Протективная роль нитрит/нитрат-редуктазной системы при ишемическом инсульте

Ишемический инсульт (ИИ) остается одной из ведущих причин смерти и инвалидности и является финансовым бременем для здравоохранения [1—3]. Поэтому по-прежнему интенсивно ведутся исследования по поиску эффективных и недорогих средств терапии инсульта. К таким препаратам можно отнести нитраты (доноры оксида азота) и неорганические препараты магния, в частности нитрат магния — Mg (NO3)2. С тех пор как в 1998 г. трем американским исследователям — Ф. Мьюрэду, Р. Фёрчготту и Л. Игнарро была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине за установление роли оксида азота (NO) в работе сердечно-сосудистой системы, начался лавинообразный поток публикаций, посвященных изучению функциональных свойств этого химического соединения. Исследователи установили, что NO, синтезируемый семейством ферментов NO-синтаз (NOS), вовлечен во многие физиологические и патофизиологические процессы, включая инсульт [4—6]. Было выяснено, что NO играет двойную роль при мозговой ишемии. В зависимости от концентрации, местоположения, источника и окружающей среды он может быть и защитным, и патогенным фактором. NO как сильный вазодилататор способен увеличивать кровоток в мозге, ингибировать агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов, что приводит к протективному эффекту на ишемию мозга. В то же время чрезмерная выработка NO приводит к повреждению ткани мозга [7—9].

Применение неселективных ингибиторов NOS показало, что инактивация синтеза NO, которая происходит во время ИИ, увеличивает неврологический дефицит [10—12]. Об активности NOS и интенсивности ишемического процесса в мозге судили по уровню нитратов в биологических жидкостях, считая, что нитриты и нитраты являются инертными и конечными продуктами окисления NO [13—15]. С середины XX столетия сложилось негативное отношение к нитратам, их стали считать причиной метгемоглобинемии и канцерогенеза, хотя лечение нитратами практиковалось на протяжении нескольких тысячелетий [16—18]. Исследователи обратили внимание на то, что средиземноморская и японская диеты, хотя и содержат смертельные концентрации нитратов, но использующие их при этом отличаются долгожительством [19—21].

Интенсивные исследования роли NO в физиологии человека и борьба со «зловредностью» нитратов привели ученых к противоположному мнению — нитраты стали считать активным терапевтическим участником физиологических процессов [22—24]. Было установлено, что источником NO в организме могут быть не только NOS, но и ряд других металлсодержащих ферментов. К этим энзимам относится многочисленная группа нитрит/нитрат-редуктаз, которые могут осуществлять трансформацию нитратов в NO как в прямом (NO3¯→NO2¯→NO), так и в обратном направлении (NO→NO2¯→NO3¯). Особенно интенсивно этот процесс происходит во время ишемии/гипоксии мозга, например при ИИ [25—27]. В настоящее время установлено, что при ишемии/гипоксии происходит снижение активности NOS-системы образования NO из-за нехватки кислорода, который является субстратом NOS. Поэтому активируется альтернативная нитрит/нитрат-редуктазная система защиты организма от ишемии-гипоксии [28—30].

Автор предполагает, что нитрит/нитрат-редуктазная система является более древней и слабой системой образования NO, чем NOS-система. Вероятно, вследствие более эффективной протективной активности NOS-система стала основной формой синтеза NO. Возможно, она досталась животным от растений, у которых она также играет важную роль [31—33], или эволюционировала параллельно с растительной системой. По всей видимости, при патологических состояниях, особенно в условиях ишемии/гипоксии, нитрит/нитрат-редуктазная система снова становится основной формой синтеза NO.

Целью данной работы стала проверка гипотезы, может ли нитрит/нитрат-редуктазная система проявлять протективную роль при ингибировании NOS в условиях ишемии мозга. Было исследовано влияние нитратов КNO3, NaNO3, Mg (NO3)2, Ca (NO3)2 как доноров NO на экспериментальный ИИ в условиях инактивации NOS-системы неспецифическим ингибитором NOS N^ɷ-nitro-L-arginine (L-NNA).

Для создания модели глобальной ишемии мозга применяли одномоментную двустороннюю перевязку общих сонных артерий. Крысам линии Вистар под эфирным наркозом выделяли и перевязывали общие сонные артерии. Длительность операции составляла не более 10 мин. После эфирного наркоза у крыс быстро восстанавливалось сознание. Животных помещали в отдельные клетки и полуколичественно оценивали динамику неврологического дефицита [34]. Оценивали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные приступы), парезы конечностей, кому и смерть. В соответствии с использованной методикой оценки неврологической симптоматики, за 0—3 балла принимали состояние, близкое к нормальному; за 3—6 баллов — среднюю степень тяжести ИИ; за 7—24 балла — тяжелую степень ИИ; за 25 баллов — смерть животного. Неврологический дефицит оценивали через каждые 30 мин в течение 8 ч. Суммарный балл по каждому промежутку времени усредняли для всех животных в группе. На основе полученных данных строили графики динамики неврологических нарушений, отложив по оси ординат баллы, по оси абсцисс — время.

В предварительном эксперименте ингибитор NOS L-NNA в дозе 25 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга и после 5 с окклюзии общих сонных артерий. Поскольку разницы между временем введения L-NNA не было выявлено, то в данном исследовании L-NNA вводили через 5 с после окклюзии общих сонных артерий. Было проведено 4 серии экспериментов, в которых было использовано 576 крыс, по 144 крысы в каждой серии. У всех крыс была произведена окклюзия обеих сонных артерий. В каждой серии эксперимента в зависимости от применяемых нитратов (KNO3; NaNO3; Mg (NO3)2; Ca (NO3)2) животные были разбиты на шесть групп: 5 опытных и 1 контрольную (рис. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).

Крысам 2-х опытных групп (n=24) вводили ингибитор NOS L-NNA в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно; крысам 3-х опытных групп (n=24) вводили один из нитратов в дозе 5 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга; крысам 4-х опытных групп (n=24) вводили один из нитратов через 5 с после окклюзии общих сонных артерий; крысам 5-х опытных групп (n=24) вводили один из нитратов в дозе 5 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга; крысам 6-х опытных групп (n=24) вводили один из нитратов в дозе 5 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг через 5 с после окклюзии общих сонных артерий. Животным контрольной группы (1-я группа, n=24) внутрибрюшинно в те же сроки в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор (0,9% NaCl).

После завершения эксперимента животных помещали в эксикатор с эфиром и умерщвляли.

Статистический анализ полученных данных проводился с помощью программы Statistika 6. Достоверность различий средних параметров в разных экспериментальных группах животных оценивали с помощью критерия Манна—Уитни (U-тест). Для оценки летальности и неврологических проявлений применяли критерий Фишера.

Неврологические нарушения в группе животных, получавшей KNO3 в дозе 5 мг/кг за 1 ч до ишемии мозга, были достоверно (p<0,05) ниже, чем в контроле на протяжении 300—480-й минут, и в группе, получавшей L-NNA в дозе 25 мг/кг (p<0,001), на протяжении 60—480-й минут. Неврологический дефицит у крыс, получавших одновременно KNO3 и L-NNA, в течение 330—480-й минут был достоверно (p<0,05) ниже, чем во 2-й группе (см. рис. 1). Летальность в 3-й опытной группе крыс составила 4,2% и была достоверно (p<0,05) ниже, чем в контроле — 25,0%, и во 2-й группе (p<0,01) — 33,0%. Летальность в 4-й группе составила 16,7%.

KNO3, введенный в дозе 5 мг/кг через 5 с после окклюзии сонных артерий оказал достоверный протективный эффект по сравнению с контролем (p<0,01) и с крысами, которые получали L-NNA (p<0,001). Между животными 2-й и 4-й групп, начиная с 240-й минуты и до конца опыта, достоверность различий эффекта составила p<0,05 (см. рис. 2). Летальность в 3-й группе крыс была достоверно (p<0,05) ниже, чем в группе получавших L-NNA, и составила 8,3 и 33,3% соответственно. Летальность в контроле и в группе получавших одновременно KNO3 и L-NNA составила 25,0 и 20,8% соответственно.

У крыс, которым вводили L-NNA в дозе 25 мг/кг, неврологические нарушения на протяжении 90—480-й минут были достоверно (p<0,01) тяжелее, чем в группе крыс, которые получали NaNO3 в дозе 5 мг/кг. Достоверной разницы между 1-й, 2-й, 4-й группами на протяжении всего опыта не наблюдалось, но неврологический дефицит во 2-й группе был выше (см. рис. 3). Летальность в 3-й группе крыс была достоверно (p<0,05) ниже, чем во 2-й группе, которая получала L-NNA, и составила 4,2 и 25,0% соответственно. Летальность в 1-й и 4-й группах составила 20,8 и 12,5% соответственно.

Введение NaNO3 в дозе 5 мг/кг через 5 с после окклюзии сонных артерий оказало достоверный (p<0,01) эффект по сравнению со 2-й группой (см. рис. 4, кривые 3 и 2). Неврологические нарушения в 3-й группе на протяжении всего опыта были недостоверно ниже, чем в контроле (см. рис. 4, кривые III и I). Летальнось в 1-й группе составила 20,8%, во 2-й группе — 25,0%, в 3-й — 8,3%, в 4-й — 12,5% (достоверных различий не обнаружено).

Интенсивность нарастания неврологического дефицита в группе, которая получала Mg (NO3)2 за 1 ч до ишемии, была достоверно (p<0,01) ниже, чем в контрольной группе животных и во 2-й группе (p<0,001). Неврологические нарушения во 2-й группе были достоверно (p<0,05) выше, чем в 4-й группе (см. рис. 5). Летальность в 3-й опытной группе крыс составила 4,2% и была достоверно ниже, чем в контроле (p<0,05) — 29,2% и во 2-й группе (p<0,01) — 33,0%. Летальность в 4-й группе составила 12,5%.

У животных, которым вводили Mg (NO3)2 в дозе 5 мг/кг через 5 с после окклюзии обеих сонных артерий, неврологический дефицит был достоверно менее выражен, чем у контрольной группы крыс (p<0,01) и животных, которым вводили только L-NNA (p<0,001). Неврологические нарушения в 4-й группе были достоверно (p<0,05) менее выражены, чем во 2-й группе (см. рис. 6). Летальность в 3-й группе крыс была достоверно (p<0,05) ниже, чем во 2-й группе, и составила 8,3 и 33,3% соответственно. Летальность в 1-й и 4-й группах составила 29,2 и 12,5% соответственно.

У животных, которым вводили Ca (NO3)2 в дозе 5 мг/кг за 1 ч до окклюзии обеих сонных артерий, неврологический дефицит на протяжении 330—480-й минут был достоверно (p<0,05) менее выражен, чем у 2-й группы крыс (см. рис. 7). Летальность в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й группах составила 29,2, 37,5, 16,7 и 25,0% соответственно.

Достоверных различий по неврологическим нарушениям и летальности при введении препаратов через 5 с после ишемии мозга между всеми группами зарегистрировано не было (см. рис. 8). Летальность в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й группах составила 29,2, 37,5, 16,7 и 20,9% соответственно.

Окклюзия двух сонных артерий вызывает развитие острой церебральной ишемии и запускает каскад патобиохимических реакций, вызывая необратимые повреждения сосудистой и нервной тканей мозга. Применение неселективных ингибиторов NOS на фоне ишемии/гипоксии усиливает эти повреждения, что увеличивает неврологический дефицит и число погибших животных [10—12]. Эти утверждения согласуются с полученными результатами во всех 4 сериях эксперимента, что хорошо видно на рис. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (на всех рисунках кривые I и II). Видно, что кривые II, отражающие неврологический дефицит при внутрибрюшинном введении L-NNA в дозе 25 мг/кг, лежат выше кривых I (контроль), что можно объяснить тем, что при ингибировании NOS происходит усиление неврологических нарушений.

В настоящее время установлено, что в условиях ишемии-гипоксии работа ферментов NOS из-за дефицита кислорода инактивируется и активируется альтернативный нитрит/нитрат редуктазный путь синтеза NO [10—12]. При этом активность различных нитрат-редуктаз зависит не только от напряжения кислорода, pH и доступности субстрата этих ферментов, но и от типа катионов, входящих в состав нитратов. Снижение нитрат-редуцирующей активности отмечено в ряду катионов: K⁺, Na⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺ [35]. Результаты, полученные в данном исследовании, согласуются с этими утверждениями. Из рис. 1—8 видно, что кривые III (на каждом рисунке), обозначающие неврологический дефицит при внутрибрюшинном введении одного из нитратов (КNO3, NaNO3, Mg (NO3)2, Ca (NO3)2), взятых в дозе 5 мг/кг, лежат на каждом рисунке ниже, чем кривые I. Такое расположение кривых можно объяснить тем, что в условиях ишемии/гипоксии мозга активируется нитрит/нитрат-редуктазная система, осуществляющая трансформацию нитратов в NO, который в основном и определяет протективную роль нитратов [25—27]. Также имеются данные о том, что нитраты могут оказывать протективные свойства через NO-независимый механизм вследствие их прямого действия на ключевые белки и липиды [5, 30].

На рис. 1 и2 кривые III лежат достоверно ниже, чем кривые I, что можно объяснить как протективным действием NO в отношении мозга в условиях ишемии, так и способностью самих ионов K⁺ снижать неврологический дефицит [36, 37]. Слабый протективный эффект NaNO3 в дозе 5 мг/кг (см. рис. 3 и 4, кривые I и III) и Ca (NO3)2 в дозе 5 мг/кг (см. рис. 7 и 8, кривые I и III) объясняется низкой нитрит/нитрат-редуцирующей активностью ферментов в присутствии катионов Na⁺ и Ca²⁺, а в случае NaNO3 и малой концентрацией этих ионов [35, 38]. Протективный эффект Мg (NO3)2 в дозе 5 мг/кг (см. рис. 5 и 6, кривые I и III) при ишемии мозга связан не только с образованием NO, но и с действием катионов Mg²⁺. Катионы Mg²⁺ уменьшают агрегацию тромбоцитов, снижают чрезмерный вход ионов Ca²⁺ в клетки, уменьшая эксайтотоксичность, способствуют раннему восстановлению клеточных запасов АТФ и ингибируют активацию провоспалительных цитокинов [39—41].

Интересные данные получены при одновременном введении одного из нитратов в дозе 5 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг. Эти результаты указывают на то, что в условиях ишемии/гипоксии и ингибирования NOS активируется альтернативный нитрит/нитрат-редуктазный путь синтеза NO, который способен уменьшить неврологический дефицит и оказать протективный эффект в зависимости от типа катиона, входящего в состав нитрата (см. рис. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, кривые IV и II). На всех рисунках видно, что все кривые II, отражающие неврологический дефицит при введении L-NNA, лежат выше кривых IV (совместное введение одного из нитратов и L-NNA) — условия, при которых ингибируются все изоформы NOS. Это можно объяснить тем, что хотя при ингибировании NOS (кривые I и II на рис. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) происходит усиление неврологических нарушений, но из-за активирования альтернативного нитрит/нитрат-редуктазного пути синтеза NO наблюдается протективный эффект — все зависит от катиона, входящего в состав нитратов. На рис. 3 и 4 и рис. 7 и 8 достоверный эффект между кривыми IV и II отсутствует, вероятно, из-за низкой нитрит/нитрат-редуцирующей активности катионов Na⁺ и Ca²⁺, а в случае катиона Na⁺ — еще и из-за его низкой концентрации. На рис. 1 и 2 и рис. 5 и 6 наблюдается достоверный протективный эффект между кривыми IV и II. По всей видимости, не только из-за высокой нитрит/нитрат-редуцирующей активности катиона K⁺, но и из-за влияния самих катионов K⁺ и Mg²⁺ на ткани мозга.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что в условии ишемии/гипоксии мозга и ингибировании NOS, нитрит/нитрат-редуктазная система способна оказать протективный эффект. Активность нитрит/нитрат-редуктазной системы зависит от типа катиона. Нитрат магния в условиях ишемии мозга и ингибирования NOS оказывает протективный эффект и может служить недорогим, доступным и эффективным препаратом для лечения сердечно-сосудистых болезней, особенно на стадии оказания скорой помощи.