В настоящее время ведущая роль в патогенезе большинства нервных и психических заболеваний отводится нарушению функционирования нейромедиаторных и нейромодуляторных систем, в частности выбросу возбуждающего медиатора — глутамата, лежащему в основе так называемой «смерти от перевозбуждения» или феномена эксайтотоксичности [2, 5].

Глутамат содержится в большинстве нейронов мозга. При гипоксии нервных клеток (возникающей при многих заболеваниях ЦНС) глутамат высвобождается из окончаний нейронов в межклеточное пространство. Его избыточное накопление активирует ионотропные NMDA- и AMPA-подтипы рецепторов, вызывая массивный приток ионов Са²⁺ в цитоплазму постсинаптического нейрона. Кальций в свою очередь запускает ряд процессов: активацию дыхательной цепи митохондрий с увеличением утечки супероксидного анион-радикала и гидроксильного радикала; активацию НАДФН2-оксидазы, в результате чего повышается содержание супероксидного анион-радикала; активацию NO-синтазы (NOS), что приводит к накоплению NO; активацию гемоксигеназы, которая переводит Fe³⁺ в Fe²⁺. Все перечисленные процессы интенсифицируют перекисное окисление липидов (ПОЛ), в ответ происходит активация антиоксидантной системы защиты клетки. При длительной гипоксии наблюдается ее истощение, что приводит к развитию окислительного стресса и гибели нервных клеток путем апоптоза или некроза в зависимости от степени их повреждения [2, 5, 10, 13].

Мексидол — 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат — синтетический антиоксидант, создание и внедрение в клиническую практику которого является несомненным достижением отечественной фармакоиндустрии. Препарат доказал свою эффективность в лечении ряда неврологических и психических заболеваний [12]. Однако некоторые аспекты механизма и локализации его действия, например нейронные, окончательно не изучены.

Цель настоящего исследования — изучение влияния мексидола на развитие феномена эксайтотоксичности in vitro.

В исследовании использовали 5% раствор мексидола («Фармасофт»).

Для изучения влияния мексидола на нейротоксичность глутамата у анестезированных нелинейных белых крыс-самцов извлекали из черепной коробки головной мозг и делали из него срезы толщиной 1 мм [7]. Из срезов или сразу готовили гомогенат (норма), или инкубировали их в течение 15 мин при температуре 37 °С в среде, содержащей 50 мМ трис-НСl буфера («Serva»), 0,25 М сахарозного буфера при рН=7,4 («Химмед»), 1 мМ L-глутамата («Sigma») (контрольная серия) и разные концентрации мексидола (опытные серии). После инкубации этих срезов также готовили гомогенат. Для оценки выраженности повреждения нейронов определяли уровень вторичного продукта ПОЛ малонового диальдегида (МДА) — по реакции с тиобарбитуровой кислотой [3].

Влияние мексидола на свободнорадикальное окисление, индуцируемое двухвалентным железом, изучали в двух метаболизирующих модельных системах (неферментативного — аскорбатзависимого и ферментативного — НАДФН2-зависимого ПОЛ). В качестве субстрата ПОЛ использовали гомогенат мозга нелинейных белых крыс-самцов [6]. В состав первой модельной системы, неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ, входили: 0,6 мл гомогената мозга крыс, 0,6 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН=7,4) («Химмед»), 0,4 мл 72 мкМ раствора соли Мора («Химмед»), 0,4 мл 4,8 мМ раствора аскорбиновой кислоты («Serva»), 0,4 мл раствора изучаемого вещества (опытная серия) или фосфатного буфера (контроль). Состав второй модельной системы, ферментативного НАДФН2-зависимого ПОЛ, включал: 0,6 мл гомогената мозга крыс, 0,6 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН=7,4), 0,4 мл 72 мкМ раствора соли Мора, 0,4 мл 2,4 мМ раствора НАДФН2 («Sigma»), 0,4 мл раствора изучаемого вещества (опытная серия) или фосфатного буфера (контроль) [6]. Данные модельные системы инкубировали на водяной бане при 37 °С в течение 30 мин при свободном доступе кислорода. Выраженность окислительного стресса также определяли по уровню МДА. Ингибирование ПОЛ мексидолом оценивали как отношение разности между приростом концентрации МДА в пробах, не содержащих изучаемый препарат (контроль), и пробах с ним (опытная серия) к приросту концентрации МДА в контрольных пробах: ингибирование ПОЛ (%)=(&Dgr;Ек–&Dgr;Ео)/&Dgr;Ек 100%, где &Dgr;Ек — прирост концентраций МДА в пробах, не содержащих препарат, в разные сроки инкубации, а &Dgr;Ео — прирост концентраций МДА в пробах, содержащих препарат. Прирост концентраций МДА оценивали через 5 мин (Е5 мин — Е0 мин), через 15 мин (Е15 мин — Е5 мин) и через 30 мин (Е30 мин — Е15 мин) от начала инкубации.

Способность мексидола связывать супероксидный анион-радикал изучали в модельной системе, основанной на спонтанном окислении кверцетина [12]. Пусковой стадией в этом процессе является образование супероксидного анион-радикала, поэтому вещества, способные связывать активные формы кислорода, тормозят аутоокисление кверцетина. В состав реакционной смеси входили: 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,8), 2,4 мл дистиллированной воды или раствора изучаемого вещества, 0,058 мл тетраметилэтилендиамина («Sigma»), 0,08 мМ ЭДТА («Химмед»). Реакцию начинали внесением в среду инкубации 0,1 мл 0,462 мМ раствора кверцетина («Sigma»). Об антисупероксидной активности судили по проценту ингибирования аутоокисления кверцетина (А%), рассчитанному по формуле: А%=(ОД1—ОД2)/ОД1 100%, где ОД1 — изменение оптической плотности пробы без препаратов, ОД2 — изменение оптической плотности пробы в присутствии изучаемых препаратов.

Влияние мексидола на активность Cu, Zn-супероксид­дисмутазы (СОД), Se-зависимой глутатионпероксидазы, 1-изофермента глутатион-SH-трансферазы, каталазы, нейрональной NO-синтазы (nNOS) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS) изучали с использованием соответствующих ферментов («Roche)» в модельных системах, предназначенных для определения их активности: СОД — по торможению спонтанного окисления кверцетина [8]; Se-зависимой глутатионпероксидазы — по снижению концентрации НАДФН2 в сопряженной системе НАДФН2—глутатионредуктаза [9]; 1-изофермента глута­тион-SH-трансферазы — по реакции образования конъюгата 1,2-дихлор-3-нитробензола с глутатионом [16]; каталазы — по уменьшению уровня пероксида водорода [1]; nNOS и iNOS — по уменьшению содержания НАДФН2 [11]. Воздействие мексидола на активность ферментов рассчитывали по формуле: А%=(ОД2—ОД1)/ОД1 100%, где ОД1 — активность фермента без мексидола, ОД2 — активность фермента в присутствии мексидола.

В качестве препаратов сравнения при изучении антисупероксидной активности использовали аскорбиновую кислоту, при изучении влияния на железо-индуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое ПОЛ — кудесан (1 мл кудесана содержит 30 мг коэнзима Q10 и 4,5 мг витамина Е) («Аквилон»).

Число независимых определений в каждом эксперименте равнялось шести. Измерение экстинкции выполняли на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1. Результаты представлены в виде среднего арифметического и его ошибки (M±m). Различия между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), критерия Ньюмена—Кейсла. Достоверными считались различия при р<0,05 [4].

Мексидол достоверно (р<0,05) дозозависимо подав­лял развитие глутаматиндуцируемой нейротоксичности, о чем свидетельствует значительное снижение содержания МДА в гомогенатах мозга, инкубируемых с мексидолом (рис. 1). В концентрации 10 мМ мексидол снижал содержание МДА в мозге на 42,0%, в концентрации 3 мМ — на 33,9%, в концентрации 0,5 мМ — на 23,3%, а в концентрации 0,1 мМ — на 11,5%. При изучении механизмов развития данного эффекта были получены следующие результаты. Мексидол достоверно (р<0,05) дозозависимо подавлял аскорбатзависимое железо-индуцируемое ПОЛ в течение 15 мин инкубации, причем по этому эффекту значительно превосходил кудесан (табл. 1). В конечной концентрации в растворе 12,5 мМ мексидол ингибировал аскорбатзависимое ПОЛ через 5 мин от начала инкубации на 65,8%, через 15 мин — на 75,9%; в концентрации 3 мМ — на 22,7 и 84,6%; в концентрации 0,3 мМ — на 39,6 и 56,5% соответственно. К 30-й минуте инкубации содержание мексидола, по-видимому, истощалось, и прирост уровня МДА достоверно (р<0,05) превосходил контрольные показатели на 18,3, 23,3 и 16,6% при конечных концентрациях мексидола 12,5, 3,3 и 0,3 мМ соответственно. В максимальной концентрации кудесан (1,86 мМ витамина Е, 5,72 мМ коэнзима Q10) не только не подавлял, но даже активировал аскорбатзависимое ПОЛ, что можно рассматривать как его прооксидантное действие. В более низких дозировках кудесан умеренно подавлял ПОЛ в течение 15 мин инкубации. К 30-й минуте также происходило истощение содержания кудесана, и прирост МДА превосходил показатели контроля.

Рис. 1. Влияние мексидола на глутамат-индуцируемую нейротоксичность (по концентрации МДА, нмоль/мг белка).

Примечание. Здесь и на рис. 2: * - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества, на уровне p<0,05.

Таблица1

При изучении НАДФН2-зависимого железо-инду­цируемого ПОЛ установлено, что мексидол также выраженно (р<0,05) ингибировал накопление МДА (табл. 2).

Таблица2

В концентрации 12,5 мМ — на 33,3% через 5 мин инкубации и на 35,48% — через 15 мин; в концентрации 3,3 мМ через 15 мин — на 11,5% и через 30 мин — на 48,8%; в концентрации 0,3 мМ через 15 мин — на 18,43%, а через 30 мин — на 31,9%. В отличие от этого эффект кудесана максимально проявлялся к 15-й минуте, а к 30-й минуте инкубации его содержание истощалось, и прирост МДА начинал превосходить показатели контроля.

Мексидол в концентрациях от 0,75 до 3,125 мМ подав­лял аутоокисление кверцетина с 71,42 до 6,2% (р<0,05), что свидетельствует о его способности связывать супероксидный анион-радикал (рис. 2). По данному эффекту мексидол значительно уступал аскорбиновой кислоте, которая подавляла образование супероксидного анион-радикала в данных концентрациях на 100% (р<0,05).

Рис. 2. Влияние мексидола и аскорбиновой кислоты на образование активных форм кислорода (по % ингибирования ауто­окисления кверцетина)

Мексидол достоверно не влиял на активность каталазы и глутатион-SH-трансферазы (рис. 3), но значительно повышал активность Se-зависимой глутатионпероксидазы. В концентрации 1 мМ мексидол повышал активность данного фермента на 186,5% (р<0,05), а в концентрации 0,1 мМ — на 15,5% (р<0,05). Активность СОД также увеличивалась, но в меньшей степени: в концентрации мексидола 1 мМ — на 27,2% (р<0,05), а в концентрации 0,01 мМ — на 10,5% (р<0,05) (см. рис. 3).

Рис. 3. Влияние мексидола на активность антиоксидантных ферментов; n=6.

Примечание. Здесь и на рис. 4: * - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими мексидол, на уровне p<0,05.

Мексидол достоверно не повлиял на активность nNOS во всех исследуемых концентрациях (рис. 4), но в диапазоне концентраций от 0,1 до 0,01 мМ ингибировал активность iNOS на 18,3 и 28,2% соответственно (р<0,05).

Рис. 4. Влияние мексидола на активность nNOS и iNOS; n=6.

В настоящее время глутамат признан основным возбуждающим нейромедиатором ЦНС [2, 5], а перевозбуждение глутаматных рецепторов, возникающее при многих патологиях нервной системы, оказывает основное поражающее действие на нейроны. Оно реализуется посредством массивного поступления ионов кальция внутрь клетки, что в свою очередь приводит к активации образования свободных радикалов и развитию окислительного стресса [14]. При этом активные формы кислорода образуются не только в дыхательной цепи. В настоящее время доказано, что при гипоксии нейронов происходит активация НАДФН2-оксидазы, которая является источником супероксидного анион-радикала [15]. Чрезмерная продукция оксида азота, обусловленная активацией как nNOS, так и iNOS, в условиях повышенного содержания супероксидного анион-радикала может приводить к образованию пероксинитрита, являющегося чрезвычайно реакционноспособным соединением [10, 13]. Показано, что экспозиция культуры корковых нейронов в растворе NMDA и ингибиторов NOS вызывает снижение нейротоксического действия глутамата [2]. Активация гемоксигеназы приводит к накоплению Fe²⁺, катализирующего свободнорадикальные реакции.

В нашем исследовании показано, что мексидол в конечной концентрации в растворе от 10 до 0,1 мМ снижал уровень МДА в гомогенатах мозга, подвергнутого воздействию L-глутамата. Учитывая, что ведущую роль в патогенезе глутаматной нейротоксичности играют свободнорадикальные реакции, данный эффект можно рассматривать как способность мексидола подавлять эксайтотоксичность глутамата.

При изучении влияния мексидола на узловые звенья данного процесса установлено, что мексидол достоверно подавлял как аскорбатзависимое — неферментативное, так и НАДФН2-зависимое — ферментативное железо-инду­цируемое ПОЛ в гомогенатах мозга. Причем в отличие от кудесана в высоких концентрациях мексидол не оказывал прооксидантного действия. Данные эффекты могут быть связаны как с прямым антиоксидантным действием, т.е. со способностью мексидола непосредственно связывать свободные радикалы, так и с его влиянием на активность антиоксидантных ферментов.

В проведенном исследовании мексидол в высоких концентрациях связывал супероксидный анион-радикал, но по этой способности он значительно уступал классическому антиоксиданту аскорбиновой кислоте. Мексидол не влиял на активность 1-изофермента глутатион-SH-трансферазы и каталазы, однако значительно повышал активность Se-зависимой глутатионпероксидазы. Считается, что утилизируя перекись водорода и органические перекиси, глутатионпероксидаза играет наибольшую роль в защите клеток от гипоксии [9]. Таким образом, данный эффект может лежать в основе выраженного антигипоксического действия изучаемого препарата. Также мексидол умеренно повышал активность СОД. Но, учитывая, что мексидол обладает прямым антисупероксидным действием, т.е. способен непосредственно связывать супер­оксидный анион-радикал, который является субстратом СОД, по-видимому, выявленное умеренное повышение активности СОД связано не со способностью препарата влиять на активность фермента, а с его прямым антирадикальным действием.

При изучении влияния мексидола на активность NOS выявлено, что изучаемый препарат не влиял на активность нейрональной, но умеренно подавлял активность индуцибельной изоформы. Так как при патологических состояниях повышается активность в основном индуцибельной изоформы (отсюда ее название), то данный эффект мексидола может играть существенную роль в повышении резистентности нейронов к гипоксии.

Таким образом, на основе проделанной работы можно заключить, что мексидол в экспериментах in vitro дозозависимо подавляет развитие глутамат-индуцируемой нейротоксичности, дозозависимо подавляет развитие аскорбатзависимого (неферментативного) и НАДФН2-зависимого (ферментативного) железо-индуцируемого ПОЛ, в высоких концентрациях обладает способностью связывать супероксидный анион-радикал, значительно повышает активность Se-зависимой глутатионпероксидазы и умеренно снижает активность индуцибельной iNOS.