Боковой амиотрофический склероз (БАС) относится к дегенеративным заболеваниям ЦНС и проявляется прогрессирующей мышечной слабостью, бульбарными и дыхательными нарушениями. Быстрая инвалидизация пациента в связи с развивающимися парезами, замедлением и изменением речи, затруднениями глотания, присоединением одышки, частое начало болезни в трудоспособном возрасте указывают на высокую медико-социальную значимость болезни.

Патогенетические механизмы развития БАС, несмотря на более чем 140-летнее изучение, недостаточно понятны. Клинический полиморфизм и разные варианты дебюта БАС нередко способствуют позднему выявлению болезни в развернутой стадии. Повышение уровня диагностики и поиск биологических маркеров, позволяющих выявить заболевание на ранних стадиях, являются важной составляющей медицинской помощи пациентам.

В развитии постепенной гибели моторных нейронов и прогрессировании дегенеративного процесса при БАС основными патогенетическими механизмами являются избыточная активация свободнорадикального окисления, сопровождаемая повреждением биологических мембран клеток и внутриклеточных фракций; эксайтотоксичность с нарушением системы обратного захвата глутамата и неконтролируемым поступлением ионов кальция в нейрон; дисфункция митохондрий, усиление апоптоза [1]. Есть данные [2, 3], указывающие на участие патологического агрегирования белков, нарушения аксонального транспорта, дефицита нейротрофических факторов и нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в патогенезе БАС. Кроме того, при БАС может отмечаться выход различных нейроспецифических энзимов и их изоферментов из поврежденных клеток нервной ткани в интерстициальное пространство и далее в биологические среды организма [4, 5].

Нейроспецифическая энолаза (НСЕ) является внутриклеточным гликолитическим ферментом, локализованным в центральных и периферических нейронах [6]. В настоящее время известно [7—9] об увеличении уровня НСЕ в нервной ткани и биологических жидкостях при цереброваскулярных заболеваниях, в результате черепно-мозговых травм, при эпилепсии, болезни Паркинсона.

Белок S100b синтезируется астроцитами в сером веществе мозга и олигодендроцитами в белом веществе. Он является кальцийсвязывающим белком, который обеспечивает внутриклеточную регуляцию передачи сигнала и поддерживает пластические процессы в ЦНС [10]. В настоящее время этот маркер рассматривается как показатель целостности ГЭБ [11].

Соответственно определение роли нейроспецифических белков в развитии нейродегенерации в сопоставлении с клинической картиной БАС (форма, длительность, темп прогрессирования) может оказаться полезным для диагностики, мониторинга и прогнозирования течения патологического процесса при БАС.

Цель исследования — определение концентрации НСЕ и белка S100b в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у пациентов с различными формами и длительностью БАС.

Обследовали 86 пациентов с установленным диагнозом БАС, которые были госпитализированы в неврологические отделения Республиканского научно-практического центра неврологии и нейрохирургии в период с 2012 по 2016 г. Исследование было проспективным открытым контролируемым.

В зависимости от первичного уровня поражения цереброспинальной оси пациенты были распределены на три группы с различными дебютами (формы) БАС [12]. Бульбарная форма БАС была диагностирована у 31 (36%) пациента, 12 мужчин и 19 женщин (средний возраст — 57,3±10,7 года); шейно-грудная — у 38 (44%) больных, 25 мужчин и 13 женщин (54,9±8,7 года); пояснично-крестцовая — у 17 (20%) обследованных, 11 мужчин и 6 женщин (57,2±9,9 года).

Все пациенты были разделены также на подгруппы в зависимости от длительности заболевания. Длительность менее 1 года отмечена у 44 (51%) пациентов (средний возраст 57,4±9,2 года), средняя продолжительность БАС — 7,8±2,1 мес. Длительность заболевания от 1 года до 4 лет отмечена у 42 (49%) пациентов (средний возраст 54,8±9,9 года), медиана продолжительности заболевания — 16 (14—24) мес.

Диагноз БАС основывался на анализе клинико-электронейромиографических данных по уточненным Эль-Эскориальским критериям [13, 14] с алгоритмом Awaji—Shima: наличие у пациента признаков сочетанного поражения центральных и периферических мотонейронов на трех уровнях из четырех возможных (ствол мозга, шейный, грудной и поясничный отделы спинного мозга) [15].

Оценку функционального состояния пациентов проводили по шкале нарушений функции при БАС (Amyotrophic lateral sclerosis functional rating scale revised — ALSFRSR) [16, 17]. У пациентов неврологический дефицит по шкале ALSFRSR варьировал от 24 до 48 баллов.

Образцы сыворотки крови для контрольной группы были взяты на исследование нейроспецифических белков у 17 неврологически здоровых добровольцев и 16 пациентов с радикулопатиями, 11 мужчин и 22 женщин (средний возраст — 51,7±10,7 года). Образцы ЦСЖ для контрольной группы были отобраны у 16 пациентов с радикулопатиями (средний возраст — 53,5±10,9 года). При сравнении возраста пациентов с БАС и лиц контрольной группы достоверной разницы не выявлено (р<0,05).

Забор крови производили из кубитальной вены натощак однократно на 1-й либо 2-й день после госпитализации. ЦСЖ получали путем люмбальной пункции. Концентрации НСЕ и белка S100b определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA тест-наборами фирмы DRG (США) на иммуноферментном анализаторе BioTek.

Для статистической обработки данных применяли программу Statistica 10.0. Результаты описывали в виде медианы (Ме) и интервала между 25-м и 75-м процентилями либо в виде средней арифметической (М) и стандартного отклонения (SD). Для сравнения двух независимых выборок использовали критерий Манна—Уитни. Корреляционную связь между двумя признаками анализировали с помощью критерия Спирмена с вычислением коэффициента корреляции. Пороговое значение уровня значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Средняя оценка по шкале ALSFRSR всех пациентов с БАС составила 40,3±3,9 балла.

Содержание НСЕ и белка S100b в сыворотке крови и ЦСЖ по сравнению с контролем представлено в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что концентрация НСЕ в ЦСЖ у обследованных пациентов с БАС составила 7,8 [6,5; 10,6] нг/мл и была статистически значимо выше, чем в контрольной группе (р=0,0003), что свидетельствует о выраженном нейрональном повреждении. Также отмечено повышение содержания белка S100b в ЦСЖ у пациентов с БАС (р=0,037) относительно контроля, что, указывает на вовлечение в патологический процесс астроцитов и шванновских клеток (где преимущественно содержится белок S100b). При исследовании концентрации изученных нейроспецифических белков в сыворотке крови пациентов не было установлено достоверной разницы по сравнению с данными контрольной группы. Повышение концентраций НСЕ и белка S100b в ЦСЖ, содержащихся в клетках ЦНС, свидетельствует о повреждении клеточных мембран с выходом нейроспецифических белков в межклеточную среду в результате гибели нервных клеток.

При корреляционном анализе в группе пациентов с БАС была установлена достоверная положительная связь между концентрациями в ЦСЖ белка S100b и НСЕ (r=0,51, р=0,0002), что подтверждает участие изученных нейроспецифических белков в течении нейродегенеративного процесса.

При бульбарной форме заболевание начиналось с замедления речи, нарушения глотания вследствие вовлечения в патологический процесс ядер каудальной группы черепных нервов ствола мозга, затем присоединялась мышечная слабость в конечностях и туловище. Средний балл по шкале ALSFRSR у этих пациентов на момент включения в исследование составил 40,3±3,9.

У пациентов с шейно-грудной формой заболевание начиналось с асимметричного вовлечения верхних конечностей, чаще неловкостью при выполнении тонких движений пальцами, похуданием кистей и фасцикуляциями, реже (у 12 (31,57%) больных) с вовлечения мышц плечевого пояса. Крампи предшествовали развитию мышечной слабости практически у всех пациентов. Средний балл по шкале ALSFRSR составил 40,1±3,9.

При пояснично-крестцовом дебюте первыми обычно вовлекались разгибатели стопы, что проявлялось «свисающей стопой» и походкой типа степпажа (пациент высоко поднимает ногу и выбрасывает ее вперед, резко опуская). В 5 случаях заболевание началось с вовлечения мышц тазового пояса. Средний балл по шкале ALSFRSR составил 39,9±4,0.

Содержание НСЕ и белка S100b в сыворотке крови и ЦСЖ у пациентов с различными формами БАС по сравнению с контролем представлено в табл. 2.

У пациентов с бульбарной формой БАС было установлено статистически значимое повышение концентрации НСЕ (р=0,015) и белка S100b (р=0,01) в ЦСЖ по сравнению с контролем. При шейно-грудной форме выявлены достоверное возрастание содержания НСЕ в ЦСЖ (р=0,00008) и тенденция к его повышению в сыворотке крови (р=0,06). У пациентов с пояснично-крестцовой формой показано увеличение уровня НСЕ в ЦСЖ (р=0,0006) по сравнению с данными контрольной группы.

Таким образом, при всех формах БАС выявлено достоверное повышение концентрации НСЕ в ЦСЖ, что можно расценивать как показатель выраженной нейродегенерации при данной патологии. Повышение содержания белка S100b в ЦСЖ в подгруппе пациентов с бульбарной формой заболевания, возможно, отражает более высокий уровень дебюта болезни, вовлечение ствола мозга и, как правило, более тяжелое и быстрое прогрессирование заболевания, сопряженное с избыточной активацией глиальных клеток в патологическом процессе.

При корреляционном анализе полученных результатов в группе пациентов с бульбарной формой была показана отрицательная достоверная связь между средним баллом по шкале ALSFRSR и белком S100b в ЦСЖ (r= –0,6, р=0,03), т. е. чем выше концентрация изученного нейроспецифического белка в ЦСЖ, тем более низкий балл, соответствующий меньшим функциональным возможностям организма, имеет пациент с бульбарной формой заболевания. Такая связь позволяет предположить высокую активность прогрессирования патологического дегенеративного процесса в ЦНС, в частности активацию астроцитов и шванновских клеток у пациентов с худшим клиническим состоянием. Также у пациентов с бульбарной формой заболевания была выявлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией НСЕ в ЦСЖ и белка S100b в сыворотке крови (r= –0,92, р=0,00002), что косвенно подтверждает зависимость изменений концентраций изученных нейронспецифических белков как в ЦСЖ, так и сыворотке крови.

При корреляционном анализе полученных результатов в группе пациентов с шейно-грудной формой заболевания показана положительная достоверная связь между концентрациями в ЦСЖ белка S100b и НСЕ (r=0,6, р=0,0007), что может указывать на связь изменений данных белков в ЦСЖ.

При пояснично-крестцовой форме заболевания корреляционных связей не обнаружено, что может быть обусловлено относительно меньшей плотностью кортикоспинальных трактов в поясничном и крестцовом отделах спинного мозга по сравнению с лежащими выше отделами.

Далее изучали нейронспецифические белки в ЦСЖ и сыворотке крови в зависимости от длительности заболевания: у пациентов с БАС, болеющих до 1 года, оценка по шкале ALSFRSR составила 39,9±4,5 балла, а у болеющих от 1 года до 4 лет — 40,3±3,1 балла.

Результаты, полученные у пациентов с различной длительностью заболевания по сравнению с контролем, представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что имеется значимое различие значений концентрации НСЕ и S100b в ЦСЖ у пациентов с длительностью заболевания менее 1 года и контролем (р=0,00003 и р=0,029 соответственно). При сравнении пациентов с длительностью заболевания от 1 года до 4 лет с группой контроля выявлено значимое повышение концентрации НСЕ в сыворотке крови (p=0,037) и ЦСЖ (p=0,0007), что указывает на выраженное нарушение нейрональной целостности с минимальным вовлечением астроцитов и шванновских клеток в патологический процесс у длительно болеющих БАС пациентов.

При нарушении проницаемости ГЭБ белок S100b из мозга попадает в кровь, приводя к повышению его сывороточного уровня [4].

При определении градиента концентрации белка S100b в ЦСЖ и S100b сыворотки крови (градиент S100b ЦСЖ/сыворотка) у пациентов с различной длительностью заболевания БАС было выявлено его достоверное (р=0,036) снижение у пациентов с длительностью заболевания менее 1 года от 7,7 [6,3; 10,5] до 6,1 [4,4; 7,9] у пациентов с длительностью заболевания от 1 года до 4 лет, что можно использовать для оценки нарушений проницаемости ГЭБ у пациентов через 1—4 года от начала болезни (см. рисунок).

При корреляционном анализе полученных результатов в группе пациентов с длительностью заболевания менее 1 года показана положительная достоверная связь между концентрациями белка S100b и НСЕ в ЦСЖ (r=0,62, р=0,0013).

Результаты многочисленных работ, посвященных исследованию диагностических и прогностических биомаркеров в крови и ЦСЖ у пациентов с БАС, неоднозначны. Р. Steinacker и соавт. [18] провели количественную оценку концентраций легких цепей нейрофиламентов (NF-L), белка S100b и програнулина (PGRN) и проанализировали их содержание в связи с прогрессированием БАС. Результаты показали, что на исходном уровне сывороточные концентрации NF-L, но не PGRN или S100b, значительно различались между группой пациентов с БАС и контролем. Исходные уровни сыворотки NF-L коррелировали со временем выживания, и наблюдалась слабая связь с продолжительностью заболевания. Для S100b и PGRN была обнаружена связь с изменениями в баллах ALSFRSR и тенденция к снижению их концентраций в подгруппе пациентов с быстрым прогрессированием заболевания. Авторы считают сывороточный уровень NF-L маркером для диагностики любой стадии заболевания БАС, в то время как сывороточные уровни PGRN и белка S100b имеют лишь незначительное прогностическое значение.

А. Migheli и соавт. [19] показали увеличение уровня S100b в астроцитах и мотонейронах спинного мозга у пациентов с БАС. M. Otto и соавт. [20] не обнаружили разницы в сывороточной концентрации S100b у пациентов с БАС и здоровых, однако по мере прогрессирования заболевания уровень S100b повышался.

В то же время известно, что при болезни двигательного нейрона повышение концентрации S100b и sCD14 может указывать на активацию глиальных клеток ЦНС. Поскольку концентрации S100b и sCD14 коррелируют с выживанием при БАС, предполагается, что сочетание обоих маркеров может быть полезным для получения прогностической информации у больных с БАС [21].

В настоящее время имеются противоречивые данные об изменении концентрации НСЕ при нейродегенеративных заболеваниях. Считается, что НСЕ может быть неспецифическим маркером церебральной дегенерации. Так, было установлено [22] достоверное повышение содержания НСЕ, кислого глиофибриллярного протеина и α-гликопротеида в крови уже на ранних стадиях болезней Альцгеймера и Паркинсона. Н.Г. Жуковой и Ф.Ф. Гашиловой [9] было отмечено повышение уровня НСЕ более чем в ½ случаев при паркинсонизме, при этом в 79% случаев — у больных болезнью Паркинсона. Повышение показателя НСЕ чаще встречалось у больных с быстрым темпом прогрессирования заболевания в возрастных группах от 40 до 69 лет, преимущественно у мужчин.

Противоречивость биохимических данных, полученных многими исследователями при БАС, возможно, обусловлена неоднородностью основной группы исследования вследствие разных форм и разной длительности заболевания. Так, в нашем исследовании были выявлены изменения уровней нейроспецифических белков в ЦСЖ, коррелировавшие с дебютом БАС (достоверное повышение при бульбарной форме, менее выраженное — при шейно-грудной), длительностью болезни до 1 года. Полученные результаты могут быть следствием определенных анатомо-физиологических особенностей строения спинного мозга с меньшей плотностью кортикоспинальных трактов в поясничном и крестцовом отделах по сравнению с отделами, лежащими выше, что может создавать предпосылки для более низких значений нейронспецифических белков, особенно S100b, при пояснично-крестцовом дебюте и преимущественном поражении уровня поясничного утолщения и проводников на этом уровне.

Таким образом, было установлено, что концентрации НСЕ и белка S100b в ЦСЖ были достоверно выше в группе пациентов с БАС, чем в контроле, при сохранении нормальных значений этих показателей в сыворотке крови, также выявлена достоверная положительная связь между этими нейроспецифическими белками в ЦСЖ, что указывает на взаимозависимость нейронального повреждения и избыточной активации микроглии при БАС и подтверждает роль изученных нейроспецифических белков в патогенезе данного заболевания.

При клинико-биохимических сопоставлениях было показано, что в группах с бульбарной формой БАС и длительностью заболевания менее 1 года концентрации НСЕ и белка S100b в ЦСЖ были достоверно выше, чем в контроле, что определяет роль данных белков как маркеров, отражающих более тяжелое и быстрое течение нейродегенеративного процесса. При шейно-грудной форме БАС и у пациентов с длительностью заболевания 1—4 года показано увеличение концентрации НСЕ как в ЦСЖ, так и в сыворотке крови при сохранении неизменными значений концентраций белка S100b, что свидетельствует о большей интенсивности нейронального повреждения в ЦНС у данных групп пациентов и может иметь особое значение для определения формы и темпа прогрессирования нейродегенеративного процесса.

Выявленная отрицательная корреляционная связь белка S100b в ЦСЖ с балльной оценкой ALSFRSR в группе пациентов с бульбарной формой заболевания (r= –0,6; р=0,03) позволяет предположить, что выход нейроспецифического белка из поврежденных клеток нервной ткани в интерстициальное пространство двигательных расстройств.

Представлены данные о нарушении проницаемости ГЭБ при определении градиента белка S100b ЦСЖ/сыворотка у пациентов с различной длительностью заболевания БАС в виде достоверного (р=0,036) снижения данного градиента у пациентов с длительностью заболевания от 1 года до 4 лет по сравнению с пациентами с длительностью заболевания менее 1 года, что может быть обусловлено неуклонным прогрессированием заболевания с изменением уже сывороточной концентрации нейроспецифического белка при БАС.

Таким образом, динамическое исследование уровня нейроспецифических белков НСЕ и S100b, прежде всего в ЦСЖ, позволяет судить о течении, тяжести и длительности нейродегенеративного процесса при БАС. Анализ содержания основных нейроспецифических белков, участвующих в коммуникации между клетками нервной системы, в сыворотке и ЦСЖ может выявить нарушение ГЭБ, что также характеризует один из механизмов патогенеза БАС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: rushkevich@tut.by