Ишемия головного мозга на фоне подавления и активации иммунитета

Ишемические повреждения головного мозга (ГМ) продолжают оставаться одной из важнейших проблем в современном здравоохранении. Известно, что нервная и иммунная системы (ИС) находятся в тесном взаимодействии с эндокринной системой в физиологических условиях и при различных заболеваниях [1]. В последние годы установлено, что наряду с общепризнанными факторами патогенеза острой и хронической ишемии ГМ, важнейшая роль принадлежит иммунологическим механизмам, вносящим свой вклад в повреждение, защиту и восстановление структуры и функций мозга [2, 3]. Так, не только ГМ регулирует периферическую нервную систему, врожденный и приобретенный иммунитет после ишемического инсульта [4], но и клетки и медиаторы иммунного ответа также оказывают воздействие на нервную систему, проникая в ГМ, где они могут защищать ткани от повреждения, способствовать удалению некротических масс, принимать участие в процессах репарации ткани, помогать в восстановлении утраченных функций или наоборот усугублять повреждение и препятствовать восстановлению [5, 6]. В свою очередь церебральный инсульт может вызвать иммунодепрессию [7, 8]. Таким образом, в литературе отмечается сложность взаимодействия ГМ и ИС, влияние которой нельзя однозначно оценить как повреждающее или благоприятное при ишемическом поражении.

В реальных условиях инсульт может произойти при нормальном, пониженном и повышенном иммунном статусе. Исходя из важности ИС, которая может сыграть адаптивную или дезадаптивную роль при остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК), следует предположить, что течение и последствия ишемии ГМ будут не одинаковыми у больных с различным состоянием ИС.

Цель настоящего исследования — изучение влияния состояния ИС на последствия ишемического поражения ГМ у животных.

Эксперименты выполнены на 105 аутбредных белых крысах-самцах в возрасте 6 мес с массой тела 270—320 г. Животные были доставлены из питомника ФГУП и содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму.

Исследование проводилось в 3 серии, и экспериментальные группы формировались в зависимости от состояния ИС: с интактным, подавленным и активированным иммунитетом. Каждая серия включала группу ложнооперированных (ЛО) животных, которых подвергали аналогичным группе «ишемия» оперативным вмешательствам без непосредственной перевязки общих сонных артерий (ОСА), и группу животных с ишемией ГМ (ИГМ), вызванной поэтапной перевязкой ОСА. Группы «ишемия» и ЛО включали по 20 и 15 животных соответственно во всех сериях.

Первое введение веществ для подавления или активации иммунитета животных осуществляли за 1 сут до перевязки первой ОСА. По данным литературы, одномоментная двусторонняя перевязка ОСА у крыс приводит к гибели большого числа экспериментальных животных, преимущественно в течение первых 2—3 сут, что затрудняет изучение динамики восстановительного периода [9—11]. В связи с этим для моделирования ОНМК нами была выбрана более щадящая модель неполной ишемии ГМ, при которой перевязка левой и правой ОСА проводилась с 3-суточным интервалом, т. е. поэтапно [12]. Интересующие показатели регистрировали на протяжении 7 сут после перевязки второй ОСА, т. е. после окончательного моделирования ишемии ГМ.

Подавление ИС животных осуществляли введением циклоспорина, А (препарат экорал, Чешская Республика) перорально в дозе 5 мг/кг ежедневно в первой половине дня [13, 14] на протяжении всего эксперимента. Активировали И.С. животных внутрибрюшинным введением липополисахарида, выделенного из клеток Salmonella typhi (препарат пирогенал, Россия), в дозе 10 мкг/кг через день в первой половине дня [15] также на протяжении всего эксперимента.

Регистрацию общей летальности и выраженности неврологического дефицита у животных осуществляли спустя 12, 24, 48, 72 ч и 7 сут после окончательного моделирования ОНМК. Неврологический статус животных определяли по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной [16]. Дополнительно спустя 7 сут после ишемического поражения ГМ для оценки состояния животных использовали тесты «Открытое поле» [17] и Rota-Rod [18], в которых наблюдали за двигательной и ориентировочно-исследовательской активностью животных и оценивали координацию движений и мышечный тонус.

На 3-и и 7-е сутки после поэтапной двусторонней окклюзии ОСА определяли уровни мозгового кровотока в проекции средней мозговой артерии (СМА) и уровень нейроспецифических белков (НСБ) как маркеров степени повреждения ГМ [19, 20]: NSE — нейроспецифической енолазы, MBP — основного белка миелина и уровень нейротрофинов, BDNF — нейротрофического фактора ГМ, NGF — фактора роста нервов. Данные белки определяли в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов фирмы «Cusabio-Rat» на ИФА-комплексе фирмы «Tecan» (Австрия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel и BioStat. Достоверность различий показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью рангового однофакторного критерия Крускала—Уоллиса, критериев Данна и Фишера. Статистически значимыми признавали различия при p≤0,05.

Суммарные данные о динамике гибели после поэтапной окклюзии ОСА представлены в табл. 1. Видно, что наименьшее число летальных исходов было отмечено у животных, которым церебральную ишемию моделировали на фоне активированной ИС, тогда как подавление иммунитета приводило к отягощению последствий ОНМК у экспериментальных животных, у которых летальность к концу 7-х суток составила 75%.

Ишемическое повреждение ГМ у животных с интактной, подавленной или активированной ИС приводило к развитию неврологического дефицита разной степени выраженности (табл. 2). У животных с подавленным иммунитетом наблюдался больший неврологический дефицит через 72 ч и 7 сут по сравнению с таковым у животных с интактной И.С. На фоне активированного иммунитета отмечался наименее выраженный неврологический дефицит спустя 3 и 7 сут.

У животных с ишемией на фоне интактной, подавленной и активированной ИС уровень мозгового кровотока через 3 и 7 сут после моделирования ишемии ГМ был достоверно ниже уровня групп ЛО-животных на 39,4—44,5%. Различия в уровне мозгового кровотока после поэтапной двусторонней перевязки ОСА между ишемизированными группами во всех сериях статистически незначимы. Например, через 7 сут линейная скорость кровотока в группе «ишемия» относительно ЛО-животных во всех 3 сериях эксперимента составила соответственно 2,95±0,13 м/с против 5,02±0,6 м/с; 2,89±0,17 м/с против 4,94±0,2 м/с; 3,06±0,11 м/с против 5,1±0,16 м/с при интактной, подавленной и активированной ИС соответственно.

Наряду с клинической картиной информативным для понимания истинной тяжести состояния и степени повреждения ГМ при различных патологиях является определение маркеров поражения нервной ткани — НСБ. Такие белки являются специфичными для нейронов, глии, и увеличение их содержания в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости служит маркером повреждения клеток данной ткани [21]. При тяжелых гипоксически-ишемических поражениях ЦНС развивается некроз клеток, при поражениях меньшей тяжести гибель клеток происходит по типу апоптоза [22]. К наиболее физиологическим ингибиторам запрограммированной гибели клеток относятся нейротрофические и ростовые факторы [23]. В основном с уменьшением апоптоза связывают нейропротективное действие NGF, BDNF и инсулиноподобных факторов роста [24].

В данной работе, как сказано выше, определяли уровень НСБ и нейротрофинов: NSE, MBP, BDNF и NGF в сыворотке крови. NSE — гликолитический фермент, который локализуется главным образом в нейронах и нейроэндокринных клетках нервной системы, отражает метаболизм ЦНС и мембранные функции гематоэнцефалического барьера, является общим маркером всех дифференцированных нейронов [20]. NSE используется в качестве клинико-диагностического критерия в оценке поражения нейронов при ишемических и геморрагических инсультах. В ряде работ продемонстрирована зависимость уровня этого фермента от тяжести патологического процесса [25].

В данном исследовании было установлено, что у животных с неизмененным иммунитетом после поэтапной двусторонней окклюзии ОСА уровень NSE в сыворотке крови через 3 сут оказался на 37% выше, а через 7 сут — на 274% выше, чем в группе ЛО-животных. У животных с иммуносупрессией через 3 сут после окклюзии ОСА уровень NSE вырос на 33,2%, а через 7 сут — на 164,2%, т. е. значительно меньше (рис. 1, а). При активации иммунитета уровень NSE через 3 сут после ОСА был незначительно выше (на 63,5%), а через 7 сут увеличился на 67,9%, таким образом, общее увеличение содержания белка было намного меньше, чем у животных с неизмененным и подавленным иммунитетом. Эти результаты согласуются с клиническими проявлениями ишемии: данными по общей летальности животных, изменению неврологического дефицита, которые при активированной ИС были значительно ниже, чем у животных с изначально интактным иммунитетом и, особенно, по сравнению с иммуносупрессированными животными. Также эти изменения оказались сопоставимыми с результатами по показателям двигательной активности в тестах «Открытое поле» и Rota-Rod.

MBP — один из главных структурных нейронспецифических белковых компонентов миелина, входящих в состав белого вещества Г.М. Нарушение его метаболизма чаще связывают с развитием демиелинизирующего процесса. Деструкция белого вещества мозга сопровождается выходом MBP из пораженной ткани. В работах ряда авторов показано [26], что у больных с ОНМК увеличена концентрация MBP в сыворотке крови и наблюдается корреляция между уровнем белка и прогнозом инсульта [26].

Через 3 сут после моделирования ИГМ уровень MBP у животных с ишемией на фоне интактной ИС вырос всего на 6%, а через 7 сут — на 476% относительно ЛО-животных. При подавлении иммунитета через 3 сут концентрация белка MBP у ишемизированных животных была на 39% больше, а через 7 сут — на 209% больше, чем в группе Л.О. При активации иммунитета липополисахаридом увеличение белка MBP в сыворотке крови было самым незначительным: на 16,5 и 37,4% через 3 и 7 сут соответственно (см. рис. 1, б). Полученные результаты позволяют судить о меньшем повреждении глиальной ткани ГМ при ишемическом его повреждении на фоне активированного иммунитета и коррелируют со степенью повреждения дифференцированных нейронов по содержанию фермента NSE.

BDNF и NGF являются основными нейротрофинами, которые имеют нейропротективное влияние в отношении нейронов и микроглии, стимулируют рост аксонов и ветвление дендритов, участвуют в неоангиогенезе у пациентов, перенесших ишемический инсульт, обладают антиапоптозной защитой [27].Также существуют данные об участии нейротрофинов в антиоксидантной защите [28] и протективном влиянии, которое осуществляется за счет снижения провоспалительной реакции глии при различных видах нейронального поражения [29].

Через 3 сут после моделирования ИГМ уровень BDNF у животных всех групп с интактным, подавленным и стимулированным иммунитетом практически не различался и был на достаточно высоком уровне — от 950 до 1275 пг/мл. Возможно, такой одинаково высокий уровень белка можно объяснить реакцией ткани ГМ на ишемическое повреждение и предшествовавшее этому двукратное оперативное вмешательство. У группы ЛО-животных с подавленным иммунитетом уровень BDNF в сыворотке крови был на 25,5% ниже, а при активации иммунитета — на 13,5% ниже, чем у животных с интактной ИС (рис. 2, а).

Через 7 сут после моделирования ИГМ уровень нейротрофина BDNF у животных с ишемией во всех группах (интактная, подавленная, активированная ИС) был достоверно выше, чем у ЛО-животных. У животных с ишемией ГМ и супрессией ИС концентрация BDNF через 7 сут составила 943 пг/мл, что было так же высоко, как и через 3 сут после ишемического поражения (1078 пг/мл). Такую высокую концентрацию белка можно объяснить постоянным разрушением нейронов ГМ, распадом мозговой ткани, нарушением целостности ГЭБ и соответственно выходом фактора BDNF в системный кровоток (где его уровень был постоянно высок на протяжении 7 сут). Таким образом, в данном случае BDNF не работал как трофический фактор (по принципу — чем его больше, тем активнее он проявляет трофические свойства и способствует дальнейшему восстановлению), а проявлял себя как маркер некроза клеток ткани мозга при его ишемическом поражении. Такие выводы подтверждаются большей гибелью животных с иммуносупрессией на 7-е сутки после окклюзии ОСА и более выраженным неврологическим дефицитом у выживших особей в данной группе.

Динамика содержания в сыворотке крови NGF не была столь значительно выраженной, и его содержание во всех исследуемых группах через 3 и 7 сут после моделирования ОНМК было примерно одинаковым, за исключением увеличения его концентрации через 3 сут как у животных с ИГМ, так и у ЛО-животных на фоне активированной ИС (см. рис. 2, б). Таким образом, NGF положительно влиял на ишемизированную ткань ГМ у животных с активированным иммунитетом, оказывая благоприятное трофическое действие, так как через 7 сут после ОНМК именно у животных с активированной ИС наблюдались положительный клинический исход в виде уменьшения общей летальности и меньшей выраженности неврологического дефицита, а также высокие показатели двигательной, ориентировочно-исследовательской активности и мышечной силы.

ОНМК в зависимости от тяжести течения вызывает нарушения координации и двигательной активности различной степени выраженности, поэтому в данной работе спустя 7 сут после моделирования ИГМ исследовали функциональное состояние нервной системы у выживших животных, тестируя двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность в тесте «Открытое поле», координацию движений и мышечный тонус в тесте Rota-Rod.

Двигательная и ориентировочно-исследовательская активность при ишемии в тесте «Открытое поле» у животных с подавленной ИС была значительно ниже таковой по сравнению с группой с интактной ИС, а двигательная активность животных с активированным иммунитетом была значительно выше, чем у животных с интактным и подавленным иммунитетом (рис. 3, а).

При исследовании координации движений и мышечного тонуса в тесте Rota-Rod установлено уменьшение латентного периода (ЛП) первого падения животного и суммарного времени удержания на вращающемся стержне в группах с ИГМ, что говорит о снижении мышечного тонуса у животных с ОНМК. Отмечено, что суммарное время удержания на вращающемся стержне за 3 попытки было ниже у животных с окклюзией ОСА на фоне подавления ИС, а у животных с активированным иммунитетом данный показатель был значительно выше (см. рис. 3, б).

Таким образом, можно заключить, что ИГМ, смоделированная на фоне иммуносупрессии, вызывает более выраженное поражение ЦНС, что проявляется в повышении общей летальности, степени выраженности неврологического дефицита, содержания нейроспецифических белков, а также большем угнетении двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных и снижении мышечного тонуса. Активация иммунной системы в тех же условиях эксперимента уменьшает ишемическое поражение головного мозга у крыс, что выражается в снижении уровней NSE, МВP, повышении содержания нейротрофинов NGF и BDNF и приводит к снижению количества летальных исходов, выраженности неврологического дефицита у выживших после ИГМ животных и их большей двигательной активности.

Полученные результаты позволяют судить о значительном влиянии измененной иммунореактивности на патогенез, течение и клинический исход ОНМК, а также о возможной эффективности иммуномодулирующей терапии, направленной на уменьшение реакции локального воспаления, минимизацию аутоиммунной агрессии, снижение степени риска развития вторичных инфекций, что в результате позволит снизить летальность, степень инвалидизации и улучшить качество жизни пациентов.