Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Васильева И.Н.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова», Санкт-Петербург

Вознюк И.А.

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Беспалов В.Г.

Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, Санкт-Петербург

Содержание низкомолекулярной ДНК в плазме крови и цереброспинальной жидкости у больных с острым нарушением мозгового кровообращения

Авторы:

Васильева И.Н., Вознюк И.А., Беспалов В.Г.

Подробнее об авторах

Просмотров: 610

Загрузок: 7


Как цитировать:

Васильева И.Н., Вознюк И.А., Беспалов В.Г. Содержание низкомолекулярной ДНК в плазме крови и цереброспинальной жидкости у больных с острым нарушением мозгового кровообращения. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2015;115(9‑2):51‑54.
Vasilyeva IN, Vozniuk IA, Bespalov VG. Low-molecular-weight DNA in blood plasma and cerebrospinal fluid of patients with acute stroke. S.S. Korsakov Journal of Neurology and Psychiatry. 2015;115(9‑2):51‑54. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/jnevro20151159251-54

Рекомендуем статьи по данной теме:
Моз­го­вой ней­рот­ро­фи­чес­кий фак­тор при ише­ми­чес­ком ин­суль­те в ос­тром и ран­нем вос­ста­но­ви­тель­ном пе­ри­одах: роль ноч­ной ги­пок­се­мии. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(5-2):72-78
Ин­ди­ка­то­ры ког­ни­тив­ных на­ру­ше­ний раз­лич­ной сте­пе­ни тя­жес­ти в ос­тром пе­ри­оде ише­ми­чес­ко­го ин­суль­та. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(8-2):14-20
Рас­простра­нен­ность и фак­то­ры рис­ка внут­ри­че­реп­но­го нет­рав­ма­ти­чес­ко­го кро­во­из­ли­яния у но­во­рож­ден­ных. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(8-2):26-30
Пов­тор­ные ише­ми­чес­кие ин­суль­ты при ин­фек­ци­он­ном ар­те­ри­ите обе­их внут­рен­них сон­ных и ба­зи­ляр­ной ар­те­рий как ос­лож­не­ние сфе­но­иди­та и оти­та. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(8-2):31-37
Кли­ни­чес­кие слу­чаи ус­пеш­ной тром­бэкстрак­ции при ише­ми­чес­ком ин­суль­те, ас­со­ци­иро­ван­ном с но­вой ко­ро­на­ви­рус­ной ин­фек­ци­ей COVID-19. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(8-2):38-46
К воп­ро­су об оп­ти­ми­за­ции бел­ко­во­го и энер­ге­ти­чес­ко­го обес­пе­че­ния па­ци­ен­тов с ос­трым на­ру­ше­ни­ем моз­го­во­го кро­во­об­ра­ще­ния. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(8-2):51-55
Па­то­ге­не­ти­чес­кие ос­но­вы раз­ви­тия ат­ро­фии зри­тель­но­го нер­ва при ток­си­чес­ком по­ра­же­нии ме­та­но­лом. Вес­тник оф­таль­мо­ло­гии. 2024;(2):91-96
Ме­то­ды эко­но­ми­чес­кой оцен­ки эф­фек­тив­нос­ти ле­че­ния эн­до­вас­ку­ляр­но­го зак­ры­тия от­кры­то­го оваль­но­го ок­на для вто­рич­ной про­фи­лак­ти­ки крип­то­ген­но­го ин­суль­та. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(6):105-110
Прог­но­зи­ро­ва­ние рис­ка сни­же­ния ова­ри­аль­но­го ре­зер­ва пос­ле хи­рур­ги­чес­ко­го ле­че­ния па­ци­ен­ток с глу­бо­ким ин­фильтра­тив­ным эн­до­мет­ри­озом с ис­поль­зо­ва­ни­ем ис­кусствен­но­го ин­тел­лек­та. Рос­сий­ский вес­тник аку­ше­ра-ги­не­ко­ло­га. 2024;(3):92-102
Вза­имос­вязь обес­пе­чен­нос­ти вра­ча­ми про­филь­ных ста­ци­она­ров и от­де­ле­ний с ле­таль­нос­тью от ин­фар­кта ми­окар­да и моз­го­во­го ин­суль­та. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(7):30-37

Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) занимают 2-е место по уровню смертности, уступая лишь кардиальной патологии. В России смертность от инсульта составляет 175 случаев на 100 000 населения. По данным Национальной ассоциации по борьбе с инсультом, 31% пациентов, перенесших инсульт, нуждаются в специальном уходе, 20% не могут самостоятельно передвигаться и только 8% возвращаются к прежней полноценной жизни. Среди мужчин трудоспособного возраста заболеваемость ОНМК в 2 раза выше, чем среди женщин [1, 2]. Расходы на лечение больных с ОНМК достигают 20% всех затрат на здравоохранение.

Исход ОНМК во многом определяется своевременностью и адекватностью лечения, которое включает комплекс неотложных мероприятий, кардинально различающихся у больных с ишемическим (ИИ) и геморрагическим (ГИ) инсультом [3]. Авторы немногочисленных исследований отмечают предиктивное значение определения внеклеточной ДНК (внкДНК) в течение 6 нед после ОНМК [4—6]. Значительное увеличение содержания внкДНК у больных с инсультом в совокупности с другими клиническими данными указывает на вероятность раннего летального исхода и коррелирует с неврологическим статусом больного [4]. Снижение содержания нуклеосомной внкДНК считают одним из показателей, указывающих на спонтанное неврологическое улучшение и позволяющих идентифицировать пациентов, не нуждающихся в дальнейшей интенсивной терапии [6].

В организме внкДНК циркулирует в виде ограниченных мембранами везикул разного диаметра, включающих апоптозные тельца и экзосомы, секретируемые различными клетками. Фракционный анализ позволяет обнаружить в составе внкДНК высокомолекулярную и низкомолекулярную нуклеосомную фракцию, за счет образования которой и происходит увеличение содержания внкДНК [7]. При электрофоретическом разделении образца внкДНК плазмы крови пациента высокомолекулярная фракция расположена в верхней части геля, а низкомолекулярная фракция внкДНК в виде пятна находится в нижней части геля. Фрагменты низкомолекулярной внкДНК (нмвнкДНК) соответствуют размерам нуклеосомы, 160—180 пар нуклеотидов (п.н.). Выделение такой ДНК в бесклеточную часть крови и другие биологические жидкости вызвано процессами апоптоза [8]. Увеличение содержания внкДНК наблюдают и при других заболеваниях и состояниях, связанных с усилением апоптоза: при воздействии ионизирующей радиации, низкочастотного шума [9], травме [10], сепсисе с выраженным системным поражением [11], тяжелых физических нагрузках [12].

Цель настоящей работы — оценить значение низкомолекулярной ДНК в плазме крови и ЦСЖ для диагностики ОНМК ишемического и геморрагического типов в ранние сроки после начала заболевания.

Материал и методы

В исследование включали больных с ОНМК, мужчин и женщин в возрасте 46 — 67 лет, поступивших в стационар через 3, 6, 12, 24, 48 и 72 ч после начала заболевания. Пациенты были разделены на 2 группы по 8 человек в каждой в зависимости от типа инсульта — ГИ или И.И. Исследовали также ЦСЖ, полученную при люмбальной пункции 38 больных с ИИ, поступивших в стационар в различные сроки от начала заболевания (2—24 ч, 2—7 сут, 2—3 нед, более 3 нед). Показатели нормы получены при обследовании 23 здоровых доноров, мужчин и женщин в возрасте 26—76 лет. Здоровые были разделены по возрастным группам: 25—45 лет — 9 обследованных, 46—70 лет — 14.

Кровь у обследуемых в количестве 3 мл брали путем венепункции в пробирки, содержащие ЭДТА. Плазму отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 810 g и 4 °C в бакет-роторе. Для полного удаления форменных элементов плазму центрифугировали дважды при 2200 g. Нуклеиновые кислоты из плазмы крови и ЦСЖ выделяли методом фенольной депротеинизации. Осадки нуклеиновых кислот растворяли в деионизированной воде из расчета 1 мкл на 1 мл плазмы крови. Раствор нуклеиновых кислот хранили для дальнейших исследований при –70 °С. Полученный препарат инкубировали с РНКазой и анализировали методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (2/16%) в 0,04 М трис-ацетатном буфере (рН 7,7), содержащем 0,1 М ЭДТА. Для идентификации исследуемых фракций использовали маркеры-рестрикты PBR322/BspR1 и λ/Alu1, наносимые в количестве 1 мкг/мкл. Гели фотографировали в проходящем УФ, содержание нмвнкДНК определяли путем сравнения со стандартами [13].

Результаты

Исследования показали, что в плазме крови здоровых содержание нмвнкДНК находится в пределах 31,4±6,8 нг/мл плазмы крови и зависит от возраста обследуемого (табл. 1). Данные свидетельствуют о том, что у молодых людей в среднем содержание нмвнкДНК несколько ниже, чем у пожилых, однако различия недостоверны. По-видимому, это связано с ингибированием процессов апоптоза под действием ростовых факторов. Возрастная группа 46—75 лет соответствует возрасту обследованных пациентов с ОНМК и принята как норма.

Таблица 1. Содержание нмвнкДНК (M±m) в плазме крови здоровых доноров

Обнаружено, что в плазме крови больных с ОНМК в течение 3 сут после начала заболевания наблюдается повышение уровня нмвнкДНК (см. рисунок). Однако динамика изменения содержания нмвнкДНК различается при ишемическом и геморрагическом типах ОНМК. При И.И. уровень нмвнкДНК не превышает уровня нормы в течение 3—12 ч после начала заболевания, достигает максимума через 24 ч, остается повышенным через 48 ч и снижается через 72 ч. При Г.И. максимальное содержание нмвнкДНК наблюдалось через 3 ч после начала заболевания, оставалось повышенным через 6 ч и далее снижалось до полного исчезновения из кровяного русла через 72 ч. Установлено, что у больных с ОНМК геморрагического типа максимальное значение нмвнкДНК — 81,5±21,7 нг/мл плазмы крови — наблюдается через 3 ч после начала острого периода и достоверно (р<0,05) отличается от 43,3±6,6 нг/мл у больных с ОНМК ишемического типа [14]. Максимальный уровень нмвнкДНК у больных с ИИ — 77,8±9,9 мл/мл плазмы крови — достигается через 24 ч после начала острого периода и значимо (р<0,05) отличается от значения 28,0±9,3 мл/мл, наблюдаемого у пациентов с ГИ.

Изменение содержания нмкДНК в плазме крови пациентов с ОНМК. По оси ординат — содержание нмкДНК, нг/мл плазмы; по оси абсцисс — время после начала заболевания, ч.

Впервые проведено исследование ЦСЖ у больных с ОНМК ишемического типа, поскольку в этом случае отсутствует примесь крови в ЦСЖ. Анализ ЦСЖ в разные периоды заболевания позволил выявить нмвнкДНК в количестве 71,9±16,9 нг/мл (p<0,001) ЦСЖ у больных в течение первых суток от начала инсульта. В последующие периоды, от 7 суток до 3 нед, ее присутствие обнаружить не удалось.

Обсуждение

Различными методами показано, что содержание внкДНК в крови здоровых составляет 3—44 нг/мл плазмы и 50—100 нг/мл сыворотки и зависит от возраста доноров — у молодых уровень внкДНК ниже [10, 15]. Повышенные концентрации внкДНК в плазме и сыворотке крови больных с ОНМК определены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к гену β-глобина [4, 5] и иммуноферментным методом Cell Death Detection-ELISAplus [6]. Сравнительный анализ результатов исследований других авторов показал различия в содержании внкДНК у больных с ОНМК ишемического и геморрагического типов (табл. 2), выражающиеся в увеличении содержания внкДНК через 3 ч после начала заболевания у пациентов с ГМ и после 24 ч — у больных с ИИ.

Таблица 2. Содержание внкДНК у пациентов с ОНМК по результатам различных исследований Примечание. ПААГ — полиакриламидный гель.

Обнаруженное увеличение содержания нмвнкДНК в близких количествах в плазме крови и ЦСЖ у больных с ИИ спустя 24 ч от начала заболевания свидетельствует о ее выделении из гибнущих в результате апоптоза клеток формирующегося очага ишемии в головном мозге и поддерживает предположение о роли апоптоза в развитии ОНМК ишемического типа. По данным других авторов, повышение содержания внкДНК в плазме коррелирует с объемом инфаркта у больных с ИИ [6] и объемом внутримозговой гематомы у больных с ГИ [5]. Определение внкДНК методом ПЦР [4, 5] не позволяет связать появление ДНК в циркуляции с типом гибели клетки (некроз или апоптоз). Выполненное нами определение нмвнкДНК методом электрофореза, позволяющим визуализировать низкомолекулярную фракцию, и исследование иммуноферментным методом, обнаруживающим нуклеосомную ДНК [6], свидетельствует об апоптической гибели клеток и подтверждает роль апоптоза в развитии инсульта [16].

Значительная концентрация и длительность циркуляции нмвнкДНК могут служить показателем масштабности повреждения в остром периоде инсульта и, возможно, определять временны́е границы обратимости неврологического дефицита. При геморрагическом типе ОНМК источником появления нмкДНК в первые часы заболевания может быть гибель клеток, которая происходит при формировании тромба непосредственно в кровяном русле в результате выраженной стрессорной реакции, характерной для данной патологии.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает, что ИИ относится к состояниям, ассоциированным с усилением процесса апоптоза, который сопровождается увеличением содержания нмвнкДНК.

Часть работы выполнена при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074- U 051).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.