Шизофрения является заболеванием со сложной этиологией, включающей взаимодействие генетических и средовых факторов [1]. В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении генетического полиморфизма, ассоциированного с заболеванием [2, 3]. В эпидемиологических исследованиях [4] установлены средовые факторы риска развития шизофрении: сезон рождения, осложнения при родах, жестокое обращение в детстве и др. Многие из них, в частности стрессовые события в раннем онтогенезе, могут влиять на активность генов через эпигенетические модификации генома (изменения в структуре хроматина, не затрагивающие нуклеотидную последовательность ДНК) [5, 6]. В связи с этим внимание привлечено к такому эпигенетическому процессу, как метилирование ДНК. Полагают [6, 7], что поскольку оно вносит вклад в стабильные долговременные изменения регуляции экспрессии генов, то может быть связано с возникновением психических заболеваний, включая шизофрению, на последующих этапах онтогенеза. При этом эпигенетические модификации являются обратимыми, что делает их привлекательными мишенями для медикаментозного лечения [8]. Количество и качество соответствующих исследований при шизофрении быстро растет [9, 10]. Недавно появились первые работы [11, 12], направленные на оценку связи между метилированием ДНК и премортальными когнитивными особенностями больных, выполненные на аутопсийных образцах мозга.

Учитывая, что эпигенетические исследования когнитивного дефицита при шизофрении находятся в самом начале своего пути, важно обратить внимание на некоторые методологические аспекты, которые должны быть учтены при их планировании и интерпретации. В подобных исследованиях используются высокотехнологичные и пока дорогостоящие методы, в связи с чем к дизайну работы и оценке фенотипа должны предъявляться особенно высокие требования. При планировании эксперимента необходимо решить ряд вопросов, включая выбор подхода (гены-кандидаты или полногеномный анализ) и метода для оценки метилирования, а также материала для анализа (кровь, аутопсийные образцы мозга, обонятельный нейроэпителий). В данном сообщении будут освещены клинико-психологические аспекты проблемы, помимо эпигенетического, релевантные широкому кругу подходов к поиску биологических основ когнитивного дефицита, использующих высокотехнологические методы.

К настоящему времени существуют тысячи публикаций, посвященных когнитивному дефициту при шизофрении. Их результаты сильно вариативны. Проблемы построения исследования, такие как малочисленность выборок, неудовлетворительное описание клинико-демографических характеристик пациентов и систематическая несбалансированность количества больных и контроля, а также применение разных тестов для оценки одного и того же психического домена, затрудняют выявление причин истинной гетерогенности больных в отношении когнитивных симптомов [13, 14].

Одним из способов снижения изменчивости оценок когнитивного дефицита является использование стандартизованных батарей, созданию которых в последнее время уделялось значительное внимание. Наибольшее распространение получили две шкалы: Brief Assessment of Cognition in Schizophrenia (BACS), обеспечивающая экспресс-оценку когнитивного дефицита, и Matrics Consensus Cognitive Battery (MCCB), нацеленная на изучение его динамики в ответ на лечение. Для русскоязычной популяции адаптирована только BACS [15]. MCCB переведена на ряд языков, включая русский, однако отсутствие адаптации в РФ ограничивает возможности ее применения ввиду культуральных влияний на ряд тестов.

Отметим, что измерение когнитивного дефицита осуществляется в контексте различных научных проектов, и нет универсальной батареи тестов, которая удовлетворяла бы разным задачам. Так, в биологических (включая эпигенетические) исследованиях может быть желателен сбор информации, обеспечивающий дальнейшее нейропсихологическое толкование полученных результатов, либо детальное изучение отдельных когнитивных доменов. В случаях, когда исследователю приходится самостоятельно формировать батарею тестов в соответствии с целью работы, рекомендуются сбор ко-нормативных показателей для каждого теста при условии его выполнения вместе с другими тестами, включенными в батарею [16, 17]. Наличие таких данных позволяет оценить представительность для общей популяции включенных в конкретное исследование случаев и контроля.

Еще одной проблемой является учет мешающих факторов, т. е. характеристик испытуемых, оказывающих эффект на видимую связь между причинным фактором и исходом ввиду ассоциации с первым из них и влияния на последний [18]. Она тесно связана с особенностями выборки. Большинство исследований когнитивного дефицита при шизофрении страдает выборочными искажениями, с избытком в выборке мужчин и хронических больных [14], что может вести к переоценке когнитивных нарушений пациентов. В то же время в некоторых работах разница между больными и здоровыми по когнитивным признаками отсутствует или мала. В рамках метаанализа показано, что величина выборки оказывает влияние на межгрупповые различия больных и здоровых по IQ, памяти и вниманию, несбалансированность случаев и контроля относительно пола — помимо перечисленных факторов, еще и по языковым процессам и управляющим функциям, а возраст — по управляющим функциям и вниманию [13]. Снизить остроту этой проблемы может использование условного контроля — парный подбор контроля к случаю (matched control). Что касается выбора параметров подбора, то в эпигенетических исследованиях важно учитывать такие традиционные факторы, как пол и возраст, поскольку они влияют не только на когнитивные признаки и выраженность их нарушений при шизофрении, но и ассоциированы с особенностями метилирования ДНК [19, 20]. Известно, что как в норме, так и при шизофрении имеют место устойчивые корреляции когнитивных признаков с образованием. Однако уровень образования пациентов может отражать глубину патогенетического процесса и преморбидное снижение психических функций в результате нарушенного нейроразвития, ведущего к шизофрении. В связи с этим многие авторы [17] не рекомендуют исключение из анализа дисперсии когнитивных нарушений, обусловленной данным фактором. Специфичным для эпигенетических исследований шизофрении мешающим фактором является курение, поскольку оно высокохарактерно для больных и оказывает существенное, стабильное влияние на метилирование ДНК [21]. Сбор данных об истории курения лиц, включенных в эпигенетическое исследование, представляется необходимым для последующего учета этого фактора при статистической обработке данных.

Исследования с попарно подобранным контролем требуют применения особых статистических процедур, что, согласно проведенному D. Niven и соавт. [22] анализу, далеко не всегда наблюдается в опубликованных работах. В целом для нормально распределенных количественных признаков рекомендуется парный t-тест [18]. Однако N. Pearce [23] отмечает, что применение специальных статистических методов для сравнения зависимых выборок не является обязательным, и в случае попарно подобранного контроля может понадобиться дополнительный статистический анализ мешающих факторов (конфаундеры).

Цель настоящей работы — изучение связи между особенностями метилирования ДНК в клетках крови и когнитивным дефицитом больных шизофренией с формированием когнитивной батареи, адекватно отражающей особенности когнитивного дефицита при шизофрении, и репрезентативной выборки для эпигенетического анализа.

При построении исследования при формировании выборки использовался подход с учетом перечисленных методологических требований.

Учитывая представления о стабильности когнитивных функций на возрастном отрезке от 20 до 40 лет [16] и данные о влиянии возраста на метилирование [20], в выборку включали лиц от 18 до 45 лет. Кроме того, критериями включения были: родной язык — русский, образование не ниже среднего, европейское происхождение. Исключали лиц с аддиктивными расстройствами, тяжелыми нейроинфекционными заболеваниями и черепно-мозговыми травмами с потерей сознания более 5 мин в анамнезе.

Все обследованные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Научного центра психического здоровья.

Нормативную выборку составили 166 здоровых, не имеющих наследственной отягощенности по психическим заболеваниям. Их средний возраст был 25,96±6,64 года; 82 (49%) — женщины; 22 (15%) человека имели среднее образование, остальные были студентами ВУЗов либо лицами с незаконченным или полным высшим образованием (далее «высшее образование»). Группы здоровых мужчин и женщин значимо не различались по полу, образованию и возрасту. В выборку больных включили 200 человек, способных выполнить предложенные тесты. Их средний возраст был 28,59±7,29 года; 98 (49%) — женщины. Больные мужчины и женщины не различались по возрасту. Несмотря на узкий возрастной диапазон, средний возраст больных был выше, чем здоровых (t=3,57, p=0,0004). Больных обследовали в период нахождения в стационаре — после стабилизации клинического состояния.

В когнитивную батарею включили полные версии (для последующего более детального анализа отдельных когнитивных процессов) шести тестов, на основании которых оценили восемь признаков, предположительно связанных с разными доменами психического: 1) скорость обработки информации — суммарный балл семантической вербальной беглости для категорий «животные» и «фрукты», количество прочитанных слов и названных цветов в цветобуквенном тесте Струпа; 2) вербальная память — суммарное количество слов, воспроизведенных за пять последовательных повторений списка, А в тесте слухоречевой памяти Рея (RAVLT); 3) управляющие функции и внимание — количество верных операций при отсчитывании от 200 по 2 и 5 (проба концентрации внимания), время выполнения теста следования по маршруту, часть Б (TMT-B), балл интерференции в тесте Струпа; 4) социальные когниции — количество правильных ответов в тесте на распознавание мимически выраженных эмоций [24].

Адаптация батареи заключалась в сборе нормативных показателей и переводе сырых оценок в Т-баллы с учетом влияния демографических факторов на основе данных нормативной выборки. Валидизация включала сравнение средних и факторной структуры батареи в группах больных и здоровых, а также оценку эффективности классификации участников. Проверку признаков на нормальность распределения проводили с помощью критериев Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Вилка, визуального анализа гистограммы и анализа распределения частот значений каждого признака. Только оценки ТМТ-В по всем критериям не соответствовали нормальному распределению и поэтому были трансформированы с помощью натурального логарифма. Значения признаков переводили в Т-баллы по стандартной формуле (10·(x–M)/SD+50). При этом показатель logТМТ-В был инвертирован (10·(M–х)/SD+50) для того, чтобы более высокие Т-баллы отражали более высокий уровень выполнения теста.

Сравнение средних. Анализ влияния демографических факторов на когнитивные переменные в группе здоровых выявил влияние пола на показатель концентрации внимания (t=2,77, p с поправкой Бонферрони, p_корр=0,05). Для него Т-баллы подсчитывали отдельно в подгруппах мужчин и женщин.

Средние значения и стандартные отклонения когнитивных признаков в выборках приведены в табл. 1. Общий индекс когнитивного функционирования представлял собой среднее для восьми признаков. Он не был связан с возрастом и полом, хотя зависел от образования: различия между здоровыми лицами с высшим и средним образованием были значимы (t=4,87, p_корр=0,0001) и составили 5 Т-баллов. В группе больных имело место снижение каждого из когнитивных показателей примерно на одно SD от среднего. Размер эффекта для общего индекса составил d=1,38, что в целом соответствовало данным метаанализов — от первого, выполненного в 1998 г. R. Heinrichs и K. Zakzanis [25], до недавнего исследования J. Schaefer и соавт. [14], а также данным, полученным с помощью батареи MCCB [17]. Важно отметить, что среди больных в отличие от здоровых имели место различия между мужчинами и женщинами по вербальной памяти (t=5,20, p_корр=0,0001) и скорости чтения слов в тесте Струпа (t=4,64, p_корр=0,0001), с более значительным снижением показателей у мужчин.

Факторная структура. Конфирматорный факторный анализ в группе здоровых не подтвердил соответствия данных ни теоретической модели с разделением признаков на домены «вербальная память», «скорость обработки информации» и «управляющие функции» (показатель распознавания эмоций в анализ не включали), ни однофакторной. Для теоретической модели основные показатели соответствия были равны [р для χ²]=0,00, RMSEA=0,13, SRMR=0,12, CFI=0,77; для однофакторной — [р для χ²]=0,00, RMSEA=0,17, SRMR=0,13, CFI=0,56, при рекомендованных — [р для χ²]>0,05, RMSEA<0,06, SRMR<0,08, CFI>0,95 [26]. Эксплораторный анализ факторной структуры батареи (метод главных компонент с вращением ВАРИМАКС) выявил четыре статистически значимых согласно критерию Кайзера фактора в группе здоровых и два — в группе больных (табл. 2). Это, очевидно, отражало действие болезненного процесса на когниции пациентов. В соответствии с этим предположением у больных оценки второго фактора коррелировали с выраженностью негативных симптомов по шкале PANSS (r= –0,30, p_корр=0,002) и были ниже у мужчин, чем у женщин (t=4,25, p_корр=0,0001). Других значимых корреляций между значениями факторов и клинико-демографическими характеристиками найдено не было.

Классификация. Пошаговый дискриминантный анализ показал, что наиболее существенными для классификации на группы больных и здоровых являются показатели вербальной беглости, переключения внимания (logTMT-B) и скорости чтения слов и называния цветов в тесте Струпа, т. е. оценки управляющих функций и скорости обработки информации. Их использование приводило к правильной классификации 85% выборки больных и 85% — здоровых.

Формирование выборки с парным контролем для эпигенетического анализа. Для эпигенетического исследования из выборки больных случайным образом выбрали по 46 мужчин и женщин, затем из нормативной выборки подобрали каждому больному индивидуальный контроль, соответствующий по полу и возрасту (±2 года). Анализ показал, что больные и контроль хорошо представляли первоначальные выборки (см. табл. 1). Сравнение групп с помощью парного t-теста с последующей поправкой Бонферрони и с помощью ковариационного анализа (MANCOVA) с контролем пола и возраста дало сходные результаты — различия между больными и здоровыми по композитному индексу и каждому из признаков были высокозначимыми (p=0,0001). Такие результаты можно трактовать в пользу пригодности сформированной батареи и выборки для анализа различий больных и здоровых по когнитивным признакам и поиска эпигенетических коррелятов этих различий.

Проведенный теоретический анализ методологических требований и опыт их учета при формировании когнитивной батареи и выборки для эпигенетического исследования позволяет заключить, что для адекватной оценки когнитивного дефицита при шизофрении и снижения влияния конфаундеров в ходе эпигенетического анализа, как и в связи с другими научными задачами, рекомендуется использование батареи с существующими нормативными данными в целевой популяции, что позволяет оценить репрезентативность включенных в выборку исследования контроля и больных. Теоретически обоснованная психологическая структура батареи должна быть проверена на целевой нормативной популяции и в когорте больных. Необходимо отслеживать сбалансированность групп случаев и контроля по численности, полу и возрасту, что наилучшим образом обеспечивает дизайн с попарно подобранным контролем. Даже в этом случае полезно проводить статистический анализ с учетом влияния конфаундеров. Эффекты образования и курения могут быть оценены дополнительно — без включения в основную модель.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.