Синдром мягкого когнитивного снижения (МКС) - промежуточное состояние между возрастными изменениями ЦНС и клинической деменцией. Он относится к факторам риска развития болезни Альцгеймера (БА) или является ее начальной, продромальной, стадией [6].

БА - многофакторное заболевание. Основные положения о механизмах ее развития связаны с представлениями о токсическом действии β-амилоида, окислительном стрессе, дефиците холинергической системы, изменениях в работе глутаматергической системы и др. При БА поражаются не только клетки головного мозга, но и периферические клеточные системы организма. Выявление экстрацеребральных изменений при БА занимает одно из ведущих мест в спектре исследований, посвященных данной патологии.

Десятилетия были отданы безуспешному поиску содержащихся в крови и других биологических жидкостях биомаркеров БА, которые позволяли бы точно диагностировать заболевание на преклинической стадии и предсказать развитие БА у людей, страдающих МКС. В самые последние годы в этой области достигнуты некоторые успехи - например, разработан алгоритм оценки содержания определенных белков-маркеров (порядка 30) в плазме крови, который обеспечивает точность диагностики БА и оценку вероятности перехода от МКС к деменции от 70 до 90% [23]. Перспективы имеет обнаружение определенных изменений в системе ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах и плазме, характерных для перехода от МКС к БА [15]. Эритроциты в этом отношении являются одним из широко используемых объектов для исследования окислительного стресса [21].

БА можно отнести к «мембранным» болезням. Клеточные мембраны вовлечены в процессы образования и метаболизма токсического β-амилоида; взаимодействие с ними обусловливает токсические, патогенные эффекты этого пептида; они обеспечивают функционирование холинергической системы, поскольку в них локализована ацетилхолинэстераза (АХЭ) - фермент, регулирующий уровень ацетилхолина (АХ), и рецепторы этого медиатора. Важно участие мембран в развитии окислительного стресса и защищающих от него процессах. Придерживаясь взглядов о первостепенной для БА роли окислительного стресса, мы рассматриваем его не только как источник свободных радикалов, повреждающих клеточные структуры и макромолекулы, но и как показатель нарушения в работе системы регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах. Работа этой системы участвует в регуляции клеточного метаболизма, контролируя структуру (и соответственно зависящие от структуры функции) тех или иных мембран [5].

Цель исследования - изучение возможных структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов у пожилых больных с синдромом МКС по сравнению с людьми соответствующей возрастной группы без признаков психических и неврологических заболеваний и сравнение этих изменений с таковыми при «нормальном» старении и выраженной БА в аспекте перспективы их применения для диагностики и терапии. В задачи работы входило: охарактеризовать состояние мембраны эритроцитов по критерию механической прочности (спонтанный гемолиз); определить содержание в эритроцитах продуктов ПОЛ (по накоплению малонового диальдегида - МДА), а также исследовать структурное состояние мембран эритроцитов (микровязкость поверхностных областей мембраны) с помощью двух спиновых зондов, локализующихся в bulk-липидах и прилежащих к белкам участках липидного би­слоя; определить кинетические параметры реакции, катализируемой мембраносвязанной АХЭ эритроцитов.

Характеристика клинических групп. Группа больных с МКС включала 20 человек (75% женщин, 25% мужчин; средний возраст - 71±3 года).

Контрольная группа здоровых состояла из 31 человека без признаков психических и неврологических заболеваний, в ней было 45% мужчин и 55% женщин. Их средний возраст - 64±10 лет. В работе были также использованы эритроциты 8 молодых людей в возрасте 18-28 лет (средний - 24±3 года).

Кровь для исследования во всех случаях была взята после получения информированного согласия обследуемых. Все они были жителями Московского региона.

Состояние больных соответствовало операциональным критериям, основанным на соглашении международной исследовательской группы по изучению МКС - MCI (Mild cognitive impairment) [18, 22, 24, 25].

Критериями исключения являлись любые неврологические, психические или соматические заболевания, которые могли быть ответственны за когнитивную недостаточность пациента.

Для оценки состояния когнитивных функций применяли мультидисциплинарный подход, включающий клинический, психопатологический, психометрический, нейропсихологический и нейровизуализационные методы [ 10, 11, 16, 19, 26, 28].

Для исключения вероятной связи когнитивного снижения с церебрально-сосудистой патологией или депрессивными расстройствами в дополнение к клиническим методам использовались клинические диагностические шкалы [13, 30]. Для исключения объемных образований, воспалительных, травматических повреждений головного мозга, оценки степени расширения ликворной системы и выраженности очаговых (сосудистые) изменений проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ). Картина МРТ у пациентов обследованной когорты характеризовалась преимущественно слабой или, реже, умеренной наружной и внутренней сообщающейся гидроцефалией.

Анамнестические сведения на всех пациентов восстанавливались ретроспективно на основании данных, полученных как с их слов, так и от одного или двух объективных информантов, а также из имеющейся медицинской документации (амбулаторные карты поликлиник, истории болезни или выписки соматических стационаров).

Выделение эритроцитов. Эритроциты выделяли из венозной цитратной крови. Для этого кровь центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость удаляли, полученный осадок 2 раза отмывали физиологическим раствором. Для работы использовали 5% суспензию эритроцитов в среде, содержащей 0,1М трис-HCl буфер и физиологический раствор в соотношении 1:1.

Активность АХЭ определяли в гемолизате эритроцитов спектрофотометрически по методу G. Ellman [17] в модификации [29], используя АХ (йодид) в качестве субстрата, с непрерывной регистрацией кинетики образования продукта реакции. Температура реакции - 37 °С, рН 8. Реакцию начинали добавлением субстрата в конечной концентрации 2·10^-5-20·10^-5 М. Кинетические параметры реакции гидролиза АХ, максимальную скорость (Vmax) АХЭ реакции, кажущуюся константу Михаэлиса Kмкаж, (далее - Км) рассчитывали как параметры уравнения Михаэлиса-Ментен по кривой зависимости начальной скорости увеличения оптической плотности от концентрации АХ. Vmax/Kм («эффективность») определяли как угол наклона касательной к субстратной зависимости в точке, соответствующей близкой к нулевой концентрации субстрата [8].

Механическую резистентность эритроцитов оценивали по степени гемолиза (%) в процессе центрифугирования, которую определяли методом, описанным В.В. Банковой и Ю.А. Юрковым [1].

Содержание продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (МДА), определяли в тех же пробах способом, описанным В.В. Банковой [2].

Микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов оценивали методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с помощью двух парамагнитных зондов, локализующихся в поверхностном слое. В качестве зондов использовали стабильные иминоксильные радикалы [12]: 2,2,6,6-тетраме­тил-4-каприлоилоксилпиперидин-1-оксил (зонд 1) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-гамма-карболин-3-оксил (зонд 2). Известно, что зонд 1 локализуется в поверхностном слое bulk-липидов мембраны, а зонд 2 проникает в область аннулярных прибелковых липидов [3]. Регистрацию спектров проводили на ЭПР-спектрометре ER-200D SRC («Bruker», Германия) при комнатной температуре. Мерой микровязкости служило время вращательной корреляции зондов тc [14]. Микровязкость мембраны в области локализации зондов 1 и 2 обозначали как s1 и s2 соответственно. Для более наглядной оценки структуры поверхностной области бислоя мембраны в целом мы ввели показатель s1/s2 (отношение микровязкостей в bulk-липидах и прилежащих к белкам участках липидного бислоя).

Статистическая обработка данных. Для расчетов параметров АХЭ реакции и обработки данных методами непараметрической статистики использовали программу Sigma-Plot v. 11 для Windows. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни. Для оценки коррелятивных связей применяли непараметрический показатель - коэффициент корреляции рангов Спирмена RS.

При определении активности АХЭ и характеристик структуры мембран эритроцитов контрольной группы (далее - здоровые) было проведено сравнение показателей у мужчин и женщин с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Сколько-нибудь существенных половых различий для всех исследуемых параметров не было выявлено. В табл. 1 приведены абсолютные значения медиан показателей структурно-функционального состояния эритроцитов для групп здоровых лиц и с МКС.

Видно, что в свойствах эритроцитарной АХЭ у лиц с МКС имеются существенные изменения по сравнению со здоровыми. Максимальная скорость АХЭ реакции, отражающей содержание фермента в мембране и/или его каталитические свойства и кажущаяся константа Михаэлиса, которая характеризует сродство АХЭ к субстрату, уменьшены у пациентов с МКС примерно на 30%.

Преобладание в эритроцитах только одной молекулярной формы АХЭ и практически отсутствие бутирилхолинэстеразы делают маловероятным возможность изменения соотношения разных холинэстераз и изоферментов АХЭ. Вероятно, в наблюдаемые различия кинетических параметров АХЭ наряду с возможным изменением содержания ферментного белка могут вносить вклад измененные свойства его мембранного микроокружения.

В биохимии мерой активности фермента чаще всего принято считать скорость реакции в присутствии насыщающей концентрации субстрата, т.е. по существу максимальную скорость процесса. С этих позиций можно сказать, что у лиц с МКС по сравнению со здоровыми активность эритроцитарной АХЭ существенно снижена. Однако при реальных физиологических концентрациях АХ (<Km) (в крови это порядка 10^-8 М) активность АХЭ (скорость АХЭ реакции) в соответствии с кинетикой Михаэлиса-Ментен, которой она подчиняется, определяется соотношением Vmax/Km («эффективность» фермента) [8]. Из приведенных данных видно, что эффективность АХЭ в эритроцитах крови пациентов с МКС не отличается от таковой у здоровых. Это наглядно демонстрирует верхняя часть рис. 1 - соответствующие участки субстратных кривых полностью совпадают.

Можно считать, что имеющиеся при МКС изменения в системе АХ в эритроцитах (на уровне фермента АХЭ) скомпенсированы таким образом, что интенсивность его метаболизма остается неизменной.

Из рис. 1 видно, что из исследованных нами структурных параметров эритроцитарных мембран существенным изменениям при МКС подвергается микровязкость в области локализации зонда 2 (примерно 40% увеличение s2 и связанное с этим уменьшение s1/s2).

Поскольку функциональное состояние любой системы определяется не только абсолютной величиной характеризующих ее параметров, но и наличием определенных взаимосвязей между ними, был проведен поиск корреляций между исследуемыми параметрами эритроцитарной мембраны внутри групп здоровых и лиц с МКС. Определив соответствующие коэффициенты корреляции в первой их этих групп, мы обнаружили наличие достоверных связей между некоторыми параметрами (табл. 2).

Коррелятивная связь отмечается между МДА в мембранах эритроцитов и s1. Найденные корреляции между изученными показателями функций эритроцитарных мембран у здоровых, по-видимому, отражают регуляторные взаимосвязи, поддерживающие структурно-функциональный гомеостаз в эритроцитах, в том числе в рамках упомянутой выше системы регуляции ПОЛ.

В группе МКС имеется достоверная корреляция между Vmax/Km и Km при отсутствии корреляции между Vmax и Vmax/Km, что, как и в случае с АХЭ здоровых, свидетельствует об основном вкладе Km в обеспечение эффективности АХЭ. Прямая корреляция между Vmax и Km, которая также имеет место в группе МКС, говорит о наличии механизмов, контролирующих эффективность фермента.

Однако в группе МКС отсутствуют другие корреляции между исследованными показателями. Отсутствие найденных у здоровых корреляций между показателями, характеризующими структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран, по-видимому, отражает нарушение поддерживающих структурно-функциональный гомеостаз регуляторных взаимосвязей в мембранах эритроцитов у пожилых людей с МКС по сравнению с людьми без такового.

Пользуясь собственными результатами и данными литературы, мы провели сравнение изменений исследованных нами показателей состояния мембраны при МКС, «нормальном старении» и выраженной БА, чтобы установить место МКС в этом ряду.

В литературе содержится много сведений о возрастных изменениях показателей окислительного стресса и структуры мембран и их изменениях при развитии БА. Появляются работы, цель которых - выявить перспективы предотвращения дальнейшего перехода от МКС к БА. Мы сочли наиболее правильным провести сравнение наших данных с результатами работ, выполненных на территории нашей страны, хотя они немногочисленны. Это связано с разными по качеству и интенсивности факторами окружающей среды в различных регионах мира, которые определяют уровень окислительного стресса, являющегося одной из главных причин развития нейродегенеративных заболеваний.

Показано, что при БА имеют место существенные сдвиги в структуре и составе поверхностных и глубоколежащих липидов мембраны эритроцитов [9], сходные с изменениями при физиологическом старении. Так же как при старении, при БА происходит интенсификация ПОЛ в мембранах эритроцитов. Так, в работе Ф.И. Брагинской и соавт. [4] установлено, что содержание первичных продуктов ПОЛ при умеренной БА в 3 раза превышало уровень таковых в эритроцитах доноров. Интересно, что это наблюдалось на фоне 7-кратного возрастания степени ненасыщенности липидов, что говорит о глубоких нарушениях в системе регуляции ПОЛ при данном заболевании.

Для сравнения структурно-функционального статуса эритроцитарных мембран при МКС и БА мы использовали данные работы Н.Ю. Герасимова и соавт. [7], авторы которой оценивали состояние мембран эритроцитов у пациентов с БА по тем же параметрам и теми же методами, что и мы при МКС. Из рис. 2 очевидна тенденция нарастания уровня ПОЛ по мере нарастания патологии.

Изменения в структуре мембраны эритроцитов (s1/s2) (см. рис. 2) не нарастают монотонно (как это характерно для показателя окислительного стресса) при старении и переходе к МКС и потом к БА. МКС занимает в этом ряду особое положение. Можно сказать, что при МКС мы имеем своего рода «нормализацию» этого параметра по сравнению со стареющими людьми, которая при БА сменяется резким увеличением по отношению к норме. Величина s1/s2 может быть использована как дополнительный периферический «маркер» для идентификации МКС.

Состояние мембраны определяется не только величиной параметров, но и взаимосвязью между ними, проявляющейся наличием тех или иных корреляций.

В группах здоровых как молодых, так и пожилых прослеживается обратная корреляция между МДА и s1 (Rs= -0,59, p<0,1; Rs= -0,48, p=0,02 соответственно). Интересно, что при развитой БА эта корреляция также имеет место (Rs= -0,53, p<0,1). В то же время в группе пациентов МКС связь между уровнем ПОЛ и микровязкостью соответствующей области мембраны отсутствует (Rs=0,11, p=0,6).

Из приведенного выше можно заключить, что по структуре липидного бислоя эритроцитарных мембран МКС занимает особое положение, отличаясь от как нормального старения, так и БА. По-видимому, в это время происходит перестройка структурно-функциональных связей в мембране эритроцитов. Не исключено, что стадия МКС - это период, когда клетки пытаются адаптироваться, скомпенсировать повреждения, обусловленные усиливающимся с возрастом окислительным стрессом, используя и структурную лабильность мембран, связанную с системой регуляции ПОЛ.

Обычно в продромальной стадии БА используют те же средства, что и при лечении развитого заболевания. До тех пор пока не ясно, являются ли обнаруженные при МКС изменения мембранного статуса проявлением патологии или отражением компенсаторных процессов, надо ли их «усиливать» или им противодействовать для предотвращения БА, нужен осторожный подход к выбору средств и путей терапии и профилактики БА на стадии МКС с учетом их влияния на состояние клеточных мембран.

Работа частично финансировалась по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» - 2012 г. Мозг: Фундаментальные и прикладные проблемы: 3. Доклиническая разработка технологий диагностики (ранней, дифференциальной и др.) и прогнозирования течения заболеваний мозга.