Церебральная микроангиопатия (ЦМА), ассоциированная с возрастом и сосудистыми факторами риска, является ведущей причиной сосудистых и смешанных с дегенерацией когнитивных расстройств (КР), инсультов, нарушений ходьбы и функции тазовых органов [1—6]. МРТ-признаки являются определяющими в диагностике и оценке течения ЦМА [4, 7, 8]. Недавними исследованиями показано, что комбинация признаков и общее бремя ЦМА обладает преимуществом в прогнозировании снижения когнитивных функций [9—12]. В то же время известно, что у больных с ЦМА имеются значительные различия в темпе течения заболевания [13] и характере поражения вещества головного мозга [14, 15], что может быть объяснено гетерогенностью механизмов развития заболевания и его форм. Патофизиология ЦМА окончательно не уточнена [8, 16, 17]. В связи с этим особую значимость приобретают совершенствование МРТ-диагностики ЦМА и исследование механизмов ее развития [7, 18—20], направленные на поиск патофизиологических маркеров прогрессирования заболевания. Одним из направлений в их уточнении является оценка связи МРТ-данных с показателями состава крови, ассоциированными с различными механизмами поражения сосудистой стенки и мозга [16, 21—23]. Мы предположили, что последовательный анализ степени выраженности МРТ-признаков в разных отделах мозга и их сочетания может выявить группы (кластеры) МРТ-признаков, наиболее вероятно обусловленные различиями в механизмах их формирования. В этом случае сопоставление кластеров МРТ-признаков с циркулирующими маркерами поражения сосудов и мозга может помочь дифференцировать патогенетические варианты ЦМА и связанные с ними клинические проявления. Исследовались фактор некроза опухоли-α (TNF-α), трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1), гипоксией индуцируемый фактор 1-α (HIF1-α), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-А), показавшие в проводимом ранее скрининговом исследовании лиц трудоспособного возраста с и без артериальной гипертензии (АГ) связь с формированием МРТ-признаков ЦМА [22]. Их выбор обосновывается доказанным в эксперименте участием в ведущих для развития ЦМА механизмах — повреждении эндотелия и внеклеточного матрикса с последующим ремоделированием сосудистой стенки, а также ролью хронического воспаления с высокой проницаемостью сосудистой стенки в инициировании и поддержании данных процессов [24—27]. Другие клинические исследования значимости данных циркулирующих маркеров поражения сосудистой стенки и мозга немногочисленны. Установлена связь полиморфизма промотора гена TNF-α, ассоциированного с повышением уровня TNF-α, с ишемическим инсультом [28] и уровня TGF-β1 — с прогрессирующим поражением глубокого белого вещества у пациентов с ЦМА [29]. Данные в отношении VEGF противоречивы. Его уровень показал нелинейные взаимоотношения с риском сердечно-сосудистых осложнений: низким — в нижнем и верхнем квартиле значений и высоким — в средних [30], отсутствие связи с выраженностью МРТ-признаков ЦМА у людей среднего возраста [31] при ее наличии у пациентов старшего возраста [17].

Цель исследования — провести кластерный анализ МРТ-признаков ЦМА и уточнить связь выделенных групп с циркулирующими маркерами воспаления и ангиогенеза.

Материал и методы

Обследованы 96 больных с ЦМА (31 мужчина и 65 женщин, средний возраст — 60,91±6,57 года). Критерии включения: возраст 46—70 лет и МРТ-изменения головного мозга, соответствующие ЦМА (лакуны, гиперинтенсивность белого вещества (ГИБВ), расширенные периваскулярные пространства, микрокровоизлияния, атрофия головного мозга) [7]. Больные с ГИБВ стадии Fazekas I (F1)включались в исследование при наличии АГ 2-й и 3-й степени и/или ≥1 лакуны.

Критерии невключения: 1) выраженная деменция; 2) КР вследствие вероятной болезни Альцгеймера [32, 33]; 3) пациенты с малыми субкортикальными инфарктами/лакунами <3 месяцев после острого нарушения мозгового кровообращения; 4) ЦМА вследствие других самостоятельных причин (генетических, воспалительных, тромбофилических, системных, токсических, тяжелой мигрени в анамнезе); 5) наличие иной причины инсульта и сопутствующей патологии вещества головного мозга, кроме ЦМА; 6) атеросклеротический стеноз >50% экстра- или интракраниальных артерий; 7) тяжелая соматическая патология — кардиальная (фракция выброса <50%), эндокринная (сахарный диабет 1-го или 2-го типов с тяжелыми сосудистыми осложнениями, некомпенсированные нарушения функции щитовидной железы), почечная (хроническая болезнь почек при скорости клубочковой фильтрации <30 мл/мин) и др.; 8) противопоказания для МРТ-исследования.

Группа контроля состояла из 21 здорового добровольца (6 мужчин и 15 женщин, средний возраст 57,33±5,19 года) без клинических и МРТ-данных сосудистой и дегенеративной патологии головного мозга.

Всех больных опрашивали о развитии общих и неврологических проявлений заболеваний. Оценивали соматическое состояние, основные сосудистые факторы риска [34], неврологические синдромы. Тяжесть КР устанавливали на основании одновременной оценки когнитивных функций по Монреальской шкале (MoCA) [35] и независимости в повседневной жизни [36]. Деменция диагностировалась при ≤26 баллов по шкале MoCA и зависимости от окружающих, умеренные КР — ≤26 баллов и независимости, субъективные КР — >26 баллов и наличии когнитивных жалоб [35, 36]. Нарушения ходьбы, не связанные с гемипарезом, оценивались по тяжести: легкие — изменения походки только в усложненных пробах (тандемная, фланговая ходьба); умеренные — укорочение длины шага, замедление ходьбы, неустойчивость в усложненных пробах при отсутствии изменений базы, ритма ходьбы и потребности в опоре; выраженные — при четко сформированном лобно-мозжечковом или лобно-подкорковом типах нарушений ходьбы без опоры или непостоянной односторонней опоре; грубые — наличие лобно-мозжечкового или лобно-подкоркового типа нарушений ходьбы с потребностью в одно- или двусторонней опоре.

МРТ и анализ МРТ-данных были проведены у всех пациентов. МРТ головного мозга проводили на магнитно-резонансном томографе Siemens MAGNETOM Verio (Siemens AG, Erlangen, Германия) с величиной магнитной индукции 3 Тл с использованием 12-канальной головной катушки. Для обеспечения стандартов критериев STRIVE в протокол сканирования вошли следующие режимы: 1) Т2-спиновое эхо в аксиальной проекции (time repetition (TR) — 4000 мсек, time echo (TE) — 118 мсек, толщина среза 5 мм, продолжительность 2 мин 2 с); 2) 3D T1-mpr эхо в сагиттальной проекции (TR — 1900 мсек, TE — 2,5 мсек; толщина среза 1 мм; продолжительность: 4 мин 16 сек); 3) 3D FLAIR в сагиттальной проекции (TR — 6000 мсек, TE — 395 мсек; толщина среза 1 мм, продолжительность — 7 мин 12 с); 4) DWI (diffusion-weighted image) в аксиальной проекции (TR — 6600 мсек, TE — 100 мсек, толщина среза 4 мм, 2 b-фактора = 0 и 1000 с/мм², 3 направления диффузии; продолжительность: 2 мин 4 с); 5) SWI (susceptibility-weighted imaging) в аксиальной проекции (TR — 28 мсек, TE — 20 мсек, фазовые и магнитудные изображения с толщиной среза 1,2 мм, а также mIP-изображения с толщиной среза 9,6 мм; продолжительность: 7 мин 50 с).

Визуальный анализ МРТ-признаков ЦМА проводился двумя независимыми нейрорадиологами в соответствии с рекомендациями STRIVE. Общая оценка МРТ-признаков включала анализ выраженности ГИБВ по стадиям Fazekas (F0—F3 стадии), частоты встречаемости у пациентов лакун, микрокровоизлияний, расширенных периваскулярных пространств (>1 мм) в базальных ганглиях, семиовальных центрах и субарахноидальных пространств (атрофия) височных долей.

Для проведения кластерного анализа оценивались МРТ-признаки в различных областях головного мозга по 4-балльной шкале выраженности: 1) лакуны (режимы T1, T2 FLAIR; шкала — «0» — нет, «1» — <5, «2» — 5—10, «3 балла» — >10 лакун) раздельно в белом веществе головного мозга, базальных ганглиях, мозжечке и стволе мозга; 2) ГИБВ (режим T2 FLAIR; шкала — «F0» — нет ГИБВ, «F1» — единичные очаги, «F2» — наличие как единичных, так и частично сливных очагов, «F3» — сливные очаги) в передних и задних отделах лобных, теменных, височных и затылочных долей раздельно по зонам — в юкстакортикальном (до 4 мм от границы коры с белым веществом), перивентрикулярном (до 13 мм от стенки боковых желудочков) и глубоком (зона между перивентрикулярным и юкстакортикальным белым веществом) белом веществе [37]; 3) микрокровоизлияния (режим SWI; шкала — «0» — нет, «1» — <5, «2» — 5—10, «3 балла» — >10 микрокровоизлияний) раздельно в подкорковых структурах и различных отделах головного мозга (передние и задние отделы лобных долей, теменные доли, височные доли, затылочные доли); 4) расширенные периваскулярные пространства (режимы T1, T2 FLAIR; шкала — «0» — отсутствие, «1» — 1 мм, «2» — 2 мм, «3 балла» — 3—4 мм), раздельно в семиовальных центрах и подкорковых структурах; 5) церебральная атрофия (режим T1; шкала «0» — норма, «1» — раскрытие борозд, «2» — снижение объема извилин, «3 балла» — атрофия извилин по типу лезвия ножа) в долях головного мозга [38].

Исследование показателей крови проводилось у 70 больных (23 мужчины и 47 женщин, средний возраст 60,1±6,5 года) и 21 доброволец (6 мужчин и 15 женщин, средний возраст 57,33±5,19 года).

Определяли уровни VEGF-A (Kit BCM Diagnostic, США), TNF-α (Kit BCM Diagnostic, USA), HIF-1α (Kit Cusabio, США), TGF-β1 (Kit Cusabio, США) методом иммуноферментного анализа (ELISA) на плашечном ридере VICTOR 2 (Perkin Elmer, Waltham, MA, США). Взятие венозной крови проводили в утренние часы, натощак, в пробирки вакутейнеры (Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) с активатором свертывания для получения сыворотки. Контроль качества определяемых параметров методом ELISA проводился в дублях с использованием лиофилизированных контрольных сывороток с низким и высоким содержанием исследуемых аналитов.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом. Все обследуемые подписали информированное согласие на проведение исследования и обработку личных данных.

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения IBM SPSS 23.0 (IBM SPSS Statistics, version 23.0, IBM Corp., Armonk, NY, США) и R 3.4.3. (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). В качестве описательной статистики для категориальных и порядковых переменных использовали частоту и долю (%), для количественных переменных — медиану и квартили. Во всех случаях использовали двусторонние варианты статистических критериев. Нулевую гипотезу отвергали при p<0,05.

Частоты категорий качественных переменных по уровням независимых (группирующих) переменных сравнивали при помощи критерия χ² или точного критерия Фишера.

По характеристикам выраженности МРТ-признаков ЦМА в разных отделах мозга был проведен кластерный анализ — иерархический агломеративный метод и итерационный алгоритм k-средних [39]. Данный метод позволяет выявить и сгруппировать повторяющиеся паттерны изменений по нескольким переменным. Проблему неоднородности единиц измерения признаков решали при помощи предварительной стандартизации переменных с вычислением стандартизованного вклада (Z-вклада) по формуле:

где xⁱ — значение данного наблюдения; xⁱ — среднее; σ — стандартное отклонение.

Значения количественных переменных по уровням независимых (группирующих) переменных сравнивали с использованием теста Краскела—Уоллиса с последующими попарными сравнениями по Манну—Уитни с поправкой Бонферрони. Для оценки взаимосвязи количественных переменных между собой использовали корреляционный анализ Спирмена.

Результаты

В табл. 1 представлена общая характеристика пациентов с ЦМА и группы контроля.

Таблица 1. Общая характеристика пациентов с ЦМА и группы контроля

Исследуемые группы были сопоставимы по полу и возрасту. У 83% пациентов с ЦМА была АГ, более тяжелая по сравнению с контрольной группой.

В табл. 2 приведена характеристика основных клинических синдромов и МРТ-признаков у пациентов с ЦМА.

Таблица 2. Характеристика основных клинических синдромов и МРТ-признаков у пациентов с ЦМА

Результаты оценки лакун, ГИБВ, микрокровоизлияний по 4-балльной шкале выраженности представлены на рис. 1.

Рис. 1. МРТ-признаки ЦМА: частота встречаемости и выраженность по 4-балльной шкале в исследуемых отделах мозга.

а — ГИБВ; б — микрокровоизлияния; в — лакуны. Слева на схемах а, б, в — базальные ганглии, справа на схемах а, б от наружной поверхности мозга — юкстакортикальное, глубокое белое вещество и перивентрикулярное белое вещество, в — белое вещество.

* — для ГИБВ и микрокровоизлияний в исследуемых отделах белого вещества частота встречаемости менее 10% на диаграммах не приведена.

Полученные данные были использованы для проведения иерархического кластерного анализа МРТ-признаков ЦМА. Результаты представлены на дендрограмме (рис. 2), отображающей все полученные кластеры, а также их вложенность относительно друг друга. Использовался итерационный метод k-средних, использующий минимизацию суммарного квадратичного отклонения точек кластеров от центров этих кластеров и выделение кластеров на основе визуального анализа. На рис. 2 горизонтальная линия обрезает дендрограмму на уровне максимального разделения кластеров, визуально выделяя два кластера.

Рис. 2. Дендрограмма иерархической классификации пациентов.

По оси абсцисс — объединяемые объекты, по оси ординат — близость кластеров.

Два пациента не распределились ни в один из кластеров из-за ограничений их протокола сканирования. В первый кластер вошли 18 пациентов с ГИБВ стадии F3; во второй — 76 пациентов с ГИБВ разных стадий — F3 — 22, F2 — 28 и F1 — 26 пациентов. Неравномерное распределение пациентов между кластерами ограничивало последующие этапы статистического анализа, в связи с чем сопоставление кластеров проводилось между пациентами с ГИБВ стадии F3. Кластеры были обозначены как МРТ-тип 1-й и 2-й стадии F3. МРТ-тип 1 (n=18; 6 женщин, средний возраст — 59,1±6,8 года) и тип 2 (n=22, 15 женщин, средний возраст — 63,5±6,2 года) не различались между собой по возрасту, полу, тяжести АГ, наличию других факторов риска.

В МРТ-типе 1 по сравнению с МРТ-типом 2 отмечалось значимое (p<0,05) преобладание выраженной перивентрикулярной ГИБВ во всех отделах полушарий мозга, стволе, подкорковых структурах; множественных лакун и микрокровоизлияний во всех отделах; атрофии. Во 2-м типе стадии F3 ЦМА преобладали перивентрикулярная височно-теменная или юкстакортикально-глубокая ГИБВ, лакуны в белом веществе полушарий, расширенные периваскулярные пространства в проекции базальных ядер при отсутствии микрокровоизлияний (рис. 3).

Рис. 3. Характерные изменения МРТ-типов 1-й и 2-й стадии F3.

А. МРТ-тип 1: а, б — распространенная с вовлечением перивентрикулярных отделов ГИБВ и лакуны в белом веществе; в — лакуны в базальных ядрах, г — распространенные множественные микрокровоизлияния; Б. МРТ-тип 2: а — перивентрикулярная и глубокая ГИБВ в височных отделах; б — распространенная глубокая и юкстакортикальная ГИБВ; в — лакуны в белом веществе; г — расширенные периваскулярные пространства в базальных ганглиях.

Пациенты с МРТ-типом 1 по сравнению с пациентами с МРТ-типом 2 имели более тяжелые КР (p=0,006) и нарушения ходьбы, не связанные с гемипарезом (p=0,01).

Формирование МРТ-типов было связано с уровнем TNF-α (p=0,039), VEGF-A (p=0,016), но не TGF-β1 (p=0,141), HIF-1α (p=0,110). Проведенные сопоставления уровня данных показателей крови между пациентами МРТ-типов 1 и 2, контролем и выявленные значимые различия приведены на рисунке 4. По сравнению с контролем пациенты МРТ-типа 1 характеризовались снижением уровня VEGF-A (p=0,013), МРТ-типа 2 — повышением TNF-α (p=0,034). Имелась тенденция к различиям между МРТ-типами 1 и 2 в уровне TNF-α и VEGF-A.

Рис. 4. Сравнительный анализ уровня VEGF-А и TNF-α между пациентами МРТ-типов 1 и 2 и контролем.

Установлены корреляции уровней TNF-α с TGF-β1 (R=0,378, p=0,000) и HIF-1α (R=0,220, p=0,035); VEGF-A с HIF-1α (R=0,237, p=0,023).

Обсуждение

Определяющая роль МРТ-признаков в диагностике ЦМА [7,8], преимущества оценки комбинации МРТ-признаков для характеристики поражения мозга и клинических проявлений [9—12], различия в характере поражения вещества головного мозга [14, 15] и течении ЦМА [13] явились основанием для предположения о возможном группировании МРТ-признаков на основе патогенетической однородности механизмов их развития. Степень выраженности МРТ-признаков в разных отделах мозга была оценена по балльной шкале и с помощью кластерного анализа проверена их сочетаемость. Отделы белого вещества были разделены в соответствии с особенностями кровоснабжения белого вещества [40, 41] и классическим делением мозга на доли, что в целом совпало с используемым анатомическим делением белого вещества у пожилых [37]. Выделенные кластеры МРТ-признаков стадии F3, условно обозначенные как МРТ-типы 1 и 2, имели значимые различия в нейровизуализационном профиле (см. рис. 3). Подтверждением того, что данные МРТ-типы связаны с доминированием определенных патологических механизмов, а не являются стадиями заболевания, могут служить значимые различия в тяжести их клинических проявлений при отсутствии различий в выраженности основных факторов риска ЦМА — АГ и возраста. Вследствие этого установленные при МРТ-типах 1 и 2 характерные изменения в уровне циркулирующих маркеров крови могут свидетельствовать о значении ассоциированных с ними механизмов в повреждении сосудов и мозга при данных типах.

Характерное для МРТ-типа 1 снижение уровня VEGF-A наиболее вероятно соответствует серьезному и распространенному повреждению сосудистой стенки с нарушением аутокринного синтеза VEGF-A эндотелиальными клетками и их гибелью [42]. Это согласуется с более тяжелыми МРТ-изменениями и клиническими проявлениями, чем при МРТ-типе 2. Возможность такого исхода имеет морфологические подтверждения [43]. VEGF-A является ведущим фактором ангиогенеза, регулирующим в том числе пролиферацию, выживание и миграцию эндотелиальных клеток, проницаемость сосудов [44]. Полученные нами данные о связи снижения VEGF-A с формированием определенного нейровизуализационного профиля могут быть одним из объяснений противоречивых взаимоотношений VEGF-A с ЦМА [17, 30, 31, 45, 46]. Наиболее вероятно, что отсутствие изменений в уровне VEGF-A у пациентов МРТ-типа 2 по сравнению с контролем свидетельствует о достаточной сохранности эндотелия, что поддерживается менее тяжелыми нейровизуализационными и клиническими проявлениями. В исследовании установлена прямая корреляция VEGF-A с HIF-1α (R=0,237, p=0,023). Это согласуется с установленной в эксперименте ролью HIF-1α —ключевого фактора транскрипции при гипоксии [47], в VEGF-опосредованном нарушении целостности и повышении проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [48, 49] и в целом данного механизма в развитии ЦМА [25, 50].

Выявленное при МРТ-типе 2 повышение TNF-α указывает на значение данного основного системного провоспалительного цитокина [51—54] в поражении сосудов и мозга с формированием характерных для данного типа МРТ-изменений. В эксперименте показана связь повышения TNF-α с увеличением проницаемости ГЭБ, отеком тканей, воспалением, гибелью олигодендроцитов и деструкцией основного белка миелина [55—59]. Установлено, что активация TNF-R1 сопряжена с NF-κB и протеинкиназным провоспалительным, цитотоксическим и апоптозным ответом; TNF-R2 — с активацией, пролиферацией и миграцией клеток [53, 54]. Подобно другим цитокинам TNF-α может путем трансцитоза преодолевать даже неповрежденный ГЭБ [60]. Установленное значение TNF-α-опосредованных реакций в формировании МРТ-изменений 2-го типа согласуется с данными исследований, показавшими, что повреждение белого вещества является не просто следствием хронической гипоксии, а вызвано и поддерживается провоспалительной окружающей средой [61]. Ранее нами у больных молодого возраста с МРТ-признаками ЦМА была установлена независимая от АГ связь TNF-α с ГИБВ, что позволило предположить самостоятельное значение опосредованных TNF-α реакций в развитии ранней ЦМА [22]. Нельзя исключить потенциальную связь МРТ-типа 2 в последующем развитии смешанной деменции. МРТ-изменения при МРТ-типе 2 по сравнению с МРТ-типом 1 среди прочих различий свидетельствовали о меньшем поражении лентикулостриарных артерий и передних отделов мозга, характерных для классической гипертензивной ЦМА с ишемическим субкортикальным поражением [1]. TNF-α-опосредованное воспаление признано одним из значимых механизмов индукции болезни Альцгеймера (БА), а анти-TNF-α терапия продемонстрировала уменьшение патологических изменений в мозге на моделях БА у грызунов, а также замедление когнитивного снижения и улучшение повседневной деятельности у пациентов с БА [62]. Полученная прямая корреляция между TNF-α и TGF-β1 (R=0,378, p=0,000) может свидетельствовать о взаимозависимости процессов с участием данных циркулирующих маркеров. TGF-β-сигнальный путь является общим в патогенезе ЦМА и БА [63, 64], в связи с чем может быть одним из звеньев, опосредующих развитие смешанных с дегенерацией КР. Так, сверхэкспрессия TGF-β в астроцитах грызунов вызывала изменения в мелких сосудах, подобные тем, которые были обнаружены у пациентов с БА [65]. Они в том числе характеризовались утолщением базальных мембран, дегенерацией капилляров с образованием струнных сосудов [66]. Установлено участие TGF-β1 в таких значимых для ЦМА механизмах, как повреждение ГЭБ [67], повышении жесткости и ремоделировании артерий [68—70], а также в развитии прогрессирующего поражения глубокого белого вещества у больных с ЦМА [29]. Интересным является тот факт, что уровень HIF-1α коррелировал со значимыми для обоих МРТ-типов биомаркерами — с VEGF-A при типе 1 и с TNF-α при типе 2, подтверждая универсальную роль гипоксии в запуске и поддержании повреждения сосудистой стенки при ЦМА [25].

Таким образом, оценка степени выраженности МРТ-признаков в разных отделах мозга и их группирование в кластеры признаков позволили выделить МРТ-типы ЦМА стадии F3, предполагаемо связанные с доминированием разных механизмов поражения сосудов и мозга. МРТ-типы различаются между собой по уровню циркулирующих маркеров поражения сосудистой стенки и клиническим проявлениям ЦМА, что доказывает патогенетическую гетерогенность ЦМА и объясняет разную степень выраженности КР и нарушений ходьбы на стадии F3 у разных больных. МРТ-тип 1 с более тяжелыми клиническими проявлениями — распространенными ГИБВ, в том числе перивентрикулярных отделов, лакунами, микрокровоизлияниями и атрофией — связан со снижением VEGF-A, что может соответствовать тяжелому поражению сосудистой стенки с гибелью эндотелия. МРТ-тип 2 с более легкими клиническими проявлениями — преимущественно с распространенной юкстакортикальной и глубокой ГИБВ, лакунами в белом веществе, отсутствием микрокровоизлияний и атрофии — связан с повышением TNF-α, что позволяет предполагать в его формировании доминирующую роль воспаления с увеличением проницаемости ГЭБ и ремоделированием сосудистой стенки.

Исследование установило диагностическую и патогенетическую ценность дифференцирования МРТ-типов. Это обосновывает совершенствование критериев их диагностики и уточнение ведущих механизмов формирования для определения патогенетически обоснованной профилактики и лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.