Боковой амиотрофический склероз (БАС) - прогрессирующее нейродегенеративное заболевание (НДЗ) с не известными на сегодняшний момент этиологией и патогенезом. Заболевание встречается относительно редко. Средняя заболеваемость в мире составляет 0,2-2,4 случая на 100 000 населения. По данным московского регистра, составленного в 2006-2007 гг. она равнялась 1,16 на 100 000 жителей [2].

Особенностью данной нейродегенерации является избирательное поражение центральных и периферических двигательных нейронов, при этом отмечается значительная клиническая гетерогенность по возрасту и локализации дебюта БАС, темпам прогрессирования, длительности выживания пациентов, наличию экстрамоторных симптомов. Эффективного метода лечения в настоящее время не существует, заболевание заканчивается летальным исходом в среднем через 2-3 года после дебюта.

Моделирование заболеваний человека в лабораторных условиях с использованием клеточных культур и различных видов животных позволяет изучать патогенез, исследовать взаимодействия между генотипом и фенотипом, структурой белка и его функцией, тестировать новые терапевтические подходы. Создание таких моделей особенно важно для НДЗ, в том числе БАС, точная причина развития которых, несмотря на значимый прогресс биологии и медицины, по-прежнему неизвестна [3].

В большинстве случаев БАС носит спорадический характер, наследственные формы составляют примерно 10-15% от общего числа диагностированных случаев [21]. При семейных формах характер наследования может быть как аутосомно-доминантным, так и аутосомно-рецессивным с широкой вариабельностью пенетрантности, что связано с вовлеченностью в патогенез БАС многих генов. Среди семейных форм БАС 20% ассоциированы с мутациями в гене, кодирующем Cu/Zn-зависимую супероксиддисмутазу 1 (СОД1), в настоящее время описано более 100 различных вариантов его мутаций [16]. СОД1 была обнаружена в составе внутриклеточных включений только у пациентов с СОД1-зависимым БАС, но не при других формах заболевания [4]. Недавно было показано [17, 28], что мутации в генах ДНК/РНК-связывающих белков - TDP-43 и FUS - также ассоциированы с рядом семейных случаев БАС, и, кроме того, вовлечены в патогенез некоторых спорадических форм заболевания.

В настоящее время предметом многочисленных исследований является изучение нарушения метаболизма РНК при БАС, связанного с дисфункцией TDP-43 и FUS.

Ранние сведения о патогенезе БАС базировались на аутопсийных данных. Характерными морфологическими признаками заболевания являются атрофия мотонейронов с выраженным набуханием перикариальной области и аксонов, нейрофиламентные аномалии, присутствие белковых включений (тельца Буниной, сфероиды и тяжи убиквитинированного материала в дегенерирующих аксонах и телах клеток), часто - нейровоспалительные реакции [1, 21]. Тем не менее информации о патофизиологических механизмах дегенерации мотонейронов было получено крайне мало.

В последние десятилетия был разработан ряд моделей in vitro и in vivo, которые не только позволили получить новые сведения о механизмах развития заболевания, но и активно применяются для разработки и тестирования новых терапевтических средств.

Основные данные по механизмам дегенерации мотонейронов были получены главным образом на in vitro моделях - первичных культурах мотонейронов, клетках гибридомы NSC-34, однако очевидно, что эксперименты с использованием живых организмов позволяют более полно моделировать течение заболевания у человека и приблизиться к пониманию основ его патогенеза.

Число существующих на настоящий момент моделей БАС у беспозвоночных невелико, чаще всего в качестве модельных организмов используются Drosophila melanogaster и нематода Caenorhabditis elegans [11, 18]. Моделирование НДЗ у Drosophila melanogaster возможно благодаря высокой функциональной консервативности большинства генов, а также тому, что 75% сцепленных с заболеваниями генов человека имеют по меньшей мере один гомолог у дрозофилы. Важны также короткий жизненный цикл дрозофилы, поскольку большинство НДЗ имеют позднее начало, существование отработанных схем генетических манипуляций с геномом и скрининга [15].

В пользу создания моделей НДЗ при использовании Caenorhabditis elegans также говорят короткий жизненный цикл и установленные схемы генетического скрининга у нематод [27]. Моделирование у высших животных, млекопитающих и прежде всего грызунов (мыши и крысы) позволяет изучать функцию ассоциированного с заболеванием белка в условиях нормы и патологии. Немаловажным является то, что по крайней мере для мышей разработаны и успешно используются методы генетического изменения, упрощая моделирование заболеваний. При моделировании НДЗ у высших животных в отличие от беспозвоночных не возникает проблемы специфичности картины патологии в связи с высокой организацией этих организмов [5, 13, 14].

В настоящем обзоре описываются нетрансгенные (негенетические) модели дегенерации мотонейронов, начиная с простейших клеточных моделей и заканчивая млекопитающими.

Культуры мотонейронов. Для моделирования НДЗ, в частности БАС, успешно используется ряд клеточных линий, которые являются производными клеток нервной системы: первичные культуры мотонейронов и гибридомные клетки [25]. Для их получения используют эмбрионы мыши или крысы в возрасте 12-14 дней, спинной мозг разделяют механически и энзиматически. Выделить мотонейроны относительно нетрудно из-за их большого размера (от 25 до 30 мкм), однако, поскольку они присутствуют в небольших количествах, чаще всего используют так называемые обогащенные культуры. Для этого мотонейроны выделяют по относительно низкой клеточной плотности и способности к образованию ацетилхолина [26]. Кроме того, клеточные культуры обогащают мотонейронами с помощью проточной цитофлуорометрии, либо после введения флюоресцентной метки в развивающуюся мышцу и ретроградного транспорта через аксон в тело нейрона, либо благодаря экспрессии GFP под контролем мотонейронспецифического промотора. Мотонейронам необходим ряд факторов для выживания, поэтому для обогащенных культур используют фидерный слой из клеток глии.

Несмотря на простоту этой системы, именно с ее помощью было впервые показано, что мотонейроны особенно уязвимы для глутаматергической эксайтотоксичности, опосредуемой AMPA-рецепторами, а также то, что токсичность при этом обусловлена Са²⁺, а глутамат более эффективно стимулирует продукцию активных форм кислорода именно в мотонейронах в сравнении с другими типами нервных клеток [6]. Очевидным недостатком данной модели является существенное изменение окружения мотонейронов, например изменение соотношения мотонейроны - глия, так как не только нейроны, но и другие клетки нервной системы играют важную роль в патогенезе НДЗ [8, 23].

Клетки линии NSC-34. Клеточная линия NSC-34 - гибридная клеточная линия нейробластомы и мотонейронов спинного мозга [7]. Клетки этой линии обладают некоторыми характеристиками мотонейронов - способность к синтезу, хранению и высвобождению ацетилхолина, генерации потенциала действия, экспрессии нейрофиламентов и др. Клетки линии, экспрессирующие мутантную форму СОД1, являются клеточной моделью БАС. Так, в этих клетках, так же как и in vivo, наблюдаются свойственные БАС человека изменения - фрагментация аппарата Гольджи, нарушение функционирования митохондрий и др. [12, 24]. Тем не менее клетки данной линии обладают и некоторыми характеристиками нейробластомы, например в них отмечается повышенная активность онкогена N-myc [7], поэтому они не могут использоваться для изучения механизмов клеточной гибели при БАС.

Млекопитающие. Существует ряд острых и хронических in vivo моделей, при создании которых не использовались подходы по внесению изменений в геном организма, - так называемые негенетические модели. Они используются для изучения патогенеза спорадических форм БАС. Наиболее известна модель эксайтотоксичности, которая получается с использованием агонистов NMDA- и AMPA/каинатных рецепторов или глутамата у крыс. Для этого применяют микродиализ в поясничном отделе спинного мозга, при этом проводят одновременно перфузию препарата и сбор внеклеточной жидкости для определения уровня глутамата и аминокислот. На этой модели было показано, что повышение концентрации эндогенного глутамата при ингибировании его транспорта не способно вызывать двигательные нарушения у животных, таким образом была поставлена под сомнение теория о ведущей роли глутаматопосредованной эксайтотоксичности в развитии заболевания. В то же время введение агонистов AMPA вызвало паралич конечностей и гибель мотонейронов. Таким образом, было продемонстрировано, что AMPA-рецепторы играют важную роль в развитии БАС [9]. Существенным недостатком модели является то, что паралич и гибель мотонейронов развивались в течение нескольких часов после инфузии, тогда как у человека развитие БАС - относительно медленный и длительный процесс. Для решения этой проблемы этими же авторами была разработана хроническая модель БАС у крыс с медленной инфузией AMPA.

Недавно была предложена еще одна негенетическая мышиная модель, получаемая путем инъекции токсичного лектина растения Ricinus communis, или рицина, селективно повреждающего седалищный нерв, который отвечает за подвижность задних конечностей у мыши [10].

У таких мышей наступает паралич конечностей, клинически сходный с наблюдаемым при БАС и прогрессирующей спинальной мышечной атрофии (СМА). У мышей наблюдается нарушение ретоградного транспорта, повреждение аксонов и тел мотонейронов с их последующим апоптозом. Полученная модель, по-видимому, более важна для изучения СМА, чем БАС, так как для последнего создано множество генетических моделей, гораздо более полно воспроизводящих картину патологии, тогда как создание моделей для СМА затруднено из-за раннего начала заболевания и высокой летальности трансгенных животных.

Модели со спонтанными генетическими дефектами. Наиболее ранняя модель БАС у мышей, характеризующаяся изменениями в мотонейронах, - мыши с мутацией wobbler (wr) в гене Vps54, локализующемся на 11 хромосоме. В гомозиготном состоянии мутация вызывает гибель мотонейронов в шейном отделе спинного мозга, главным образом поражаются тела нейронов, следствием чего является аксонопатия [22]. Тем не менее механизмы нейродегенерации у этих мышей по-прежнему не установлены, предполагается, что они имеют глиальное происхождение, эксайтотоксичности и вовлечения каспаз и апоптоза мотонейронов у данной модели обнаружено не было.

Прогрессирующая мотонейронопатия наблюдается и у мышей с мутацией в гене тубулинспецифического шаперона E. Эти мыши погибают в течение нескольких недель после рождения из-за прогрессирующей дегенерации аксонов двигательных нейронов, но при этом тела мотонейронов почти не затронуты, следовательно, использование данной модели как адекватной БАС человека весьма ограничено [20]. В основном она использовалась для исследования нейропротекторного эффекта симптоматических препаратов - трофических факторов и антиэксайтотоксических веществ.

Еще одна мутация в гене wst у мышей приводит к развитию дегенеративных изменений в спинном мозге, параличу задних конечностей, однако не из-за гибели мотонейронов, а в основном из-за васкуляризации клеток [19].

Таким образом, перечисленные модели спонтанной дегенерации двигательных нейронов не позволяют из­учать клеточные и молекулярные механизмы развития БАС у человека, так как в подобных случаях природа патологических изменений носит совершенно иной характер. Тестирование терапевтических подходов на данных моделях также ограничено симптоматическими средствами. В настоящее время модели спонтанной дегенерации мотонейронов замещаются моделированием БАС у трансгенных животных. Трансгенные модели БАС будут описаны в следующей части обзора.