Разработка новых стратегий лечения тревожно-депрессивных расстройств является важным направлением исследований в области физиологии и медицины. Определенного внимания в этом отношении заслуживает феномен «кондиционирования».

Кондиционирование — это предъявление повреждающих факторов умеренной интенсивности, которое повышает устойчивость организма к повреждающим воздействиям высокой интенсивности, поскольку мобилизует эндогенные защитные механизмы [1]. Установлено, что кондиционирующие эффекты проявляются при действии краткой ишемии, гипоксии, гипо- и гипертермии, низких доз токсинов и более 50 других влияний [1—3]. Недавно было обнаружено, что в моделях на животных гипоксическое пре- и посткондиционирование предотвращает формирование тревожно-депрессивных расстройств, в том числе экспериментальной депрессии [4, 5].

Механизмы кондиционирования ишемическими и гипоксическими эпизодами во многом сходны. Нейропротективный эффект ишемического прекондиционирования открыт еще в 1990 г. [6], ишемическое посткондиционирование мозга описано в литературе в 2005 г. [7], но, несмотря на большое число экспериментальных работ, в клинической практике классическое ишемическое кондиционирование мозга неприменимо, поскольку предполагает инвазивную окклюзию сосуда. Наиболее перспективным и удобным с практической точки зрения является неинвазивное дистантное ишемическое кондиционирование путем создания транзиторной ишемии одной из конечностей. Эта простая методика используется для снижения операционного стресса и уменьшения повреждения мозга, улучшения неврологических функций при терапии заболеваний ишемического или воспалительного генеза, сосудистых когнитивных нарушениях, обладает нейропротективными свойствами, а также улучшает моторное обучение и др. [8—11]. Для дистантного ишемического прекондиционирования, как и для других типов прекондиционирующих воздействий, описаны «окна защиты» — раннее (до 2—3 ч), связанное с быстроиндуцируемыми внутриклеточными перестройками, и позднее, которое появляется через 12—24 ч после кондиционирования и длится до 72 ч, связанное с отсроченными механизмами развития толерантности [10—12]. Нами было обнаружено [13, 14], что дистантная ишемия конечности обладает выраженным анксиолитическим эффектом и способна эффективно предотвращать формирование постстрессорной тревожной патологии в модели посттравматического стрессового расстройства. Неинвазивная транзиторная ишемия в этой модели способствовала нормализации уровня тревожности и физиологической реактивности экспериментальных животных, а также нивелировала нейроэндокринные нарушения. На основании этих данных было сделано предположение о возможности использования дистантного ишемического кондиционирования для увеличения толерантности мозга к повреждающему действию стресса. Проверка этого предположения представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как может способствовать разработке и внедрению принципиально нового простого немедикаментозного способа профилактики и лечения постстрессорной патологии.

Цель работы — выявление и оценка антидепрессивных свойств краткосрочной прерывистой ишемии конечности и возможности ее применения для предотвращения и коррекции поведенческих и эндокринных нарушений у крыс в парадигме «выученной беспомощности» — экспериментальной модели депрессии.

Исследование выполнено на 138 взрослых самцах крыс линии Вистар массой около 200 г из «Коллекции лабораторных млекопитающих разной таксономической принадлежности», содержавшихся в стандартных условиях. При проведении экспериментов соблюдались требования Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях.

Крыс разделили на контрольную и четыре экспериментальные группы: «Контроль» — интактные животные; группа дистантного кондиционирования «Дист. конд.» — крысы, перенесшие 3 сеанса краткой ишемии/реперфузии конечности; группа «выученной беспомощности» (ВБ) — группа животных, подвергнутых аверзивному стрессированию, у которых формируется депрессивноподобное состояние «выученной беспомощности»; группа «дп-ВБ» — животные, которым проводили трехкратную ишемию конечности в режиме прекондиционирования перед стрессированием в парадигме «выученной беспомощности»; группа «ВБ-дп» — крысы, которым дистантное ишемическое посткондиционирование предъявлялось после стресса в модели депрессии. Экспериментальные группы разделяли на подгруппы по 6 животных в каждой, тестирование проводили с 1-х по 11-е сутки после последнего воздействия, схема представлена в таблице.

Состояние «выученной беспомощности» по современным представлениям адекватно отражает тревожно-депрессивный синдром, воспроизводя основные признаки эндогенной депрессии человека, включая выраженность аффектов беспомощности и безнадежности и характерные эндокринные нарушения [5, 15]. Для выработки ВБ крысы подвергались неконтролируемому неизбегаемому аверсивному стрессу (электрокожному раздражению). Животных стимулировали электрическим током (1 мА, 1 Гц, 15 с) в замкнутом пространстве клетки размером 13×16×26 см с токопроводящим полом с использованием интервала разной длительности между подачей тока на пол камеры так, чтобы каждая крыса в течение 1 ч получила по 60 стимуляций, что приводило к развитию у них стойкого депрессивноподобного состояния.

Ишемию конечности с целью избежать использования фармакологических препаратов проводили на бодрствующих лабораторных животных, помещенных в индивидуальные пеналы. Ишемизацию осуществляли 5-минутным сдавливанием бедренной артерии за счет пережатия задней конечности на уровне верхней трети бедра с помощью нейлоновых жгутов. Дистантное кондиционирование включало три таких 5-минутных ишемических эпизода, чередующихся с 15-минутными реперфузионными перерывами. Группа «Дист. конд.», помимо трехкратной ишемии/реперфузии конечности, не подвергалась дополнительным воздействиям. Животным группы «дп-ВБ» ишемизацию конечности осуществляли в режиме прекондиционирования перед стрессированием в парадигме ВБ, последний сеанс за 15 мин до начала электростимуляции, попадая тем самым в «раннее окно защиты». Крысы из группы «ВБ-дп» подвергались действию дистантного ишемического посткондиционирования, в этом случае первый из трех ишемических эпизодов следовал через 15 мин после окончания электростимуляции.

Тест в ОП — классический метод оценки уровня локомоторной активности и ориентировочно-исследовательского поведения [16] — проводили в камере 90×90×45 см без крыши, пол в которой был расчерчен на квадраты 15×15 см и освещен сверху лампочкой 60 Вт. Из каждой группы 6 животных тестировали дважды: в начальный (1 сут) и отсроченный (10 сут) периоды после экспериментальных воздействий (см. таблицу). Еще по 1 подгруппе из каждой группы тестировали в ОП на 5-й день. Крысу помещали в центр ОП и в течение 5 мин регистрировали латентный период до начала движения, количество пересеченных периферических, средних и центральных квадратов, продолжительность стоек, длительность груминга и иммобилизации.

Тестирование в ПКЛ позволяет охарактеризовать поведение грызунов в условиях переменной стрессогенности, что дает возможность оценить уровень тревожности животных [17]. На 11-е сутки после экспериментального воздействия отбирали по 6 крыс из каждой группы и по 1 тестировали в течение 5 мин в установке ПКЛ, расположенной на высоте 75 см над полом и состоящей из 2 открытых освещенных и 2 закрытых рукавов с выходами. Оценивали время, проведенное животным внутри и вне закрытых рукавов (в открытых рукавах и в центре), число переходов между рукавами, выраженность и динамику поведения «выглядывания».

Плавательные ТП [18] относятся к стандартным тестам для выявления антидепрессантных и анксиолитических свойств веществ и воздействий путем оценки двигательной активности крыс, помещенных в стеклянный цилиндр диаметром 30 см и высотой 90 см, на 2/3 заполненный водой с температурой 26±1 °С. Для тестирования выбирали по одной подгруппе крыс (n=6) из каждой группы, и на 4-е сутки после последнего экспериментального воздействия по одному животному помещали в цилиндр на 15 мин, регистрируя время активного и пассивного плавания и длительность иммобилизации в течение первых 5 мин. На следующий день (см. таблицу) животных вновь помещали в воду на 5 мин, оценивая двигательную активность по сравнению с начальной, выявляя «поведение отчаяния».

В течение 10 дней после стрессирования проводили мониторинг состояния конечного звена гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС), которое оценивали на основании определения содержания основного глюкокортикоидного гормона крыс — кортикостерона — в плазме крови. Базальный уровень кортикостерона определяли у животных подгрупп 4, 12, 17 и 22 в плазме крови, полученной из хвостовой вены через 1, 5 и 10 дней после стрессирования (см. таблицу). Содержание кортикостерона определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с набором реагентов «Кортикостерон-ИФА» («Хема», РФ) в двух параллельных пробах.

Оценку стрессорного выброса глюкокортикоидных гормонов (кортикостерона — аналога кортизола у человека) и его подавление введением синтетического глюкокортикостероида проводили на 4—5-е сутки после выработки ВБ в 2-дневном дексаметазоновом тесте по схеме, учитывающей особенности циркадной ритмики функции ГАС у крыс [19]. В 1-й день теста в 10:00 подгруппам животных из групп «Контроль», «ВБ», «дп-ВБ» и «ВБ-дп» внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, затем в 16:00 того же дня отбирали образцы периферической крови для определения базального уровня гормона, чем вызывали стресс, и через 30 мин после взятия крысы из клетки и получения начального образца, повторно брали кровь (стрессорный уровень). Для изучения чувствительности ГАС к сигналам обратной связи на следующий день в 10:00 крысам вводили дексаметазон (10 мкг/кг, внутрибрюшинно), и вышеописанную процедуру взятия крови из хвостовой вены повторяли через 6 и 6,5 ч. Уровни кортикостерона определяли иммуноферментным анализом (ИФА) наборами «Хема».

Экспериментальные данные обрабатывали, вычисляя среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку среднего в исследуемых подгруппах животных, n=6 для каждой точки. Статистическую обработку проводили средствами однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (Statistica 7.0) с апостериорным сравнением методом Фишера, если распределение выборки являлось нормальным, а дисперсии групп равны. В противном случае использовали непараметрический тест ANOVA Краскела—Уоллиса. Различия между группами считали достоверными при p≤0,05. На рис. 1 результаты

При сравнении методом ANOVA группы интактного контроля (см. рис. 1) с группой животных, подвергшихся воздействию трехкратной ишемии/реперфузии конечности без дополнительных экспериментальных воздействий, статистически значимых отличий выявлено не было ни по одному из исследованных показателей при тестировании в ПКЛ (F (7,4)=0,046, p=0,995), в ОП (F (7,4)=0,176, p=0,977; F (7,4)=0,24, p=0,951; F (7,4)=0,058, p=0,999) и тесте Порсолта (F (6,3)=0,6, p=0,637 и F (7,2)= 0,103, p=0,903). Уровень тревожности и локомоторной активности крыс после дистантного кондиционирования оставался близким к контрольному, что позволяет считать неинвазивную ишемию по выбранной схеме для бодрствующих животных фактором умеренной интенсивности, который пригоден для испытания в качестве кондиционирующего воздействия при психоэмоциональном стрессировании без значительных побочных эффектов на поведение животных.

Неизбегаемый неконтролируемый стресс в парадигме ВБ приводил к развитию у крыс устойчивого депрессивноподобного состояния, что подтверждалось результатами трехкратного тестирования в О.П. Состояние «выученной беспомощности» сопровождалось характерными нарушениями ориентировочно-исследовательского поведения и снижением уровня локомоторной активности (см. рис. 1), устойчивыми и выраженными до 10 дней после стресса (F (7,4)=8,903, p=0,026). Дистантное ишемическое прекондиционирование предотвращало развитие постстрессового состояния, аналогичного психомоторной заторможенности при депрессии. Животные группы дп-ВБ достоверно не отличались от контрольных центральной и общей горизонтальной и вертикальной двигательной активностью, продолжительностью замираний и другими показателями на всех сроках тестирования (F (7,4)=0,561, p=0,763; F (7,4)=0,109, p=0,993; F (7,4)=0,256, p=0,944). Три сеанса дистантной ишемии в режиме посткондиционирования оказывали менее выраженное антидепрессивное влияние на поведение стрессированных животных по сравнению с прекондиционированием. Менее значительный корректирующий эффект в группе ВБ-дп выражался, в частности, в улучшении показателей по неподвижности лишь в отсроченный (5—10 сут), но не в ранний постстрессорный период.

Патологическое состояние крыс группы ВБ на 4-е сутки после рандомизированной электростимуляции проявлялось тенденцией к увеличению тревожности по некоторым регистрируемым в ПКЛ показателям. Дистантная ишемия конечности в режиме пре- либо посткондиционирования демонстрировала выраженный анксиолитический эффект — количество и продолжительность выглядываний из закрытых рукавов ПКЛ вдвое превышали таковые не только у ВБ-крыс (F (4,26)=8,905, p=0,0001), но и у контрольных животных, также значимо снижалась общая длительность пребывания кондиционированных животных в темных рукавах лабиринта (рис. 2, а).

ВБ-животные, у которых сформировался аналог депрессии, в 1-й день «вынужденного плавания» в ТП проводили на 40% меньше времени, активно плавая и пытаясь выбраться из цилиндра (р=0,0038), и в 9,7 раз больше времени, не двигаясь (р=8,4·10^–9), по сравнению с группой контроля (см. рис. 2, б и в: 1-й день). Одновременно с этим продолжительность иммобилизации и плавательная активность кондиционированных животных из групп дп-ВБ и ВБ-дп примерно соответствовали контрольному уровню (F (4,22)=1,237, p=0,326).

На 2-й день тестирования в ТП крысы группы ВБ демонстрировали «поведение отчаяния», что выражалось в практическом отсутствии попыток выбраться, а также возрастании продолжительности периодов неподвижности по сравнению с первым днем тестирования. Эффективная коррекция дистантным прекондиционированием депрессивноподобного поведения стрессированных животных в ТП заключалась в нивелировании снижения локомоции в этом тесте и значительном сокращении времени неподвижности у крыс дп-ВБ по сравнению с ВБ (см. рис. 2, б и в: 2-й день). Ишемическое посткондиционирование оказалось недостаточно эффективным для предупреждения проявления у крыс группы ВБ-дп «поведения отчаяния» на втором этапе ТП.

Развитие модели депрессии в группе ВБ сопровождалось выраженным и устойчивым повышением содержания кортикостерона в плазме крови экспериментальных животных в течение 10 дней после неизбегаемого стресса (рис. 3, а),

ДМТ выявил у ВБ-крыс значительное нарушение регуляции гипофизарно-адреналовой системы по глюкокортикоидной отрицательной обратной связи. Инъекция таким животным дексаметазона практически не снижала ни базальный, ни стрессорный уровни сывороточного кортикостерона (см. рис. 3, в) по сравнению с примерно 55—70% подавлением у контрольных крыс (см. рис. 3, б). Было обнаружено, что ишемическое прекондиционирование значительно улучшает показатели ДМТ у стрессированных животных, нормализуя торможение ГАС (см. рис. 3, г). Дистантное посткондиционирование оказывало менее выраженное влияние на величину подавления стрессорного уровня гормона экзогенным стероидом, Δ в группе ВБ-дп оказалась вдвое ниже, чем в контрольной, но вместе с тем более чем 9-кратно превышала таковую в группе ВБ (см. рис. 3, е).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что такое простое, недорогое, неинвазивное и легко контролируемое по интенсивности воздействие, как дистантное ишемическое пре- и посткондиционирование конечности, обладает выраженным антидепрессивным действием у особей, переживших неизбегаемый аверзивный стресс, и может представляться перспективным немедикаментозным способом защиты мозга. Показано, что интервальная ишемия оказывала значительное нормализующее влияние на поведенческие и гормональные показатели, предотвращая формирование экспериментальной депрессивной патологии. Интересно отметить, что проведенное ранее исследование по коррекции экспериментальной депрессии в данной модели антидепрессантом людиомилом [4] выявило ряд побочных эффектов этого препарата, таких как резкое снижение груминга в ОП, а также снижение содержания кортикостерона в крови ниже контрольного уровня. Таким образом, обнаруженное в данной работе выраженное антидепрессивное влияние дистантного кондиционирования на поведение и функцию ГАС оказывается не сопряжено с побочными действиями, характерными для современных тетрациклических антидепрессантов. Обращает на себя внимание также выраженный анксиолитический эффект дистантной ишемии, ярко проявляющийся при тестировании в ПКЛ, что согласуется с обнаруженной недавно эффективностью трехкратной ишемизации конечности для предотвращения формирования тревожной постстрессорной патологии в модели посттравматического стрессового расстройства [13].

Транзиторная ишемия конечности продемонстрировала протективный эффект в обоих исследованных режимах (пре- и посткондиционирование), но по различному влиянию на некоторые показатели можно заключить, что три сеанса ишемии в режиме «лечения» оказывали менее выраженное антидепрессивное влияние по сравнению с сеансами в режиме «профилактики» перед неконтролируемым стрессом. Различия могут быть связаны со спецификой эндокринных нарушений при эндогенной депрессии, воспроизводимой в парадигме ВБ, основным из которых является гиперактивация ГАС, вызываемая нарушениями в регуляции выброса глюкокортикоидов по принципу отрицательной обратной связи [20]. Как показали гормональные тесты, ишемические воздействия в режимах пре- и посткондиционирования одинаково эффективно подавляют патологический рост базальной активности периферического звена гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы после сильного неизбегаемого стресса. Но с патологической гиперреактивностью этой системы на повторное стрессирование более успешно справляется прекондиционирующая ишемия, в то время как посткондиционирование, очевидно, не способно полностью нормализовать петлю так называемой быстрой обратной связи. Подтверждением повышенной стресс-реактивности посткондиционированных животных может служить ТП, на втором, но не на первом, этапе которого крысы группы ВБ-дп продемонстрировали депрессивноподобное поведение, вероятно, как патологическую реакцию на стресс длительного принудительного плавания в 1-й день.

Трехкратная ишемия/реперфузия конечности в течение 1 ч перед патогенным стрессом укладывается в «первое терапевтическое окно», за время которого прекондиционирование может запускать универсальные эндогенные адаптационные механизмы, в том числе гормональные [10—12], вероятно, предотвращая тем самым формирование патологической стресс-гиперреактивности особи, чего не происходит в случае применения ишемических эпизодов после стресса, когда требуется коррекция уже запущенных патогенетических процессов.

В рамках дальнейших исследований необходимо прояснить, за счет каких механизмов реализуется обнаруженный стресс-протективный эффект дистантного ишемического кондиционирования. Прежде всего интересно продолжить анализ модификаций функций ГАС, поскольку она играет ключевую роль в организации стрессорного ответа, а именно, оценить ее центральную нейрогормональную активность и тормозную рецепторную составляющую, нормализация которых является одним из ключевых механизмов адаптогенного действия другого вида кондиционирования — гипоксического [2, 5, 21]. На основании определенной универсальности некоторых нейрональных адаптивных механизмов можно предположить, что стресс-протективные эффекты ишемии/реперфузии конечности также могут быть опосредованы следующим: поддержанием оптимального уровня активности факторов CREB и NF-κB, активация которых в условиях тяжелого стресса недостаточна; стимуляцией экспрессии нейротрофинов; нивелированием отсроченной стресс-индуцированной экспрессии c-Fos и HIF-1, как это показано в случае кондиционирования умеренной гипоксией [22—25]. Таким образом, проведение дальнейших исследований молекулярно-клеточных механизмов реализации в мозге адаптивных эффектов дистантного ишемического кондиционирования позволит расширить спектр клинического применения этой простой и эффективной методики.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что дистантное ишемическое пре- и посткондиционирование конечности повышает стресс-резистентность, обладает выраженным антидепрессивным действием и демонстрирует высокую эффективность в отношении предотвращения и коррекции постстрессорных депрессивных эпизодов, предупреждая основные поведенческие и эндокринные нарушения. Эти данные в сочетании с отсутствием побочных эффектов позволяют предположить возможность использования ишемии конечности в качестве эффективного, малозатратного и удобного немедикаментозного способа профилактики и лечения депрессивных расстройств, имеющего потенциальное терапевтическое значение.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 16−34−60095 мол_а_дк.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Сведения об авторах:

Баранова Ксения Александровна — e-mail: ksentippa@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2746-2040

Зенько Михаил Юрьевич — e-mail: zenkomichail@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9868-0598

Как цитировать:

Баранова К.А., Зенько М.Ю. Использование дистантного ишемического пре- и посткондиционирования для коррекции проявлений экспериментальной депрессии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(6):-80. https://doi.org/10.17116/jnevro2019119061

Автор, ответственный за переписку: Баранова Ксения Александровна — e-mail: ksentippa@mail.ru