Одним из наиболее активно развивающихся направлений в изучении патогенеза заболеваний нервной системы является исследование роли взаимодействия нервной и иммунной систем [24]. Хорошо известны опосредованные механизмы их взаиморегуляции через нейроэндокринные механизмы, вегетативную нервную систему, центральные органы иммунорегуляции и т.д. В настоящее время все большее внимание привлекают прямые медиаторы этого взаимодействия, такие как цитокины и нейромедиаторы, в первую очередь биогенные амины и опиоидные пептиды, имеющие рецепторы на клетках и нервной, и иммунной систем [12, 13].

Среди биогенных аминов как медиаторов указанных систем наиболее активно изучались катехоламины. Получены данные о нарушениях продукции катехоламинов в мононуклеарных клетках периферической крови больных РС [15]. В то же время уровень норадреналина в ЦНС изменяется у пациентов с РС и у грызунов с моделью РС - экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (ЭАЭ). Снижение уровня норадреналина в ЦНС соответствует усилению воспаления и повреждению нервной ткани при ЭАЭ [27]. При этом увеличение уровня норадреналина в ЦНС при использовании селективного блокатора обратного захвата норадреналина предотвращало прогрессирование симптомов ЭАЭ. Предполагают, что избирательное повышение уровня норадреналина в ЦНС может приводить к улучшению течения РС и ЭАЭ, уменьшая воспаление в мозге, не оказывая влияния на периферический иммунный ответ [27].

В последнее время особое внимание уделяется роли дофамина (ДА), серотонина и гистамина, которые участвуют в осуществлении двигательных функций, когнитивных и психоэмоциональных процессов, нейроэндокринной секреции [16]. При РС ДА может участвовать в механизмах развития двигательных и нейропсихологических нарушений, которые могут быть напрямую связаны с иммунорегуляцией. Показано [25], что ДА может участвовать в модуляции иммунитета через рецепторы на иммунокомпетентных клетках, в том числе на Th17, играющих существенную роль в патогенезе РС. Высокий и стойкий уровень экспрессии рецепторов ДА отмечен на В-клетках и естественных киллерных клетках (NK-клетках), также активно участвующих в иммунорегуляции [23].

Депрессия очень часто наблюдается у больных РС и как реакция на тяжелое заболевание, и как проявление очагового поражения головного мозга [5, 11]. При длительном наблюдении за больными РС отмечено, что более 59% имели хотя бы раз эпизод тяжелой депрессии и более 90% - легкой [10, 11]. Депрессия оказывает сильное влияние на качество жизни и работоспособность больных РС, влияя на приверженность к длительной патогенетической терапии [6, 19]. В последнее время все более активно обсуждается роль нейроиммунных взаимодействий в патогенезе депрессивных эпизодов при РС [32, 33]. В частности, к депрессии могут приводить нарушение баланса провоспалительных цитокинов и биогенных аминов, активация гипатоламо-гипофизарно-адреналовой оси и снижение уровня нейротрофических факторов, которые наблюдаются при РС. Более того, если подобные процессы при РС играют определенную роль в патогенезе депрессии, и если депрессия, в свою очередь, влияет на нейрофизиологические процессы, имеющие отношение к иммунной функции, то лечение депрессии потенциально может оказать положительный эффект на прогрессирование РС [21].

Существует несколько нейроиммунных гипотез возникновения депрессии при РС. Среди них привлекают внимание две взаимодополняющие гипотезы: цитокиновая и гипотеза биогенных аминов [21, 28]. Цитокиновая гипотеза развития депрессии при РС основана на следующих положениях: 1) депрессия чаще наблюдается у пациентов с заболеваниями, которые связаны с иммунной дисфункцией; 2) экзогенное введение одного из основных активационных цитокинов интерлейкина-1 (ИЛ-1) экспериментальным животным индуцирует «болезненное поведение», которое сопровождается сонливостью, снижением мотивации, т.е. близко к состоянию депрессии у человека, эти состояния купируются приемом антидепрессантов; 3) некоторые цитокины активируют гипоталамо-гипофизарно-адреналовую ось и норадренергическую систему мозга, что отмечается у больных депрессией; 4) некоторые цитокины активируют серотонинергическую систему, которая вовлечена в патогенез большинства депрессивных расстройств; 5) лечение больных РС препаратами бета-интерферона может усиливать симптомы депрессии [18, 21, 28].

Одним из характерных проявлений патологического процесса при РС являются локальные и диффузные нейродегенеративные изменения, клинически наиболее отчетливо проявляющиеся в изменении когнитивных функций. Нарушения когнитивных функций выявляются уже на ранних стадиях РС, прогрессируя по мере нарастания длительности и тяжести заболевания, достигая в тяжелых случаях уровня «подкорковой» деменции [1-3, 8, 29, 30]. Этот характерный для РС симптом может существенно влиять на уровень инвалидности и качество жизни пациентов [3, 8] и выявляется даже у детей с РС [7]. Многочисленные исследования связи между изменениями, обнаруживаемыми при магнитно-резонансной томографии (МРТ) при РС и вероятностью/тяжестью когнитивных нарушений, позволили выявить ряд ассоциаций, но не настолько сильных, чтобы объяснить раннее начало и высокую частоту этих нарушений [14, 31, 34].

Развитие когнитивного дефицита при РС может быть напрямую связано с механизмами повреждения нервной ткани, в частности иммунологическими. Связь иммунохимических и нейропсихологических показателей при РС может быть обусловлена наличием общих рецепторов для иммунной и центральной нервной систем, влиянием иммунокомпетентных клеток на скорость передачи нервного импульса и работу синапсов, действием биогенных аминов и нейротрофических факторов. Показана связь между продукцией провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-6, и формированием когнитивного дефицита у больных РС [26].

Другая гипотеза связана с нарушением обмена катехоламинов и генезом нейропсихологических нарушений при РС. Отмечена ассоциация между функционированием гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси и выраженностью когнитивных нарушений при РС [20]. Роль обмена ДА в патогенезе когнитивных нарушений при РС с точки зрения нейроиммунных взаимодействий пока не изучалась.

Цель данной работы - изучение возможных ассоциаций между клиническими характеристиками РС, наличием и тяжестью депрессии и когнитивных нарушений, иммунологическими показателями (характеристики цитокинового статуса, экспрессии активационных молекул) и концентрацией ДА и его метаболитов в плазме у пациентов с РС.

В исследование были включены 71 пациент, 40 женщин и 31 мужчина в возрасте от 23 до 62 лет (средний - 43±9 лет), с диагнозом РС по критериям МакДональда (2005).

Большинство больных (80,4%) имели высшее образование, остальные 19,6% имели среднее специальное образование. Возраст пациентов на момент дебюта заболевания варьировал от 18 лет до 51 года (средний - 33±9 лет). В качестве первых симптомов в дебюте РС отмечены двигательные нарушения (62,8%), нарушения зрения (25,5%), нарушения чувствительности (5,9%), полисимптомное начало было у 5,9% больных. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 2 до 27 лет (в среднем - 9,4±6,9 года).

Все больные на момент исследования получали глатирамера ацетат (копаксон) по 20 мг подкожно каждый день, который относится к группе ПИТРС (препаратов, изменяющих течение РС). Длительность курса терапии была не менее 3 мес. Не отмечено влияния копаксона на вероятность развития и тяжесть депрессий при РС, поэтому в исследование включали только больных, получающих этот препарат.

Все пациенты проходили нейропсихологическое обследование с использованием батареи нейропсихологических тестов, включающих скриниговую оценку наличия когнитивной дисфункции (MMSE), выявление нарушений кратковременной памяти (тест 10 слов по А. Лурии), зрительного гнозиса (тест узнавания 12 недорисованных изображений), внимания, способности переключаться с одного вида деятельности на другой (тесты PASAT, STROOP), а также выраженности депрессии по шкале Бека. По результатам тестирования по последней шкале больные были разделены на 2 группы в зависимости от наличия у них симптомов депрессии. В 1-ю группу вошли больные, набравшие 19 баллов и меньше по опроснику депрессии Бека, во 2-ю - больные, имеющие симптомы депрессии (оценка более 19 баллов).

Депрессия является кофактором, влияющим на результаты нейропсихологического тестирования, как и любой другой психометрической методики, что препятствует объективной оценке когнитивных нарушений у пациентов с РС. Поэтому все больные, имеющие симптомы депрессии (19 пациентов), были исключены из последующего анализа когнитивных функций. Оставшиеся 52 больных (38 женщин и 14 мужчин) были еще раз разделены на 2 подгруппы по результатам нейропсихологического тестирования. При разделении пациентов на подгруппы определяющим тестом был выбран тест STROOP, что обусловлено результатами наших предшествующих исследований [4], показавших наибольшую информативность данного теста при РС. У 34 больных показатели по данному тесту не выходили за нормативные уровни, а у 18 - оказались ниже уровня в 39 баллов (CW<39), что позволило выделить их в подгруппу с когнитивными нарушениями.

Иммунобиохимические исследования включали анализ уровня экспрессии CD80, CD86 на моноцитах и В-клетках, TLR2 и TLR4 на моноцитах, D3- и D5-рецепторов к дофамину (D3R и D5R) на моноцитах и B-клетках методом проточной цитометрии, а также определение уровней ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12р40 в плазме, уровня ДА в плазме и ванилилминдальной кислоты (ВМК, метаболит ДА) в моче иммуноферментным методом. Забор крови проводили в утренние часы до еды.

Мононуклеарные клетки крови (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина («ПанЭко», Москва), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,3), ресуспендировали в ФСБ с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и подсчитывали.

Чтобы выявить CD80, CD86, TLR2 и TLR4 на моноцитах и B-клетках, аликвоты по 500 000 клеток (объем 50 мкл) окрашивали флюоресцеин-изотиоцианат-меченными моноклональными антителами (МАТ) к CD14 или CD19 («Beckman Coulter», США) в сочетании с фикоэритрин-меченными МАТ к CD80, CD86 («Beckman Coulter»), TLR2 или TLR4 («eBioscience», США). В контрольные пробы вместо фикоэритрин-меченных МАТ добавляли антитела тех же метки и изотипа, но не имеющие антигенных мишеней в клетках человека (изотип-контроль). Клетки инкубировали с антителами 20 мин при 4 °C, после чего отмывали в 1 мл 0,5% БСА на ФСБ (450 g, 5 мин) и ресуспендировали в том же растворе.

Для окраски на D3R и D5R использовали методику McKenna и соавт. [23]. МНК инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к D3R или D5R фирмы «Merck Biosciences» (ФРГ) в разведении 1/100 (20 мин, 4 °C). Контрольные аликвоты МНК инкубировали без антител. Клетки отмывали 2 раза в 0,5% БСА, после чего добавляли к ним фикоэритрин-меченные F(ab)2-фрагменты козьих антител к IgG кролика, а также флюоресцеин-изотиоцианат-меченные МАТ к CD14 или CD19. После 20-минутной инкубации при 4 °C клетки еще 2 раза отмывали и ресуспендировали для анализа.

Образцы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur с использованием программы CellQuest («BD Bioscience», США). B-клетки идентифицировали как CD19⁺-события со светорассеянием лимфоцитов, моноциты - как CD14high-события. В обеих популяциях оценивали процент клеток, позитивных по маркерам CD80, CD86, TLR2, TLR4, D3R и D5R. Для поправки на неспецифическое окрашивание из полученных значений вычитали процент клеток, позитивных при окраске изотоп-контролем (как правило, <1%). Экспрессию маркеров выражали также в виде средней интенсивности флюоресценции (СИФ) популяций моноцитов и B-клеток по этим маркерам; для поправки на неспецифическое окрашивание из полученных значений вычитали СИФ при окраске изотип-контролем.

Уровни ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12 (p40+p70) в сыворотках крови измеряли путем сэндвич-имунноферментного анализа (ИФА); для определения ИЛ-6 и ИЛ-10 использовали наборы фирмы «Цитокин» (Санкт-Петербург), ИЛ-12 - фирмы «Biosource/Invitrogen» (Великобритания). Уровни ДА в сыворотках и ВМК в моче определяли путем конкуретного ИФА с помощью наборов фирм LDN и DSL (Германия) соответственно. Во всех случаях следовали инструкциям производителей наборов. Уровни всех аналитов, кроме ВМК, выражали в пг/мл, уровни ВМК - в мкг/мл.

Все больные подписали информированное согласие на участие в данном исследовании.

Статистическую обработку результатов проводили с помощи программы SPSS.

По демографическим характеристикам пациенты с РС с депрессией и без депрессии достоверно не различались, хотя уровень тяжести РС по шкале EDSS был несколько выше в группе больных с депрессией (табл. 1).

По данным проточной цитометрии, в группе пациентов, имеющих симптомы депрессии, оказался достоверно ниже уровень экспрессии активационных молекул CD86 на моноцитах и В-клетках, уровень экспрессии D3-рецепторов к ДА на моноцитах и В-клетках, но выше экспрессия D5-рецепторов на В-клетках (табл. 2).

Был проведен анализ ассоциаций между клиническими и иммунобиохимическими показателями во всей группе больных и подгруппе больных, имеющих депрессию на момент обследования. Несмотря на малое число наблюдений (19 случаев), корреляционный анализ по методу Спирмена выявил наличие достоверной отрицательной ассоциации между содержанием метаболита ДА (ВМК) в моче и уровнем депрессии у этих больных (r=–0,571, р=0,028). Другими словами, чем выше продукция ДА в организме (и, соответственно, чем выше уровень его метаболита ВМК в моче), тем менее выражены проявления депрессии, если она имеет место.

При анализе результатов обследования всех 71 пациентов оказалось, что уровень ВМК в моче обратно связан с показателем EDSS (r=-0,397, p<0,01), т.е. чем меньше уровень ВМК, чем выше инвалидность. При этом не отмечено ассоциаций между этим показателем и длительностью РС, частотой и количеством перенесенных обострений и другими клинико-демографическими показателями.

Как отмечено выше, пациенты без депрессии были разделены на 2 подгруппы в зависимости от наличия когнитивных нарушений. Пациенты в обеих подгруппах были сопоставимы по полу и возрасту (табл. 4).

При анализе иммунобиохимических показателей оказалось, что в подгруппе больных, имеющих когнитивные нарушения, оказалась достоверно выше экспрессия TLR2-рецепторов, отвечающих за активацию моноцитов и, согласно данным литературы [22], участвующих в механизмах развития воспалительных процессов в ЦНС.

В этой же подгруппе пациентов была достоверно ниже экспрессия D3- и D5-рецепторов к ДА, что предполагает участие ДА не только в патогенезе депрессии, но и в развитии когнитивной дисфункции при РС. Особенно отчетливо был снижен уровень D3-рецептора на В-клетках - почти в 3 раза по сравнению с больными, не имевшими нарушений по данным нейропсихологического тестирования (табл. 5).

При проведении корреляционного анализа методом Спирмена были выявлены статистически значимые корреляции между иммунохимическими и нейропсихологическими показателями. В подгруппе пациентов, имеющих когнитивные нарушения, отмечена прямая ассоциация между экспрессией D3-рецепторов к ДА на моноцитах и концентрацией ИЛ-10 в плазме (r=0,699, p<0,01). Другими словами, у этих пациентов снижение экспрессии рецепторов ДА ассоциировано с низким уровнем продукции противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

У пациентов без депрессии, имеющих когнитивные нарушения (18 больных), отмечена ассоциация между концентрацией ВМК в моче, отражающей уровень продукции ДА в организме, и результатами теста STROOP (r=0,82, p<0,01), что позволяет предположить участие ДА в развитии когнитивного дефицита у больных РС. Этот результат подтверждает данные наших предшествующих исследований [4], показавших, что тест STROOP является наиболее информативным тестом для оценки когнитивного дефицита у больных РС.

В настоящем исследовании получены данные, свидетельствующие, что у больных РС, имеющих симптомы депрессии, имеется снижение экспрессии поверхностных маркеров CD86 и D3R на моноцитах и В-клетках, ниже содержание ИЛ-6, ИЛ-10 и ДА в крови. Важно отметить, что у больных РС с депрессией одновременно снижены уровни и ДА, и D3R, что укладывается в «моноаминовую» теорию депрессии.

Согласно данным литературы, ДА усиливает продукцию ИЛ-10 [9], тогда как повышение концентрации ИЛ-10, являющегося противовоспалительным цитокином, ассоциировано с уменьшением симптомов депрессии и хронической усталости [17]. У больных с неблагоприятным прогнозом, имеющих когнитивные нарушения [4], выявлена ассоциация между экспрессией D3-рецепторов к ДА на моноцитах и концентрацией ИЛ-10 в крови, что предполагает наличие связи между ДА и иммунорегуляцией. Это может объяснять прогностическое значение результатов нейропсихологического тестирования при РС [4]: 1) раннее выявление когнитивных нарушений достоверно связано с развитием РС после первого эпизода неврологических нарушений [35]; 2) наличие изменений при тестировании прямо связано с нарастанием тяжести РС при длительном наблюдении [4]. В то же время необходимо отметить, что в обследованной подгруппе пациентов с изменениями нейропсихологических функций была выше длительность РС и ниже возраст начала заболевания, что может модулировать результаты сравнения, хотя при корреляционном анализе с исключением этих факторов ассоциации, полученные при сравнении средних величин, сохраняли свое значение. На основании полученных данных можно утверждать, что «цитокиновая» гипотеза происхождения депрессии при РС и гипотеза «биогенных аминов» являются взаимодополняющими. Возможно, дальнейшее изучение взаимодействия ДА и цитокинов позволит лучше понять генез депрессии при РС, ее влияние на течение иммунопатологического процесса и, соответственно, усовершенствовать методы ее коррекции.

По нашим данным, у больных РС с когнитивными нарушениями снижен уровень экспрессии рецепторов к ДА (D3R и D5R) на моноцитах и В-клетках. При увеличении экспрессии рецепторов TLR2, свидетельствующем об активации моноцитов, наблюдается снижение нейропсихологических показателей (снижение внимания и скорости обработки информации, определяемых с помощью теста PASAT).

В подгруппе пациентов, имеющих когнитивный дефицит, наиболее стойкие ассоциации выявлены между результатами нейропсихологического тестирования и содержанием метаболита ДА в моче.

Отмечено значительное повышение экспрессии TLR2 на моноцитах при когнитивной дисфункции, что указывает на активацию моноцитов и/или их повышенную способность активироваться под действием лигандов TLR2, а также выявлены ассоциации между уровнем ДА и когнитивными нарушениями.

Таким образом, полученные данные позволяют предполагают участие ДА в патогенезе депрессии при РС, связанное и с изменениями в иммунорегуляции, а также роль ДА и, возможно, активации моноцитов (по TLR2) в патогенезе когнитивных нарушений при РС.