Морфометрический анализ гранул серотонина тромбоцитов при мигрени

Серотонин (5-гидрокситриптамин,5-НТ) - биогенный амин с выраженными вазоконстрикторными свойствами - впервые выделен из крови в 1944 г. M. Rapport и соавт. [26]. В 1946 г. M. Rapport [27] установил его химическое строение, а спустя два года Е. Hamlin и Е. Fisher [17] осуществили его синтез. Оказалось, что серотонин является производным индола, близким к триптофану. В 1964 г. A. Dahlstrom и K. Fuxe [15] выявили наличие в головном мозге серотонинергических нейронов. Наибольшая концентрация этих нейронов сосредоточена в ядрах шва ствола мозга, некоторых подкорковых образованиях (хвостатое ядро, скорлупа чечевичного ядра, переднее и медиальное ядра зрительного бугра), промежуточном и обонятельном мозге, амигдале, гипоталамусе, ряде структур, связанных с ретикулярной активирующей системой, и коре больших полушарий [2, 3, 8, 12, 22]. У человека 90% серотонина содержится в энтерохромаффинных клетках слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, 10% - в тромбоцитах [12, 15, 17].

Первые исследования серотонина при мигрени были связаны с упрощенной гипотезой патогенеза заболевания, согласно которой мигренозный приступ является следствием повышенной выработки этого биологически активного вещества [1, 4, 6, 9, 11]. Однако искусственно вызвать приступ мигрени путем внутримышечного введения серотонина не удалось. F. Sicuteri и соавт. [28] показали, что во время приступа мигрени возрастает выделение с мочой метаболитов серотонина, главным образом гидроксиндолуксусной и ванилинминдальной кислот. Австралийскими учеными было установлено, что во время приступа мигрени в крови больных значительно - от 9 до 80% (в среднем на 20%) - падает содержание серотонина [20]. Позже было обнаружено, что колебание концентрации серотонина в плазме крови ассоциировано с клинической динамикой мигренозного приступа, и сформулирована «серотониновая гипотеза» мигрени [1, 12-14, 16, 18, 19, 21].

Увеличение в приступе мигрени концентрации серотонина плазмы связывают с распадом тромбоцитов [25]. Неврологическая симптоматика, характерная для мигренозного приступа, возникает вследствие спазма церебральных сосудов и снижения мозгового кровотока в отдельных участках мозга (в фазе мигренозной ауры), снижения тонуса, избыточного растяжения экстрацеребральных сосудов и раздражения в них болевых рецепторов, периваскулярного отека в собственно алгической фазе. Именно в фазе головной боли наблюдается увеличение экскреции серотонина и его метаболитов с мочой и снижение содержания серотонина в плазме и ликворе [25].

Известно, что тромбоциты крови человека являются адекватной экстрацеребральной моделью серотонинергических нейронов в отношении процессов в серотонинергических синапсах [5]. Тромбоциты крови по фармакологическим, биохимическим и морфоцитологическим свойствам идентичны серотонинергическим нейронам [29]. Поэтому дисфункция тромбоцитарной серотониновой системы обычно сопряжена с соответствующей дисфункцией серотонинергических нейронов мозга [2, 23, 24], что позволяет экстраполировать биохимические процессы, равно как и морфоструктурные изменения, происходящие в тромбоцитах, на аналогичные явления в серотонинергических нейронах.

Ранее гистохимическим методом Фонтана-Массона нами было исследовано количественное содержание гранул серотонина в тромбоцитах периферической крови у больных мигренью в межприступном периоде и во время приступа [12]. В межприступном периоде в 100 тромбоцитах крови выявлено высокое количественное содержание гранул серотонина (469,3±22,4), которое не отличается от этого показателя здоровых лиц из группы контроля (447,9±19,6). На высоте приступа мигрени содержание гранул серотонина в тромбоцитах катастрофически (почти в 10 раз) падает: их количество составляет всего 47,7±7,4 (р<0,001). В качестве иллюстрации приводим цифровые микрофотографии (электронное увеличение в 1350 раз) гранул серотонина в тромбоцитах здорового человека, окрашенных по методу Фонтана-Массона, (рис. 1, А) и больной с мигренью в межприступном периоде (рис. 1, Б), на которых определяются гранулы в большом количестве, и той же больной во время приступа мигрени (рис. 1, В), где визуализирован дефицит гранулярного серотонина.

Во время мигренозного приступа концентрация растворенного в сыворотке крови серотонина, установленная методом иммуноферментного твердофазного анализа с помощью тест-системы ELISA, наоборот, достоверно (р<0,001) повышается - до 345,5±39,1 нг/мл, относительно его концентрации как у здоровых лиц (184,2±12,3 нг/мл), так и больных с мигренью в межприступном периоде (221±28,3 нг/мл). Это свидетельствует о выходе, буквально «бегстве» гранулярного, физиологически малоактивного серотонина тромбоцитов из его гуморального депо в свободный серотонин плазмы крови с одновременным срочным экстрагированием в мочевыделительную систему. Это, очевидно, во многом обусловливает патофизиологический механизм мигрени (кортикальную депрессию Лео, тригеминально-вазомоторную реакцию, отек мозга, асептическое воспаление оболочек и др.) и клинический паттерн мигренозного приступа. Выведение серотонина с мочой проявляется его дефицитом в тромбоцитах, а также плазме крови непосредственно в постприступной фазе мигрени.

Таким образом, наши данные подтверждают феномен выброса во время приступа мигрени депонированного в тромбоцитах эндогенного серотонина в плазму, о чем свидетельствует низкое содержание гранул серотонина в тромбоцитах и увеличение его концентрации в сыворотке крови.

Каскад гранулярного серотонина тромбоцитов во время приступа мигрени не может, очевидно, не отразиться на их морфологических характеристиках, и если они изменяются, можно предположить развитие аналогичных цитоморфологических изменений и нейронального серотонина.

Нами проведена морфометрия гранул серотонина в тромбоцитах периферической крови больных с мигренью во время приступа и межприступном периоде заболевания. В доступной литературе подобных исследований не обнаружено.

Исследуемая группа состояла из 20 больных с мигренью, 14 женщин и 6 мужчин в возрасте 23-47 лет (средний - 34,6±8,0 года), 17 пациентов - с мигренью без ауры, 3 - с аурой. В контрольную группу вошли 10 здоровых лиц аналогичного возраста и пола.

У обследуемых утром натощак из пальца забирали 1-2 капли крови на чистое предметное стекло, предварительно выдержанное в эксикаторе над парами 40% раствора формалина в течение 1-2 мин. Из свежей капли крови готовили мазок, который еще влажным подвергали воздействию паров формалина, а затем фиксировали, проводя над пламенем спиртовки 3-4 раза. Зафиксированный таким образом мазок окрашивали по методу Фонтана-Массона [7, 10]: выдерживали в растворе нитрата серебра при температуре 56-58°С в течение 50-60 мин, затем промывали дистиллированной водой и выдерживали в 5% растворе тиосульфата натрия (5 г щелочного тиосульфата натрия растворяли в 100 мл дистиллированной воды) 4-6 мин. Окрашенный мазок высушивали на воздухе и при 900-кратном увеличении микроскопа просматривали 100 тромбоцитов, подсчитывая в них количество гранул серотонина.

Мазки крови после серебрения исследовали на установке OLIMPUS. Подсчет гранул серотонина проводили в автоматическом режиме обработки изображений с использованием программы Морфология-мастер. Калибровочную шкалу устанавливали со стандартного микрометра, снятого при рабочем инструментальном увеличении (x1350) и занесенного в рабочую программу. Регистрировали площадь, диаметр, длину и ширину гранул серотонина. Результаты фиксировали на цифровой аппарат и обрабатывали на персональном компьютере.

Статистический анализ проводили в помощью непараметрического критерия Вилкоксона для двух зависимых групп.

Количественные показатели морфометрического исследования гранул серотонина тромбоцитов больных с мигренью представлены в таблице.

Мы полагаем, что ферментативные реакции, обеспечивающие в межприступном периоде мигрени процесс экстрагирования серотонина из плазмы крови и накопления его в виде гранул в тромбоцитах (процесс депонирования), а также во время приступа осуществляющие обратную трансформацию серотонина гранулярного в плазменный, имеют однотипное морфологическое отображение.

Таким образом, хотя количественные показатели гранулярного серотонина у больных в межприступном периоде мигрени и здоровых лиц практически идентичны, их морфометрические характеристики имеют различия. Основные средние показатели, характеризующие диаметр и площадь гранул при мигрени, превышают таковые у здоровых лиц: тромбоциты «вынашивают» гранулы серотонина. Во время приступа немногочисленные гранулы серотонина, оставшиеся в тромбоцитах, еще больше увеличивают практически все морфометрические параметры. Это явление отчетливо прослеживается на одном из интегративных морфометрических показателей - средней площади гранул серотонина (см. рис. 2). Следовательно, ферментативные реакции, обеспечивающие в приступе мигрени трансформацию инактивного, депонированного в гранулах серотонина в свободный серотонин плазмы, имеют структурное отображение.