986); Principles of Good Laboratory Practice (OECD, ENV/ MC/ CUEM (98)17, 1997); Good Laboratory Practicefor Nonclinical Laboratory Studies (21 CFRPart 58, 1978, USA, FDA).

Результаты

1. Влияние Мексидола на когнитивный дефицит у старых крыс-самцов линии Вистар в тесте УРПИ

Показано, что контрольные животные (3 мес), помещенные на освещенную подвешенную платформу перед входом в темную камеру, в силу инстинкта сразу переходят в темную камеру (латентное время 15,4±3,1с). После получения в темной камере болевого раздражения (обучение) крыса, сразу после этого повторно помещенная на освещенную платформу, не заходит в темную камеру и остается сидеть на освещенной платформе (УРПИ). В данном эксперименте тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 7 дней после обучения и определяли, помнит ли животное (через 7 дней) полученное ранее в темной камере болевое раздражение. Регистрировали латентный период первого захода крысы в темную опасную камеру.

Установлено, что контрольные крысы 3-месячного возраста при воспроизведении УРПИ через 7 дней после обучения хорошо помнили ситуацию и заходили в темную камеру в среднем через 161,5±21,8 с. (табл. 1). Мексидол увеличивал латентное время захода в темную камеру (см. табл. 1).

Контрольные крысы 24-месячного возраста хуже помнили обучение и заходили в опасную темную камеру, в которой они раньше получали болевое раздражение, с достоверно более коротким латентным периодом, чем крысы 3-месячного возраста (см. табл. 1).

Крысы 24-месячного возраста, получавшие Мексидол в питьевой воде 4 мес, лучше, чем контрольные 24-месячные крысы, помнили обучение и хорошо воспроизводили УРПИ через 7 дней после него. Под влиянием Мексидола выявлено статистически достоверное повышение латентного времени захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса по сравнению с контролем (см. табл. 1).

Примечание. ^# — достоверность отличий от группы контроля (3-месячные крысы), при p<0,05 (t-критерий Стьюдента); * — достоверность отличий от группы контроля (24-месячные крысы), при p<0,05 (t-критерий Стьюдента).

Полученные данные свидетельствуют о том, что у старых крыс рефлекс формировался в 2 раза хуже, чем у молодых. При курсовом введении Мексидола показатель воспроизведения рефлекса повышался в 1,5 раза по сравнению с таковым у контрольных старых животных. Таким образом, у старых крыс-самцов линии Вистар в возрасте 24 мес наблюдается значительное ухудшение процессов обучения и снижение памяти, а Мексидол при курсовом применении статистически достоверно улучшает обучение и воспроизведение рефлекса и, таким образом, устраняет когнитивный дефицит, наблюдаемый при старении.

2. Влияние Мексидола на порог судорожной реакции у старых крыс-самцов линии Вистар

Исследование проводили на крысах в возрасте 24 мес. ПТЗ вводили в малой дозе, которая вызывает клонические подергивания, но не приступ клонических судорог с рефлексом переворачивания. В контрольной группе животных судорожные подергивания возникали в среднем через 18 с у 83% животных (табл. 2). После курсового введения Мексидола судорожные подергивания возникали в среднем через 54,3 с и только у 16% крыс (см. табл. 2).

Примечание. * — достоверность отличий от группы контроля при p<0,05 (t-критерий Стьюдента); ^# — достоверность отличий от группы контроля при p<0,05 (критерий Фишера).

Полученные данные свидетельствуют о способности Мексидола повышать сниженный у старых животных порог судорожной реакции. Разница в показателях между контрольной группой старых животных и группой старых животных, получавших Мексидол, составила 67%.

3. Влияние Мексидола на неврологический дефицит, наблюдаемый при старении у крыс-самцов линии Вистар

Показано, что у контрольных старых крыс 20-месячного возраста нарушаются координация движений в тесте вращающегося стержня и выполнение подтягивания в тесте подтягивания на перекладину. Только 6 (40%) из 15 крыс удерживались на вращающемся стержне и только 2 (13,3%) из 15 крыс выполняли тест подтягивания (табл. 3).

Примечание. Здесь и в табл. 4,5: * — достоверность отличий от группы контроля, при p<0,05 (критерий Фишера).

Мексидол восстанавливал нарушенный при старении неврологический дефицит, статистически достоверно повышая процент крыс, удерживающихся на вращающемся стержне до 75%, что в 1,9 раз выше, чем в контроле, и увеличивая до 37% число крыс, подтягивающих задние лапы на перекладину (37%, что в 2,8 раза выше, чем в контроле (см. табл. 3).

Таким образом, Мексидол при курсовом применении у старых 20-месячных крыс линии Вистар с моторным дефицитом уменьшает степень его выраженности, улучшает выполнение моторных функций, мышечный тонус и координацию движений.

4. Влияние Мексидола на массу крыс-самцов линии Вистар в процессе старения

Регистрацию массы тела проводили у крыс в возрасте 3, 18 и 24 мес. Средняя масса тела особи в возрасте 3 мес составила 168±10,7 г. Регистрация массы тела в возрасте 18 мес перед началом курсового введения Мексидола не выявила различий между группой крыс контроля и группой крыс, которым в дальнейшем вводили Мексидол (табл. 4). В контрольной группе животных с возрастом наблюдали дальнейшее увеличение массы тела крыс, которая к 24-месячному возрасту достигла 630,7±15,8 г, т.е. увеличилась на 80 г (18%).

Мексидол применяли в питьевой воде (в дозе 40—75 мг/кг/сут) у крыс в возрасте 18—20 мес и 22—24 мес (2 курса). На фоне применения Мексидола масса тела крыс 24-месячного возраста увеличилась незначительно — на 23,2 г (4,2%) (см. табл. 4). Таким образом, применение Мексидола позволяет предотвратить существенное увеличение массы тела при старении.

5. Влияние Мексидола на продолжительность жизни крыс-самцов линии Вистар

Регистрацию гибели/выживаемости проводили у крыс в возрасте 8, 12, 16, 18, 20, 22, 24 и 26 мес. Установлено, что в контрольной группе животных в возрасте 18 мес погибли 15% крыс, в возрасте 20 мес — 25%, в возрасте 22 мес — 50%, в возрасте 24 мес — 70% и в возрасте 26 мес — 90% (табл. 5). Полученные данные о продолжительности жизни крыс линии Вистар соответствуют данным литературы — до 24 мес [20].

Потребление крысами Мексидола вызывало существенное увеличение продолжительности жизни живот- ных по сравнению с контролем (см. табл. 5). Установлено, что в возрасте 20 мес в группе крыс, получавших Мексидол, осталось в живых 80% (в контроле — 75%), в возрасте 22 мес — 75% (в контроле — 50%), в возрасте 24 мес — 60% (в контроле — 30%) и в возрасте 26 мес — 50% (в контроле — 10%) (см. табл. 5).

В контрольной группе показатель выживаемости 50% (средняя продолжительность жизни) составляет 22 мес, а в группе крыс, получавших Мексидол, показатель выживаемости 50% крыс составляет 26 мес, следовательно, средняя продолжительность жизни была увеличена на 4 мес (18,2%).

Количество животных с максимальной продолжительностью жизни в группе Мексидола было на 40% выше, чем в контрольной группе: в возрасте 26 мес в контроле остались в живых только 10% крыс, а после применения Мексидола — 50%.

Таким образом, Мексидол при длительном применении повторными курсами внутрь существенно увеличивает продолжительность жизни крыс-самцов линии Вистар.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют том, что Мексидол при длительном применении повторными курсами (2 курса по 2 месяца) восстанавливает когнитивный и моторный дефицит, возникающий у крыс-самцов линии Вистар при старении, повышает порог судорожной реакции и увеличивает продолжительность жизни. Наряду с этим Мексидол не влияет на массу животных и не способствует ожирению, которое нередко наблюдается при старении. Таким образом, продлевая жизнь животных, Мексидол помогает одновременно предотвратить существенное увеличение массы. Мексидол при курсовом введении статистически достоверно улучшает показатели обучения, сохранения и воспроизведения памятного следа и устраняет когнитивный дефицит, наблюдаемый при старении, а также улучшает выполнение моторных функций, мышечный тонус и координацию движений, нарушенные при старении.

При применении Мексидола возрастает средняя продолжительность жизни, а количество животных с максимальной продолжительностью жизни в группе Мексидола было на 40% больше, чем в контрольной группе.

Современная концепция старения рассматривает окислительный стресс с образованием АФК и митохондриальную дисфункцию как основные причины последующей гибели клетки. Возрастные нарушения дыхания митохондрий и высокая частота мутаций в мтДНК выявляются не только при старении, но и у лиц с нейродегенеративными заболеваниями [21, 22].

Согласно В.П. Скулачеву, старение рассматривается как «медленный феноптоз, который запускается с помощью внутримитохондриальных активных форм кислорода», и «если построить кривые зависимости продолжительности жизни организма от количества свободных радикалов в митохондриях, то выясняется определенная закономерность: чем больше в клетке свободных радикалов, тем меньше мы живем» [6]. Прорывом в области увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества явилось бы «…создание антиоксиданта особого свойства, направленно диффундирующего в митохондрии» [2].

Близкими к идеальным компонентам механизмом действия для замедления старения и спектром фармакологических эффектов обладает Мексидол, антиоксидантные, антигипоксантные и мембранотропные эффекты которого давно известны и хорошо изучены [11—15, 23].

В исследованиях Л.Д. Лукьяновой и соавт. установлено, что антигипоксантные свойства Мексидола связаны с окислением янтарной кислоты в дыхательной цепи митохондрий [14, 23]. Под влиянием Мексидола наблюдается активация сукцинатоксидазного окисления, процесса обратного переноса электронов, характерного для окисления янтарной кислоты, сопутствующего восстановлению пиридиннуклеотидов и флавопротеидов. Установлено, что Мексидол увеличивает мембранный потенциал митохондрий и содержание аденозинтрифосфата (АТФ), а при патологии уменьшает потери АТФ в ишемизированных мозге и миокарде, нормализует процесс окислительного фосфорилирования и, таким образом, восстанавливает энергозависимые функции.

Недавно получены данные о способности Мексидола индуцировать церебральный митохондриогенез и устранять митохондриальную дисфункцию не только у молодых, но и у стареющих животных [24]. Показано, что курсовое введение Мексидола в дозах 40 и 100 мг/кг сопровождается дозозависимой индукцией сукцинатного рецептора SUCNR1 и белков-маркеров биогенеза митохондрий: транскрипционного ко-активатора PGC-1α, транскрипционных факторов (NRF1, TFAM), каталитических субъединиц дыхательных ферментов (NDUFV2,SDHA, cyt b, COX2) и АТФ-синтазы (ATP5A) в коре головного мозга аутбредных крыс-самцов молодого и стареющего возраста.

Уникальные эффекты Мексидола при старении определяются его химическим строением, в котором сочетается 2 структуры: 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин и сукцинат, каждая из которых оказывает влияние на ключевые патогенетические звенья процесса старения. Основными эффектами 3-оксипиридина являются антиоксидантное и мембранопротекторное действие, а сукцинат влияет на процессы митохондриальной дисфункции.

Таким образом, Мексидол, обладающий антиоксидантным действием и способностью восстанавливать митохондриальную функцию, оказывает влияние на ключевые, базисные процессы, участвующие в повреждающем действии на клеточные структуры при старении, увеличивая тем самым продолжительность жизни и повышая ее качество.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

The author declare no conflicts of interest.