Содержание низкомолекулярной ДНК в плазме крови и цереброспинальной жидкости у больных с острым нарушением мозгового кровообращения

Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) занимают 2-е место по уровню смертности, уступая лишь кардиальной патологии. В России смертность от инсульта составляет 175 случаев на 100 000 населения. По данным Национальной ассоциации по борьбе с инсультом, 31% пациентов, перенесших инсульт, нуждаются в специальном уходе, 20% не могут самостоятельно передвигаться и только 8% возвращаются к прежней полноценной жизни. Среди мужчин трудоспособного возраста заболеваемость ОНМК в 2 раза выше, чем среди женщин [1, 2]. Расходы на лечение больных с ОНМК достигают 20% всех затрат на здравоохранение.

Исход ОНМК во многом определяется своевременностью и адекватностью лечения, которое включает комплекс неотложных мероприятий, кардинально различающихся у больных с ишемическим (ИИ) и геморрагическим (ГИ) инсультом [3]. Авторы немногочисленных исследований отмечают предиктивное значение определения внеклеточной ДНК (внкДНК) в течение 6 нед после ОНМК [4—6]. Значительное увеличение содержания внкДНК у больных с инсультом в совокупности с другими клиническими данными указывает на вероятность раннего летального исхода и коррелирует с неврологическим статусом больного [4]. Снижение содержания нуклеосомной внкДНК считают одним из показателей, указывающих на спонтанное неврологическое улучшение и позволяющих идентифицировать пациентов, не нуждающихся в дальнейшей интенсивной терапии [6].

В организме внкДНК циркулирует в виде ограниченных мембранами везикул разного диаметра, включающих апоптозные тельца и экзосомы, секретируемые различными клетками. Фракционный анализ позволяет обнаружить в составе внкДНК высокомолекулярную и низкомолекулярную нуклеосомную фракцию, за счет образования которой и происходит увеличение содержания внкДНК [7]. При электрофоретическом разделении образца внкДНК плазмы крови пациента высокомолекулярная фракция расположена в верхней части геля, а низкомолекулярная фракция внкДНК в виде пятна находится в нижней части геля. Фрагменты низкомолекулярной внкДНК (нмвнкДНК) соответствуют размерам нуклеосомы, 160—180 пар нуклеотидов (п.н.). Выделение такой ДНК в бесклеточную часть крови и другие биологические жидкости вызвано процессами апоптоза [8]. Увеличение содержания внкДНК наблюдают и при других заболеваниях и состояниях, связанных с усилением апоптоза: при воздействии ионизирующей радиации, низкочастотного шума [9], травме [10], сепсисе с выраженным системным поражением [11], тяжелых физических нагрузках [12].

Цель настоящей работы — оценить значение низкомолекулярной ДНК в плазме крови и ЦСЖ для диагностики ОНМК ишемического и геморрагического типов в ранние сроки после начала заболевания.

В исследование включали больных с ОНМК, мужчин и женщин в возрасте 46 — 67 лет, поступивших в стационар через 3, 6, 12, 24, 48 и 72 ч после начала заболевания. Пациенты были разделены на 2 группы по 8 человек в каждой в зависимости от типа инсульта — ГИ или И.И. Исследовали также ЦСЖ, полученную при люмбальной пункции 38 больных с ИИ, поступивших в стационар в различные сроки от начала заболевания (2—24 ч, 2—7 сут, 2—3 нед, более 3 нед). Показатели нормы получены при обследовании 23 здоровых доноров, мужчин и женщин в возрасте 26—76 лет. Здоровые были разделены по возрастным группам: 25—45 лет — 9 обследованных, 46—70 лет — 14.

Кровь у обследуемых в количестве 3 мл брали путем венепункции в пробирки, содержащие ЭДТА. Плазму отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 810 g и 4 °C в бакет-роторе. Для полного удаления форменных элементов плазму центрифугировали дважды при 2200 g. Нуклеиновые кислоты из плазмы крови и ЦСЖ выделяли методом фенольной депротеинизации. Осадки нуклеиновых кислот растворяли в деионизированной воде из расчета 1 мкл на 1 мл плазмы крови. Раствор нуклеиновых кислот хранили для дальнейших исследований при –70 °С. Полученный препарат инкубировали с РНКазой и анализировали методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (2/16%) в 0,04 М трис-ацетатном буфере (рН 7,7), содержащем 0,1 М ЭДТА. Для идентификации исследуемых фракций использовали маркеры-рестрикты PBR322/BspR1 и λ/Alu1, наносимые в количестве 1 мкг/мкл. Гели фотографировали в проходящем УФ, содержание нмвнкДНК определяли путем сравнения со стандартами [13].

Исследования показали, что в плазме крови здоровых содержание нмвнкДНК находится в пределах 31,4±6,8 нг/мл плазмы крови и зависит от возраста обследуемого (табл. 1). Данные свидетельствуют о том, что у молодых людей в среднем содержание нмвнкДНК несколько ниже, чем у пожилых, однако различия недостоверны. По-видимому, это связано с ингибированием процессов апоптоза под действием ростовых факторов. Возрастная группа 46—75 лет соответствует возрасту обследованных пациентов с ОНМК и принята как норма.

Обнаружено, что в плазме крови больных с ОНМК в течение 3 сут после начала заболевания наблюдается повышение уровня нмвнкДНК (см. рисунок). Однако динамика изменения содержания нмвнкДНК различается при ишемическом и геморрагическом типах ОНМК. При И.И. уровень нмвнкДНК не превышает уровня нормы в течение 3—12 ч после начала заболевания, достигает максимума через 24 ч, остается повышенным через 48 ч и снижается через 72 ч. При Г.И. максимальное содержание нмвнкДНК наблюдалось через 3 ч после начала заболевания, оставалось повышенным через 6 ч и далее снижалось до полного исчезновения из кровяного русла через 72 ч. Установлено, что у больных с ОНМК геморрагического типа максимальное значение нмвнкДНК — 81,5±21,7 нг/мл плазмы крови — наблюдается через 3 ч после начала острого периода и достоверно (р<0,05) отличается от 43,3±6,6 нг/мл у больных с ОНМК ишемического типа [14]. Максимальный уровень нмвнкДНК у больных с ИИ — 77,8±9,9 мл/мл плазмы крови — достигается через 24 ч после начала острого периода и значимо (р<0,05) отличается от значения 28,0±9,3 мл/мл, наблюдаемого у пациентов с ГИ.

Впервые проведено исследование ЦСЖ у больных с ОНМК ишемического типа, поскольку в этом случае отсутствует примесь крови в ЦСЖ. Анализ ЦСЖ в разные периоды заболевания позволил выявить нмвнкДНК в количестве 71,9±16,9 нг/мл (p<0,001) ЦСЖ у больных в течение первых суток от начала инсульта. В последующие периоды, от 7 суток до 3 нед, ее присутствие обнаружить не удалось.

Различными методами показано, что содержание внкДНК в крови здоровых составляет 3—44 нг/мл плазмы и 50—100 нг/мл сыворотки и зависит от возраста доноров — у молодых уровень внкДНК ниже [10, 15]. Повышенные концентрации внкДНК в плазме и сыворотке крови больных с ОНМК определены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к гену β-глобина [4, 5] и иммуноферментным методом Cell Death Detection-ELISA^plus [6]. Сравнительный анализ результатов исследований других авторов показал различия в содержании внкДНК у больных с ОНМК ишемического и геморрагического типов (табл. 2), выражающиеся в увеличении содержания внкДНК через 3 ч после начала заболевания у пациентов с ГМ и после 24 ч — у больных с ИИ.

Обнаруженное увеличение содержания нмвнкДНК в близких количествах в плазме крови и ЦСЖ у больных с ИИ спустя 24 ч от начала заболевания свидетельствует о ее выделении из гибнущих в результате апоптоза клеток формирующегося очага ишемии в головном мозге и поддерживает предположение о роли апоптоза в развитии ОНМК ишемического типа. По данным других авторов, повышение содержания внкДНК в плазме коррелирует с объемом инфаркта у больных с ИИ [6] и объемом внутримозговой гематомы у больных с ГИ [5]. Определение внкДНК методом ПЦР [4, 5] не позволяет связать появление ДНК в циркуляции с типом гибели клетки (некроз или апоптоз). Выполненное нами определение нмвнкДНК методом электрофореза, позволяющим визуализировать низкомолекулярную фракцию, и исследование иммуноферментным методом, обнаруживающим нуклеосомную ДНК [6], свидетельствует об апоптической гибели клеток и подтверждает роль апоптоза в развитии инсульта [16].

Значительная концентрация и длительность циркуляции нмвнкДНК могут служить показателем масштабности повреждения в остром периоде инсульта и, возможно, определять временны́е границы обратимости неврологического дефицита. При геморрагическом типе ОНМК источником появления нмкДНК в первые часы заболевания может быть гибель клеток, которая происходит при формировании тромба непосредственно в кровяном русле в результате выраженной стрессорной реакции, характерной для данной патологии.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает, что ИИ относится к состояниям, ассоциированным с усилением процесса апоптоза, который сопровождается увеличением содержания нмвнкДНК.

Часть работы выполнена при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074-U051).