За последние несколько лет в области генетики шизофрении были получены значимые и воспроизводимые результаты, касающиеся обнаружения новых локусов, связанных с риском этого заболевания [1]. Следующий этап исследований в этом направлении должен быть направлен на изучение обнаруженных вариантов на функциональном уровне (оценка профилей экспрессии генов, протеомный анализ).

Основным биологическим субстратом для исследований психических заболеваний является головной мозг человека, что предполагает использование образцов аутопсийного мозга. Поэтому для проведения функциональных генетических исследований актуальным является вопрос о выборе адекватной модели. Поскольку психические заболевания являются уникальным фенотипом для человека как биологического вида, практически отсутствуют полностью адекватные модели таких болезней с использованием животных. У человека для моделирования нейрохимических процессов используют клетки крови, в частности тромбоциты, которые служат моделью нейронов серотонинергических, и лимфоциты — дофаминергических. В последнее время большие надежды возлагаются на использование клеточных моделей, преимуществами которых являются получение у пациента достаточного количества материала и возможность исследования большого числа образцов. Для создания таких моделей используют дермальные фибробласты [2], эмбриональные или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) [3], сделаны попытки использования волосяных фолликул, которые формируются из того же источника, что и нервная ткань, — клеток эктодермы [4]. В настоящей работе обсуждается возможность использования клеточной модели, полученной на основе обонятельного эпителия (ОЭ) человека.

ОЭ представляет собой нейрональную, доступную для получения ткань, сходную с нейроэпителием нервной трубки, из которой формируется головной мозг эмбриона человека. Его отличительная черта — наличие клеток, способных к регенерации. В этой ткани происходит постоянное обновление мультипотентных клеток с образованием зрелых нейронов. Поэтому для получения модели для исследования стволовые клетки ОЭ можно культивировать in vitro для дифференцировки их в различные типы нервных клеток, включая нейроны и глию. Преимущество модели заключается в том, что нейрональные стволовые клетки и клетки мозга имеют общее эмбриональное происхождение и являются единственным материалом такого рода, доступным для изучения ex vivo у взрослого человека. Благодаря этой особенности ОЭ часто называют «окном в мозг» [5]. Поскольку он сохраняет регенеративный потенциал, процесс культивирования не является таким сложным, как при получении нервных клеток из iPSC [6]. Использование первичных клеточных культур стволовых нервных клеток ОЭ может служить платформой для дальнейших фундаментальных и предклинических исследований психических заболеваний.

ОЭ и подлежащая собственная пластинка слизистой оболочки (lamina propria) расположены в дорсальной части носовой полости. ОЭ содержит несколько типов клеток, в том числе рецепторы обонятельных нейронов, базальные и поддерживающие клетки. Аксоны рецепторов проецируются в обонятельную луковицу посредством обонятельного нерва. Зрелые и незрелые нейроны расположены в промежуточном слое ОЭ, они непрерывно замещаются в процессе нейрогенеза на протяжении всей взрослой жизни. Важно, что этот процесс регулируется теми же ростовыми факторами (эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов), которые осуществляют контроль нейрогенеза в ЦНС. Способность О.Э. к нейрогенезу и регенерации сохраняется за счет нейрокомпетентных стволовых клеток и клеток-предшественников (прогениторы) [7].

Клеточные модели на основе клеток ОЭ можно разделить на два типа [8].

Первый тип модели предусматривает использование обонятельных нейросфер и производных от них клеток. Обонятельные нейросферы — клетки сферической формы, формирующиеся из стволовых клеток и прогениторов в культурах О.Э. Они мультипотентны, способны к самовоспроизведению и могут быть дифференцированы в нейроны и глию.

Наибольшее распространение для получения нейросфер из назальной биопсии получили приемы, описанные в работах коллектива исследователей из Австралии [9—11]. Согласно этим работам, образцы биоптата отбирают в специальную среду, отделяют эпителий от собственной пластинки и культивируют в течение 2—3 нед, после чего пересаживают в среду для формирования нейросфер, которое может продолжаться в течение 1 мес. Использование модели позволило получить ряд интересных результатов. Так, N. Matigian и соавт. [9] изучали профиль экспрессии с помощью биочипов у 9 больных шизофренией и 14 психически здоровых и обнаружили у больных нарушения регуляции генов, связанных с развитием головного мозга. Нарушения были выявлены в биохимических путях, которые могут быть связаны с патогенезом шизофрении (сигнальные каскады рилина, эпидермального фактора роста (ErbB), интерлейкина-8, активация рецепторов витамина D и ретиноидного X-рецептора, метаболизм глютатиона). Позднее на тех же выборках больных и здоровых было проведено исследование [12] с использованием протеомного подхода, которое показало снижение уровня синтеза некоторых белков у больных, что в наибольшей степени отмечалось для киназы eIF2/4 и ферментов сигнального каскада mTOR (мишень рапамицина). Оба фермента играют важную роль в регуляции клеточного цикла. У больных шизофренией было также отмечено снижение активности 17 рибосомальных белков, что указывало на уменьшение скорости белкового синтеза. Еще одно исследование [10], проведенное на клеточных линиях нейросфер, показало у больных нарушение динамики клеточного цикла (ускорение пролиферации клеток, сокращение времени вхождения в клеточный цикл и его фаз). Эти изменения были связаны с повышением экспрессии белков из семейства циклинов (D1 (CCND1), E (CCNE) A2 (CCNA2)). Дальнейшее изучение выявило изменения в биохимическом пути с участием киназы фокальной адгезии (FAK), играющей важную регуляторную роль в формировании актиновых стресс-волокон и миграции нейронов при развитии мозга [11]. В целом полученные результаты указывают на то, что при шизофрении имеют место изменения регуляции биохимических путей, оказывающие негативное влияние на ранних этапах развития мозга.

В модели второго типа используются другие клетки О.Э. При ее создании дифференцирование в культуре клеток ОЭ в нейросферы не предусмотрено, вместо этого используют клетки, полученные путем нескольких пересадок на соответствующей среде, или при микроскопии с помощью лазера вырезают обогащенный нейронами слой из замороженных клеток ОЭ [13, 14]. Для реализации этой модели был предложен и более простой метод получения клеток ОЭ путем соскоба из носовой полости с помощью специальных щеток [15]. E. Mor и соавт. [13] наблюдали повышенную экспрессию микро-РНК miR-382 в клетках биоптатов, полученных путем нескольких пересаживаний у 7 больных шизофренией по сравнению с 7 здоровыми людьми с последующим подтверждением этого результата в образцах, полученных с помощью указанной выше лазерной микродиссекции. Известно, что miR-382 регулирует экспрессию генов FGFR1 и SPRY4, связанных с сигнальным путем фактора роста фибробластов, и нарушение ее функционирования может быть причиной характерных для шизофрении аномалий развития мозга. Изучение экспрессии генов в образцах, полученных с использованием лазерной микродиссекции, позволило обнаружить связь генов, кодирующих белки семейства SMAD, с когнитивным дефицитом у больных шизофренией [16]. SMAD-белки являются внутриклеточными медиаторами в биохимических путях, связанных с костными морфогенетическими белками и трансформирующим ростовым фактором β, играя важную роль в регуляции раннего развития головного мозга. Также они оказывают влияние на образование олигодендроцитов, рост и регенерацию аксонов, дифференциацию, поддержание и защиту холинергических нейронов. В этих же образцах было обнаружено изменение уровня метилирования гистонов в нескольких группах генов, связанных с защитой организма от окислительного стресса [17]. H. Solis-Chagoyan [18] в клетках, полученных путем соскоба из носовой полости, сравнивали стабильность микротрубочек и проводимость кальциевых каналов в образцах ткани 4 больных шизофренией и 4 больных с биполярным аффективным расстройством. У больных шизофренией обнаружены нарушения в организации микротрубочек и снижение проводимости по долгоживущим (L-тип) каналам.

Полученные результаты подтверждают возможность использования ОЭ для исследования изменений в нейронах ЦНС как на транскрипционном, так и биохимическом, структурном и метаболическом уровнях для обнаружения нейрональных маркеров шизофрении.

Как следует из приведенного обзора литературы, в целом первые результаты исследований шизофрении с использованием клеточной модели на основе ОЭ появились около 10 лет назад. За это время было опубликовано немногим более 10 работ, при этом число выборок больных, на которых выполнялись исследования, насчитывает единицы, а сами выборки включают в себя небольшое число как больных шизофренией, так и психически здоровых. Можно отметить несколько причин, объясняющих сложившееся положение. Прежде всего, получение клеток ОЭ для дальнейшего их изучения до сих пор не может рассматриваться как рутинная процедура. Успешность отбора и последующего выращивания клеток варьирует от 10 до 90% [19]. Известно [20], что наибольшая концентрация клеток ОЭ обнаружена в верхней носовой раковине (superior turbinate), однако доступ к ней возможен либо при получении аутопсийного материала, либо во время операций в полости носа. В случае биопсии с использованием местной анестезии отбор материала проводят из передней и медиальной части средней носовой раковины [21]. Эффективность получения достаточного количества материала для исследования зависит не только от участка носовой полости, из которого проводят отбор, но и способа отбора. Имеет значение, например, выбор щипцов (считают, что предпочтительнее использовать режущие насквозь носовые щипцы по Blakesley, нежели режущие внакладку стандартные носовые щипцы по Blakesley. Второе важное условие — получение культур, содержащих достаточное количество жизнеспособных прогениторов. Оказалось, что его эффективность определяется не только условиями культивирования клеток, но и таким фактором, как наличие у доноров хронических риносинуситов или острых аллергических ринитов. Ранее было показано [22], что потеря обонятельных нейрональных клеток может быть следствием воспалительного синоназального процесса.

Следует отметить, что ни в одной из публикаций, посвященных поиску оптимальных путей получения нейрональных моделей на основе ОЭ, не уделено внимания процессу формирования выборок для исследования. В то же время очевидно, что получение согласия больных шизофренией на исследование и особенности работы с этим контингентом связаны с определенными трудностями. Процесс получения биопсийного материала включает в себя несколько этапов, которые должны быть выполнены в процессе координации работы нескольких групп специалистов: 1) психиатров, в задачу которых входит подбор больных шизофренией для исследования по разработанным критериям включения/исключения, разъяснение им целей исследования для подписания информированного согласия на участие, подготовка возможных участников (клиническое обследование, проведение предоперационных анализов); 2) отоларингологов, проводящих процедуру назальной биопсии с использованием современного эндоскопического оборудования; 3) биологов, осуществляющих культивирование первичных монослойных культур эксплантатов для образования нейросфер с последующим отбором и выращиванием для дифференциации их в нейроны. Работа каждой из групп специалистов, естественно, сопряжена с рядом проблем (низкий процент больных, давших согласие на участие в исследовании, отказ от участия при подписанном согласии, количество материала, отобранного из носовой полости, успешность дифференцировки нейросфер в нейроны). Тем не менее нам удалось получить собственный опыт работы в рассматриваемой области исследований в отношении осуществления назальной биопсии и отбора групп психически здоровых и больных шизофренией.

Выборку здоровых формировали из стационарных пациентов, обратившихся в Научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л.И. Свержевского по поводу операции в полости носа.

Отбор биологического материала в этих случаях из носовой полости проводили в условиях общей анестезии.

Формирование выборки включало в себя следующие этапы: 1) соответствие разработанным и описанным ранее критериям включения/исключения; 2) разъяснение лицам, соответствующим этим критериям, целей исследования для подписания информированного согласия на участие; 3) заполнение анкеты, содержащей пункты о наличии/отсутствии психических заболеваний, наследственной отягощенности по шизофрении и т. д.

На участие в исследовании согласились более 85% здоровых, которые соответствовали критериям включения/исключения. Незначительное число участников (1 человек из 40 согласившихся) отказывались от его продолжения (заполнение анкеты после операции). Формирование группы больных шизофренией было сопряжено с большими, чем при отборе здоровых, трудностями. Это было связано с необходимостью проведения биопсии под местной анестезией, для чего требовался оториноларингологический кабинет с соответствующим оборудованием. Желательно было, чтобы биопсию отбирали у стационарных пациентов для контроля их психического состояния и возможных осложнений после операции. Во избежание загрязнения дорогостоящего эндоскопического оборудования назальная биопсия должна была проводиться у больных при условии отсутствия у них опасных инфекций (ВИЧ, гепатит). Также необходим был предварительный анализ на свертываемость крови, информация о переносимости лидокаина и отсутствие в анамнезе хронических риносинуситов или аллергических ринитов, что влияет на эффективность получения нейросфер из первичных культур О.Э. Соблюдение всех перечисленных условий оказалось возможным при использовании в качестве базы для проведения исследования Московской городской психиатрической клинической больницы № 1 им. Н.А. Алексеева.

В процессе формирования этой группы лишь 10% больных соглашались выслушать информацию об исследовании, из них менее ½ подписывали информированное согласие на процедуру биопсии, при этом 20% от подписавших согласие отказались от участия в исследовании непосредственно перед проведением биопсии.

Биопсийный материал удалось получить у 44 больных шизофренией. При операции, во время которой применяли видеосъемку, не было обнаружено неадекватных реакций пациентов, связанных с их психическим состоянием. После проведения биопсии бредовые или истерические реакции были отмечены у 3 (6,8%) пациентов. Осложнения в виде небольшого кровотечения вследствие неосторожного обращения пациента с заживающим участком в месте отбора биопсии наблюдались у 3 (6,8%) пациентов.

Таким образом, мировые исследования и наш собственный опыт в области создания клеточной модели, полученной на основе обонятельного эпителия человека, показывают, что, несмотря на несомненные преимущества такой модели для поиска нейрональных маркеров шизофрении и высокую научную ценность уже полученных результатов, прогресс в этой области не соответствует ожидаемому уровню. Причины этого кроются в ограничениях, связанных с формированием групп участников, а также возникающих при создании модели методических трудностях, которые препятствуют широкому использованию ее в научных исследованиях.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: golimbet@mail.ru