Эпилепсия - одно из самых распространенных заболеваний нервной системы, характеризующееся повторными судорожными или другими приступами, возникающими в результате генерации массивного гиперсинхронного электрического разряда («эпилептический разряд») большой группы нейронов головного мозга. Эпидемиологические исследования убедительно демонстрируют, что эпилептифорные разряды чаще всего возникают у новорожденных и у детей раннего возраста [1-3]. Развивающийся мозг детей чрезвычайно предрасположен к генерации эпилептиформных разрядов, и такие разряды в незрелом мозге часто возникают мультифокально и в виде эпилептического статуса (ЭС) [4, 5].

Известно, что эпилептиформные разряды у детей, как и сама эпилепсия, имеют целый ряд особенностей, главными из которых являются: 1) наличие форм приступов, несвойственных взрослым; 2) возрастная зависимость большинства форм эпилептиформных разрядов и трансформация приступов с возрастом; 3) особенности течения - встречаются формы с абсолютно благоприятным и абсолютно неблагоприятным прогнозом; 4) частота электрического эпилептического статуса; 5) традиционные противоэпилептические препараты часто не эффективны, более того, могут иметь парадоксальный аггравирующий (проэпилептический) эффект; 6) и самое важное - при фокальной эпилепсии у детей раннего возраста частое появление феномена «вторичной билатеральной синхронизации (SBS-syndrom)» существенно изменяет клинику приступа и приводит к появлению «генерализованных» или по определению К.Ю. Мухина «псевдогенерализованных» приступов [6-11].

Известно, что развивающийся мозг детей характеризуется преобладанием процессов возбуждения на фоне дефицита торможения. Cчитается, что преобладание возбуждения над торможением способствует развитию межнейрональных связей за счет нейрогенеза, аксонального спрутинга и интенсивного формирования новых синапсов. Превалирование возбуждения над торможением в незрелом мозге способствует также ускоренному формированию новых функциональных связей. В то же время такой дисбаланс процессов возбуждения и торможения может являться причиной повышенной склонности незрелого мозга детей к генерации повторяющейся эпилептиформной активности и развитию эпилепсии (эпилептогенезу). Это предположение убедительно подтверждено в многочисленных экспериментах на животных [12-16].

Механизмы, лежащие в основе повышенной возбудимости незрелого мозга и соответственно повышенной склонности к генерации эпилептиформных разрядов, изучены не до конца. Повышенная возбудимость развивающегося мозга может быть объяснена многими факторами, в том числе более ранним и ускоренным развитием возбуждающей нейромедиаторной системы относительно системы торможения [17, 18]. В нервной системе теплокровных животных доминирующим возбуждающим нейромедиатором является глутамат. Ионотропные глутаматные рецепторы (GluR) проницаемы для ионов натрия, калия и в зависимости от субъединичного состава частично для ионов кальция [19]. Различают три основных подтипа ионотропных GluR: N-метил-D-аспартат (НМДА), альфа-амино-3-гидроксил-5-метил-изоксазол (АМПА) и каинатные рецепторы. НМДА-рецепторы независимо от субъединичного состава всегда проницаемы для ионов кальция, тогда как проницаемость для двухвалентных катионов АМПА и каинатных рецепторов зависит от их субъединичной композиции. НМДА-рецепторы состоят из одной NR1-субъединицы в комбинации с NR2A, NR2B, NR2C, NR2D и/или NR3A-субъединицами [19]. Подобным образом АМПА-рецепторы - это комбинация соответствующих GluR1-, GluR2-, GluR3- и/или GluR4-субъединиц [20] и каинатные рецепторы - гетеромерная комбинация GluR5-, GluR6-, GluR7-, KA1- и/или KA2-субъединиц [21-23].

Кроме ионотропных рецепторов, глутамат может активировать метаболотропные глутаматные рецепторы (mGluR) через G-протеин-опосредован­ный внутриклеточный каскад, вызывая медленные синаптические токи. Метаболотропные GluR делятся на три группы в зависимости от субъединичного состава: группа I (mGluR2- и mGluR3-субъединицы), группа II (mGluR2 и mGluR3) и группа III (mGluR4 и mGluR6) [24]. Субъединичная композиция GluR меняется в процессе развития нервной системы.

В незрелом мозге нейроны НМДА-рецепторы содержат высокий уровень NR2B-, NR2A- и NR3A-субъединиц. Показано, что из-за повышенной экспрессии NR2B-субъединицы в незрелых нейронах кинетика спада НМДА-рецептор-опосредованных токов намного (2-3 раза) медленнее, чем в зрелых клетках. Кроме того, повышенный уровень NR2A- и NR3A-субъединиц в этом возрасте приводит к ослаб­лению магниевого блока НМДА-рецептор-опосредованных токов [19].

Субъединичный состав и проницаемость для ионов кальция у АМПА и каинатных рецепторов являются возрастзависимыми. Установлено, что в незрелом мозге преобладают АМПА-рецепторы с дефицитом или отсутствием GluR2-субъединицы, что приводит к повышенной проницаемости к ионам кальция [25]. Важно подчеркнуть, что аналогичная закономерность обнаружена и у людей [26, 27]. Что касается метаболотропных глутаматных рецепторов в развитии, то доступных данных литературы очень мало. В экспериментах на крысах показано, что пик экспрессии у mGluR1-субъединицы приходится на конец 1-й, тогда как mGluR2, mGluR3 и mGluR5 - на конец 2-й постнатальной недели [28]. Отмечено также, что агонисты группы I mGluR1 являются проконвульсантами, тогда как агонисты группы II и группы III имеют противоположный эффект [29].

Дополнительным фактором повышенной возбудимости незрелого мозга является высокое электрическое сопротивление мембран незрелых нейронов, что приводит к эфаптической синхронизации плотно расположенных и слабо миелинизированных нейронов. Кроме того, незрелость глиальных клеток также может привести к недостаточному удалению внеклеточного калия и избыточной деполяризации нейрональных мембран и, как следствие, к гипервозбудимости развивающегося мозга [30].

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), которая является основным тормозным медиатором в зрелом мозге, на поздних эмбриональных и на ранних постнатальных стадиях играет парадоксальную деполяризующую и возбуждающую роль [31, 32] (рис. 1).

Парадоксальное деполяризующее действие ГАМК в незрелых нейронах обнаружено почти во всех структурах мозга и у разных видов животных, находящихся на разных стадиях эволюции, включая приматов [31, 34]. Однако временные интервалы, когда ГАМК имеет деполяризующее действие, у разных животных и в разных структурах мозга сильно отличаются. Например, нами показано, что в гиппокампе крыс линии Вистар ГАМК обладает деполяризующим действием почти до конца 2-й постнатальной недели [35], а в гиппокампе макаки (Macaque сynomolgus) только до конца 3-го триместра беременности [34].

Гомеостаз Cl^- в нейронах поддерживается главным образом активностью двух противоположно направленных хлорных ко-транспортеров: Na⁺-K⁺-2Cl^- (NKCC1) и K⁺-2Cl^- (KCC2) [36] (см. рис. 1). Выявлено, что активность NKCC1 приводит к увеличению [Cl^-]i, а KCC2 - к выкачиванию Cl- из нервных клеток и соответственно к снижению [Cl^-]i и уменьшению деполяризущего действия ГАМК.

В конце эмбрионального развития и в первые дни после рождения в нейронах преимущественно экспрессирован NKCC1, тогда как экспрессия KCC2 в этот период минимальна [37, 38] (см. рис. 1, в). Примечательно, что в гиппокампе крыс KCC2 достигает максимальной экспрессии к концу 2-й постнатальной недели, когда ГАМК-опосредованные токи перестают быть деполяризующими [35, 36, 39]. Аналогично этому в новой коре человека максимальная экспрессия NKCC1 обнаружена перед рождением, тогда как интенсивная экспрессия KCC2 начинается только в середине 1-го года после рождения [36]. Считается также, что деполяризующая ГАМК в незрелых нейронах является одним из основных факторов в генерации спонтанной синхронизованной сетевой активности, так называемых гигантских деполяризующих потенциалов (ГДП), которые впервые были зарегистрированы еще в 1989 г. Y. Ben-Ari и соавт. [40] на срезах гиппокампа новорожденных крыс. Позже ГДП были нами зарегистрированы и на препарате целого гиппокампа новорожденных крыс [41, 42], что указывает на то, что такая координированная спонтанная активность не является «феноменом» срезов.

ГДП представляет собой распространяющийся, длительный (несколько сот миллисекунд) деполяризующий потенциал с амплитудой до 50 мВ, являющийся результатом синхронной активации группы принципиальных (пирамидных) и вставочных нейронов (ГАМКергических интернейронов). К настоящему времени спонтанная синхронная активность зарегистрирована почти во всех структурах незрелого мозга, включая ретину [43], новую кору [44-46], гиппокамп [40], гипоталамус [47], мозжечок [48] и др. На тесную связь деполяризующей ГАМК и генерации гигантских деполяризирующих потенциалов указывают экспериментальные данные, в которых показано, что такая синхронная сетевая активность усиливается агонистом ГАМК-рецепторов изогувацином и положительным аллостерическим модулятором диазепамом [33], обратимо блокируется антагонистом NKCC1 буметанидом [49] и исчезает к концу 2-й постнатальной недели, когда ГАМК из-за уменьшения [Cl-]I вследствие усиления активности КСС2 теряет деполяризующее действие [50]. Считается, что такая периодическая и синхронная активность нейронов в раннем возрасте необходима для нормальной конструкции взрослого мозга в соответствии с правилом Хебба.

Дебаты о том, что эпилепсия является прогрессирующей патологией, ведутся уже с начала XIX века и продолжаются до настоящего времени. Сложность проблемы патогенеза эпилепсии обусловлена тем, что эпилептиформная активность может, во-первых, возникать в самых различных отделах головного мозга и, во-вторых, распространяться в разных направлениях, вовлекая новые области мозга.

В середине прошлого века F. Morrell [51, 52] сформулировал концепцию «вторичного эпилептогенеза» на основе данных экспериментов на животных и позже - на основе клинических данных. Эта концепция подразумевает, что повторные эпилептиформные разряды, возникающие в поврежденном участке мозга (эпилептогенном очаге), распространяясь на соседние неповрежденные участки и даже на контралатеральное полушарие, могут образовать новый эпилептический фокус - «вторичный эпилептический фокус», который, несмотря на гистологическую целостность, способен самостоятельно генерировать спонтанные эпилептиформные разряды. «Зеркальный фокус» - особая форма вторичного эпилептогенеза, при котором вторичный эпилептический фокус возникает в гомологичном участке контралатерального полушария головного мозга. Используя экспериментальные модели хронической эпилепсии на животных, F. Morrell выделил и описал три стадии вторичного эпилептогенеза - зеркального эпилептического фокуса (ЗЭФ) (рис. 2).

В самых первых экспериментах первичный эпилептический очаг создавался непосредственной инъекцией алюминиевого крема, геля вольфрамовой кислоты или пенициллина непосредственно под мягкую оболочку мозга или прикладыванием на кору мозга небольших дисков, пропитанных кобальтом или другими цитотоксическими веществами [54-56].

Однако все эти модели имеют существенный недостаток, который заключается в том, что токсические вещества могут распространяться на весь мозг через цереброспинальную жидкость или с помощью аксонального транспорта. Метод локального замораживания (жидким азотом) позволил преодолеть эти недостатки [57]. Кроме того, метод «киндлинга» (высокочастотная электрическая стимуляция), впервые предложенный G. Goddard [58], позволил формировать первичные и вторичные очаги без применения каких-либо химических веществ. Эта модель до сих пор широко используется для изучения физиологических и биохимических процессов, происходящих при эпилептогенезе и обучении. Вторичный эпилептогенез F. Morrell также рассматривал как форму или как аналог нейрональной пластичности, происходящей во время обучения.

Наиболее интересные данные по вторичному эпилептогенезу получены в экспериментах с использованием животных, находящихся на различных стадиях эволюции. В этих экспериментах F. Morrell и соавт. [51-53, 59] продемонстрировали формирование независимого вторичного очага у амфибий (лягушка), рептилий (кайман), низших млекопитающих (опоссум) и двух типов приматов: беличья обезьяна (squirrel monkey), которая имеет лисс­энцефалический (гладкий, без извилин) мозг и макака (M. mulatta) с более сложной и извилистой организацией коры мозга. Эти эксперименты вы­явили удивительную закономерность в формировании вторичного очага: чем сложнее организован мозг, тем больше времени требуется для вторичного эпилептогенеза. У амфибий и рептилий время измерялось в минутах, у сумчатой крысы (оппосум) в часах, а у приматов в днях, неделях, месяцах и годах. Показано также, что формирование независимого вторичного фокуса у макак занимало намного больше времени, чем у беличьей обезьяны. На основе этих данных можно предположить, что функциональная и структурная эволюция мозга связана с совершенствованием механизмов, противодействующих вовлечению структур головного мозга в патологическую гиперактивность и вторичный эпилептогенез. Необходимо отметить, что все эти эксперименты были проведены на взрослых животных.

Экспериментально вызванный вторичный эпилептогенез у животных - это хронический процесс усиления патологических изменений, приводящих к прогрессивному ухудшению показателей электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и увеличению частоты и мощности эпилептических припадков во вторичном эпилептическом фокусе. Прямых доказательств существования феномена вторичного эпилептогенеза у людей, как в случае с животными, нет. Поэтому, среди клиницистов вопрос о возможности вторичного эпилептогенеза у людей до сих пор остается спорным главным образом из-за того, что в большинстве случаев эпилепсия у людей является результатом травм, инфекций, сосудистых нарушений и/или генетических аномалий, при которых четко разделить истинный вторичный очаг от фоновой патологии невозможно. Поэтому в этих случаях наличие у больных мультифокальных или билатерально синхронизованных эпилептических разрядов может только косвенно указать на вторичный эпилептический фокус, поскольку, во-первых, первичный и вторичный фокус могут иметь общую этиологию и, во-вторых, для формирования вторичного фокуса необходимы временной интервал и каузальная связь между первичным и вторичным эпилептогенезом. F. Morrell и соавт. [59] проанализировали 68 больных эпилепсией, связанной с опухолью в одном полушарии головного мозга, у 26 из них было доказано наличие в контралатеральном полушарии эпилептического фокуса. После хирургического удаления опухоли у 8 из 26 пациентов контралатеральная сторона продолжала генерировать эпилептиформные разряды. Похожие результаты были получены также R. Gilmore и соавт. [60], которые описали 7 (из 22) случаев вторичного эпилетогенеза у больных с односторонней височной опухолью.

В пользу существования вторичного эпилептогенеза говорят также результаты недавних клинических исследований женщины, у которой в 12 лет была диагностирована четкая односторонняя (правосторонняя) височная эпилепсия [61]. Позже было обнаружено, что иктальные разряды, изначально возникающие в правом гиппокампе во время приступов, распространяются в левый гиппокамп. После правой амигдала-гиппокампэктомии судороги у пациентки продолжались и они были аналогичны более ранним судорогам. Исследования показали, что причиной судорог являлся левый гиппокамп, в котором возникали спонтанные иктальные разряды. Авторы сделали вывод, что распространяющиеся повторные иктальные разряды, генерируемые правым гиппокампом, могут быть причиной возникновения нового эпилептического очага в левом гиппокампе. Однако авторы не смогли исключить существование изначального левостороннего гиппокампального склероза, который также мог быть причиной послеоперационной эпилептиформной активности, поскольку магнитно-резонансная томография (MPT) была проведена только после операции.

Тем не менее, несмотря на невозможность получения прямых доказательств существования феномена вторичного эпилептогенеза у людей, наличие многочисленных экспериментальных данных, полученных на разных видах позвоночных животных, начиная от лягушек и кончая приматами, убедительно указывают на возможность аналогичного механизма эпилептогенеза у людей, особенно, в незрелом мозге детей, который обладает повышенной склонностью к генерации эпилептиформной активности и эпилептогенезу [59, 62].

Прежде всего необходимо подчеркнуть, что незрелый мозг новорожденных не является просто уменьшенной копией или версией мозга взрослых [3]. Незрелый мозг во время развития и созревания постоянно претерпевает множество структурных и функциональных изменений, начиная с рождения новых клеток, их миграции, роста, установления и переустанавления многочисленных клеточных контактов, кончая смертью определенных клеток. Этот период, как уже было описано выше, характеризуется также повышенной возбудимостью и склонностью к эпилептогенезу.

К настоящему времени существует множество экспериментальных моделей эпилептогенеза как in vivo, так in vitro. Модели на животных могут быть использованы для решения многих задач, таких как исследования патофизиологических механизмов эпилепсии, испытание и разработка новых средств лечения, изучение последствий повторяющихся эпилептических разрядов и др. Однако в настоящее время адекватных in vivo моделей, позволяющих изучать механизмы вторичного эпилептогенеза в незрелом мозге, почти нет. Подавляющее большинство моделей для исследования эпилептогенеза разработаны на взрослых животных и не пригодны для изучения детской эпилепсии и, тем более, для исследования механизмов вторичного эпилептогенеза у детей по многим причинам [63]. У новорожденных и у детей раннего возраста основными причинами генерации эпилептиформных разрядов являются гипоксическая-ишемическая энцефалопатия, температурная лихорадка и различные травмы головного мозга во время родов [18]. Хорошо известно, что такие нарушения у детей намного чаще, чем у взрослых сопровождаются развитием эпилептического статуса, называемого как стойкое эпилептическое состояние с повторяющимися или непрерывными приступами, которые продолжаются более 30 мин, или между которыми больной не может полностью достичь своего нормального психического и неврологического состояния [64]. Предполагается, что генерация повторных иктальных эпилептиформных разрядов и возникновение эпилептического статуса у новорожденных и детей раннего возраста являются одним из основных факторов риска эпилептогенеза в процессе развития [65]. Поэтому в настоящее время для запуска и исследования детского эпилептогенеза наиболее часто используются модели, в которых у постнатальных животных вызывают эпилептиформные разряды или эпилептический статус при помощи различных химических конвульсантов, таких как пилокарпин, каинатная кислота и др.; ишемического инсульта мозга, искусственного повышения температуры тела (фебрильные судороги) или повторной высокочастотной электрической стимуляции определенных структур мозга - модель «киндлинга» [63, 64, 66, 67]. Однако все эти модели недостаточно адаптированы для исследования механизмов и необходимых условий вторичного эпилептогенеза в незрелом мозге, главным образом, из-за невозможности разделить фоновое патогенное воздействие конвульсанта от эпилептогенного эффекта повторяющихся эпилептиформных разрядов per se на формирование эпилептического фокуса. Например, локальная инъекция химических конвульсантов на определенные структуры мозга из-за диффузии или аксонального транспорта не будет действовать локально.

Для исследования механизмов и необходимых условий вторичного эпилептогенеза в незрелом мозге нами была разработана новая модель, которая позволяет искусственно вызвать генерацию локальных повторных эпилептиформных разрядов и исследовать их эпилептогенный эффект на интактной ткани. Был разработан новый препарат, который состоит из двух взаимосвязанных комиссуральными волокнами интактных гиппокампов новорожденных (7-9-дневных) крыс или мышей [41, 68], что приблизительно соответствует 1-му году жизни человека (рис. 3) [26, 69].

Используя эту модель ЗЭФ, нам удалось установить некоторые условия и фундаментальные механизмы индукции и экспрессии вторичного эпилептического очага. Во-первых, одним из необходимых условий индукции ЗЭФ является активация НМДА-рецепторов. Блокада НМДА-опосредованных синаптических токов аппликацией антагониста НМДА-рецепторов на контралатеральный гиппокамп не препятствовала генерации и распространению эпилептиформных разрядов, иницированных каинатом в ипсилатеральном гиппокампе, но предотвратила формирование ЗЭФ [42]. Парадоксально, но аналогичный результат был получен и в экспериментах с избирательным блокированием ГАМК-ре­цеп­торов [70], что указывает на важную роль ГАМКергической синаптической передачи во вторичном эпилептогенезе. Во-вторых, дальнейший анализ электрических регистраций в контрольных экспериментах и в экспериментах с антагонистами НМДА- и ГАМК-рецепторов показал, что одним из важнейших условий формирования ЗЭФ является наличие высокочастотных осцилляций (ВЧО), 60-120 Гц во время повторных распространяющихся иктальных разрядов. В контрольных экспериментах повторные иктальные разряды с осцилляциями с частотной полосой не выше 10-20 Гц не сопровож­дались формированием ЗЭФ, так же как и в экспериментах с антагонистами НМДА- и ГАМК-рецепторов, в которых контралатеральный гиппокамп в отличие от ипсилатерального генерировал иктальные разряды без высокочастотных осцилляций. Поэтому, наличие или отсутствие ВЧО могут быть использованы как биомаркеры эпилептогенности иктальных разрядов в незрелом мозге [70]. В-третьих, экспрессия эпилептического фокуса сопровождалась значительными изменениями в функционировании ГАМКергической системы. Нами обнаружено, что в нейронах ЗЭФ ГАМК обладает повышенным возбуждающим действием из-за перманентно повышенной [Cl^-]I и положительного сдвига потенциала реверсии ГАМК-опосредованных постсинаптических токов [42, 49, 70]. Возбуждающее действие ГАМК было обнаружено также и в срезах мозга, полученных в ходе хирургического удаления эпилептического очага, у пациентов с фармакорезистентной эпилепсией [71]. Поэтому понимание молекулярных и клеточных механизмов и роли ГАМКергической системы в формировании вторичного эпилептического фокуса имеет огромное значении как в лечении эпилепсии, так и в предотвращении эпилептогенеза, т.е возникновения эпилепсии.

Поскольку в наших экспериментах ключевым элементом в формировании эпилептического фокуса является возбуждающее действие ГАМК, которое обусловлено хронически повышенной концентрацией [Cl-]i, в первую очередь возникает вопрос о механизмах, лежащих в основе изменений хлорного гомеостаза.

Как уже было сказано, в ЦНС хлорный гомеостаз поддерживается главным образом двумя противоположно направленными хлорными ко-транспортерами: NKCC1 - хлорный импортер и КСС2 - хлорный экспортер. Считается, что в незрелом мозге наиболее активен NKCC1, тогда как максимальная активность КСС2 достигается только в зрелых нейронах. Поэтому мы в первую очередь исследовали роль NKCC1 в генерации, распространении эпилептиформных разрядов и формировании вторичного эпилептического очага [49]. Нами впервые показано, что фармакологическая или генетическая блокада (Knock out) NKCC1 не предотвращала ни генерацию и распространение эпилептиформных разрядов, ни формирование ЗЭФ. Однако специфический антагонист NKCC1, буметанид, полностью блокировал спонтанную и вызванную эпилептиформную активность в ЗЭФ. Используя метод измерения ионных токов (пэтч-кламп): регистрацию одиночных НМДА- и ГАМК-активи­руе­мых ионных каналов, показано, что буметанид уменьшает возбуждающее действие ГАМК за счет частичного снижения [Cl^-]i и отрицательного сдвига потенциала реверсии ГАМК-опосредованных постсинаптических токов [49, 72]. Таким образом, буметанид, несмотря на то что не способен предотвратить вторичный эпилептогенез, является эффективным антиконвульсантом. В настоящее время буметанид проходит клинические испытания в качестве противоэпилептического препарата у детей.

Далее, используя различные электрофизиологические и иммунохимические методы, мы продемонстрировали, что повышенная [Cl^-]i и возбуждающее действие ГАМК в ЗЭФ является результатом интернализации и даун-регуляции КСС2 [72]. В контрольной ткани фармакологическая блокада КСС2 при помощи специфического антагониста увеличивала внутринейрональную концентрацию хлора и вызывала генерацию эпилептиформной активности. Кроме того, в экспериментах на 20-дневных эмбрионах мышей с генетической блокадой КСС2 мы впервые зарегистрировали спонтанные эпилептиформные разряды, что также косвенно указывает на важную роль КСС2 в механизмах эпилептогенеза в незрелом мозге [73].

На основе собственных и литературных данных нами построена гипотеза об основных условиях и механизмах вторичного эпилептогенеза (рис. 5).