Роль стрессового фактора в реализации генетической предрасположенности к развитию инсульта на фоне гипертонической болезни

В Российской Федерации ежегодно регистрируется свыше 400 тыс. случаев инсульта, при этом смертность от цереброваскулярных заболеваний в нашей стране является самой высокой среди европейских государств [1]. Ишемический инсульт — это острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождающееся гипоксией и некрозом тканей головного мозга и ведущее к неврологическому дефициту [2]. При инсульте запускается каскад нейровоспалительных реакций, ключевым моментом которых является высвобождение матриксных металлопротеиназ (ММР), отвечающих за деградацию компонентов внеклеточного матрикса [3]. В предыдущих исследованиях показано, что уровень экспрессии генов ММР коррелирует с развитием мозгового инсульта [4]. Наряду с генетическими факторами в развитие инсульта вовлечены средовые факторы, среди которых важная роль отводится хроническому эмоциональному стрессу [5, 6]. Согласно эпидемиологическим исследованиям длительное психоэмоциональное напряжение приводит к изменению биохимического состава и содержания электролитов в крови, тромбообразованию и угнетению иммунной системы [6, 7]. Целью настоящего исследования было изучение роли хронического стресса в реализации генетической предрасположенности к инсульту на фоне гипертонической болезни (ГБ).

Проведен анализ результатов обследования 830 пациентов: 1-я группа — 303 больных с ишемическим инсультом на фоне ГБ; 2-я группа — 527 больных с ГБ, не имеющих нарушений мозгового кровообращения в анамнезе. Формирование выборки осуществляли в период с 2013 по 2016 г. в неврологическом и кардиологическом отделениях Белгородской областной клинической больницы (БОКБ) Святителя Иоасафа. Среди больных с инсультом атеротромботический подтип зарегистрирован у 124 (40,93%) пациентов, кардиоэмболический — у 72 (23,76%), гемодинамический — у 78 (25,74%), лакунарный — у 29 (9,57%). Среди обследуемых не было пациентов с артерио-артериальными эмболиями и инсультом по типу гемореологической микроокклюзии. В исследуемые выборки включали неродственных лиц русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России [8]. Критериями включения в анализируемые группы были систолическое артериальное давление (АД) ≥140 мм рт.ст. и/или диастолическое АД≥90 мм рт.ст., а также прием пациентами антигипертензивных препаратов; критериями невключения — наличие симптоматических и вторичных гипертензий, печеночной и почечной недостаточности, отказ от участия в исследовании. Диагноз «ишемический инсульт» устанавливали на основании данных неврологического статуса, жалоб пациента, компьютерной/магнитно-резонансной томографии головного мозга. ГБ диагностировали в соответствии с диагностическими рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов [9]. Для всех включенных в исследование, рассчитывали индекс массы тела (ИМТ, кг/м²), определяли уровни общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой (ХС-ЛПВП) и низкой (ХС-ЛПНП) плотности, триглицеридов (ТГ). Образцы крови для биохимического анализа отбирали после 8-часового голодания, анализы проводили в БОКБ Святителя Иоасафа. У всех респондентов оценивали наличие хронических стрессоров, под которыми в соответствии с работой [10] понимали следующие психосоциальные факторы: частые стрессовые ситуации дома и/или на работе, отсутствие социальной поддержки, семейное положение (одинокие, разведенные, овдовевшие), неудовлетворительный социально-экономический статус.

Характеристика обследованных групп представлена в табл. 1 и 2.

Как в группе подверженных стрессу пациентов, так и в группе больных, не имеющих хронических стрессов, пациенты с инсультом на фоне ГБ и с ГБ без инсульта были сопоставимы по полу, возрасту, ИМТ и показателям липидного профиля (p>0,05). При этом обследуемые пациенты в обеих группах значимо отличались по показателям АД (р<0,05).

Генетический анализ. Всем больным проводили генотипирование восьми полиморфных локусов rs1799750 MMP1, rs243865 MMP2, rs3025058 MMP3, rs11568818 MMP7, rs1320632 MMP8, rs11225395 MMP8, rs17577 MMP9, rs652438 MMP12. Отбор полиморфизмов для исследования соответствовал описанным ранее критериям [11]. Все выбранные полиморфные маркеры характеризуются значимым регуляторным потенциалом и влиянием на экспрессию генов (согласно базе данных HaploReg (v.4.1.) http://archive.broadinstitute.org).

Забор венозной крови из локтевой вены обследуемого осуществляли в пластиковые пробирки Vacutaine с ЭДТА объемом 5 мл. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфизмов проведен методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (real-time PCR) на термоциклере CFX-96 Real-Time System («Bio-Rad», США) с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных ООО «Синтол». Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены в работах А. Liеvre и соавт. и P. Prаdhаn-Pаlikhe и соавт. [12, 13]. Повторное генотипирование 5% образцов, рандомным образом выбранных из групп обследованных пациентов, показало 100% воспроизводимость.

Оценка функционального значения полиморфизмов. Регуляторный потенциал SNP определяли при помощи онлайн-сервиса HaploReg (vers4.1) (https://pubs.broadinstitute.org). Ассоциации аллелей полиморфизмов с аффинностью мотива ДНК к транскрипционным факторам оценивали по разнице между LOD scores альтернативного (alt) и референсного (ref) аллелей [14]. Влияние SNP на экспрессию генов (cis-eQTL) анализировали по данным проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) (http://www.gtexportal.org/). Характер связи аллелей с уровнем транскрипции генов определяли по β-коэффициенту линейной регрессии, который характеризует изменение нормализованного показателя генной экспрессии на один alt-аллель. Использовали результаты с p<8·10^–5, p_FDR≤0,05 [15].

Проведение данного исследования было одобрено этическим комитетом медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета; информированное согласие получено от всех субъектов.

Статистический анализ. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди—Вайнберга проводили с использованием критерия χ². Частоты аллелей и генотипов в группах пациентов с инсультом и без инсульта анализировали при помощи таблиц сопряженности 2×2 с использованием критерия χ² с поправкой Йейтса на непрерывность. Расчеты проводили в программе Statistica for Windows 10.0. Характер ассоциаций SNP и стресса с формированием инсульта на фоне ГБ оценивали с использованием показателя отношения шансов (ОШ) и его 95% доверительного интервала (95% ДИ), различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Распределение частот аллелей и генотипов в 1-й и 2-й группах для всех изученных полиморфизмов соответствовало равновесию Харди—Вайнберга (p>0,05). Результаты анализа представлены в табл. 3, достоверных

Проведен анализ взаимодействия полиморфизмов ММР и хронических стрессов при формировании ишемического инсульта на фоне ГБ, результаты представлены в табл. 4.

Примечательно, что в формирование инсульта на фоне ГБ у подверженных стрессу лиц и пациентов, не подверженных хроническим стрессорам, вовлечены разные полиморфные локусы ММР. Установлено, что среди больных с ишемическим инсультом, подвергающихся регулярному стрессу, частота гомозигот GG по локусу rs11568818 MMP7 достоверно выше (χ²=3,89; р=0,04), чем в группе пациентов с ГБ без инсульта. Таким образом, аллель G rs11568818 повышает риск развития инсульта у больных ГБ, подверженных стрессу (OШ 1,71, 95% ДИ 1,00—2,92). В группе пациентов с ГБ, не подверженных хроническим стрессорам, частота аллеля 5А (χ²=5,43; р=0,02) и генотипа 5А/5А (χ²=4,34; р=0,04) по локусу rs3025058 MMР3 достоверно выше, чем у больных с инсультом. Эти генетические варианты оказывают протективное влияние при формировании ишемического инсульта на фоне ГБ (OШ 0,73 и OШ 0,60 соответственно). Наблюдаемые генно-средовые взаимодействия полиморфных локусов ММР и хронических стрессоров при формировании инсульта могут быть обусловлены способностью матриксинов к протеолитическому расщеплению молекул клеточной адгезии, которые модулируют нейрональную пластичность и играют ключевую роль в стресс-идуцированных адаптациях [16]. Важное модифицирующее влияние стрессового фактора при развитии ишемического инсульта демонстрируется и в других исследованиях. Результаты 6 когортных исследований (общее число участников 138 782), проанализированные группой ученых из КНР, свидетельствуют, что регулярный стресс на работе ассоциирован с высоким риском развития ишемического инсульта (ОШ 1,58, 95% ДИ 1,12—2,23) [5]. Согласно данным литературы хронический стресс вызывает нарушение работы гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и дисбаланс симпатической и парасимпатической регуляции, что приводит к развитию цереброваскулярной патологии [7].

Анализ функционального значения ассоциированных с развитием инсульта полиморфных локусов показал, что SNP rs11568818 гена MМР7 расположен в области, гиперчувствительной к действию ДНКазы-1 в эндотелиоцитах, нейроглии, гемопоэтических стволовых клетках, фибробластах, нормальных и патологически измененных эпителиальных клетках. Этот локус относится к области связывания с модифицированными белками-гистонами (Н3K4me1 и H3К4mе3), маркирующими промоторы в 4 тканях (в том числе в гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клетках, астроцитах и нейрональных клетках-предшественниках) и энхансеры в 7 тканях (в том числе в черной субстанции, хвостатом ядре и гиппокампе). SNP rs11568818 локализован в регионе присоединения регуляторных белков с-FОS, с-Jun и TВP, а также входит в состав регуляторных мотивов ДНК, связывающихся с 4 факторами транскрипции. Выявлено, что генетический вариант G по данному локусу, ассоциированный с высоким риском развития инсульта, повышает сродство к факторам транскрипции Foxa known-1 (ΔLОD scores = –3,1), РLZF (ΔLОD scores = –1,5), Pоu5f1 known-2 (ΔLОD scores = –3,2) и снижает сродство к GR known4 (LОD scores = 0,8) (https://pubs.broadinstitute.org). При анализе in siliсo установлено, что «рисковый» аллель G полиморфного локуса rs11568818 MМР7 связан со снижением уровня экспрессии соответствующего гена в поджелудочной железе (β= –0,31, р=5,1·10^–11, FDR ≤0,05), легких (β= –0,35, р=8,1·10^–14, FDR ≤0,05), коже (β= –0,23, р=3,9·10^–8, FDR ≤0,05), желудке (β= –0,32, р=1,9·10^–6, FDR ≤0,05), печени (β= –0,46, р=1,2·10^–5, FDR ≤0,05). Согласно базе GeneCards ген ММР7 локализован на хромосоме 11 и кодирует протеолитический фермент, расщепляющий эластин, желатины типа I, III, IV, V, фибронектин. Протеиназа ММР7 участвует в ремоделировании экстрацеллюлярного матрикса, пролиферации клеток, регенерации поврежденных тканей, обеспечивает миграцию и апоптоз клеток (httр://www.genecards.оrg/). Выявленные эпигенетические эффекты полиморфного локуса гена MMP7 и функции соответствующей пептидазы могут лежать в основе установленной ассоциации с формированием ишемического инсульта. В доступной литературе нами не было обнаружено ассоциативных исследований, посвященных анализу вовлеченности SNP rs11568818 в развитие ишемического инсульта, однако имеются сведения об ассоциациях данного локуса с сердечно-сосудистой патологией у жителей Швеции [17].

Однонуклеотидный полиморфизм rs3025058 MMР3, по данным базы HaploReg (vers4.1), локализован в регионе гистонов H3K4me1, которые кодируют энхансеры в клетках мезенхимы и эпителиоцитах. Этот локус располагается в районе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в вилочковой железе и в области регуляторных ДНК-мотивов, в которых происходит связывание с двумя факторами транскрипции. Выявлено, что аллель 6А снижает аффинность к транкрипционным факторам Ciz (ΔLОD scores = 1,3) и Gfi-1b (ΔLОD scores = 1,7). Согласно базе данных GеneCаrds ген ММР3 кодирует одноименный фермент, способный гидролизовать фибронектин, ламинин, протеогликаны, коллагены, желатины типов I—V (http://www.genecards.org/). Уровень экспрессии ММР3 регулируется цитокинами, факторами роста и повышается при атерогенезе, онкогенезе и регенерации тканей после повреждения. Полученные в настоящем исследовании результаты согласуются с данными других ассоциативных исследований: R. Sherva и соавт. [18] установлено, что у американцев с генотипом 5А/5А по локусу rs3025058 гена MMP3 риск развития ишемического инсульта достоверно ниже, чем у носителей генотипов 5А/6А и 6А/6А (ОШ 0,51, 95% ДИ 0,31—0,85, р=0,01).

Таким образом, результаты работы свидетельствуют о значимой роли взаимодействия полиморфных локусов ММР со стрессом при формировании ишемического инсульта на фоне Г.Б. Фактором риска развития заболевания у подверженных хроническим стрессорам пациентов является генотип GG rs11568818 гена MМР7 (OШ 1,71). Протективное значение для развития инсульта у лиц, не подвергающихся хроническим стрессорам, имеют аллель 5А (OШ 0,73) и генотип 5А/5А (OШ 0,60) rs3025058 гена ММР3. Эти полиморфные локусы характеризуются значимым регуляторным потенциалом (расположены в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в культуре клеток, предшественников нейронов и мезенхимных клеток и др., области регуляторных мотивов ДНК, участках связывания с транскрипционными факторами), а SNP rs11568818 связан с уровнем экспрессии гена MМР7 в печени, легких, поджелудочной железе и других органах.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведенияобавторах:

Москаленко М.И. — e-mail: mariam31011989@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-0769-4095

Пономаренко И.В. — e-mail: ponomarenko_i@bsu.edu.ru; https://orcid.org/0000-0002-5652-0166

Полоников А.В. — e-mail: polonikov@bsu.edu.ru; https://orcid.org/0000-0001-6280-247X

Жернакова Н.И. — e-mail: zhernakova@bsu.edu.ru

Ефремова О.А. — e-mail: efremova@bsu.edu.ru; https://orcid.org/0000-0002-6395-1626

Чурносов М.И. — e-mail: churnosov@bsu.edu.ru; https://orcid.org/0000-0003-1254-6134

Автор, ответственный за переписку: Москаленко Мария Ивановна — e-mail: mariam31011989@yandex.ru