Для пациентов, страдающих сердечной недостаточностью в терминальной стадии, предпочтительной стратегией лечения является трансплантация сердца, которая в большинстве случаев обеспечивает увеличение продолжительности и улучшение качества жизни [1]. В экономически развитых странах, несмотря на предпринимаемые законодательные и медико-социальные меры, лист ожидания для пересадки сердца непрерывно удлиняется из-за нехватки донорских органов. Так, в США в течение года лишь половине больных из этого списка проводится трансплантация сердца, что приводит к высокой смертности пациентов, ожидающих очереди [2]. Наряду с дефицитом донорских сердец для обеспечения потребности в трансплантации актуальными являются проблемы достаточно частой первичной дисфункции и ранней недостаточности трансплантатов у реципиентов, в связи с чем активно обсуждаются вопросы модификации используемых протоколов и времени консервации донорского материала [3—5].

В настоящее время среднее допустимое время холодовой защиты донорского сердца составляет 4—6 ч, при этом доминирует установка о предпочтительном использовании для пересадки органа с консервацией менее 4 ч, поскольку превышение этого периода (4 ч и более) может привести к значительно более низкой выживаемости [6]. Ведущим фактором, ответственным за снижение выживаемости трансплантата, является ишемия донорской сердечной мышцы в связи с отключением от системного кровотока и последующим длительным бескислородным периодом консервации [7]. Для кардиопротекции донорского органа от ишемии разработаны фармакологические протоколы консервации [8], например, с помощью раствора Bretschneider «внутриклеточного» типа, стабилизирующего клеточные мембраны. Дополнительным защитным фактором служит снижение температуры консервирующего раствора, направленное на замедление метаболизма клеток и, следовательно, уменьшение их потребности в кислороде. Таким образом, транспортировку донорского сердца осуществляют с помощью фармакохолодовой защиты, обеспечивающей нивелирование ишемии и успешную реперфузию в организме реципиента.

Тем не менее не только длительная острая кислородная недостаточность, но и факторы защиты органа наносят комплексную травму, серьезно нарушая жизнеспособность и функцию сердца, в том числе повышая его иммуногенность, приводящую к острому и хроническому отторжению органа. Это накладывает ограничения на использование маргинальных по времени консервации донорских сердец, что в конечном итоге усугубляет дисбаланс между количеством пациентов, ожидающих трансплантацию, и доступными донорами [9]. Одним из путей решения проблемы дефицита донорских сердец может быть изучение и обоснование безопасного продления принятого периода холодовой консервации донорского сердца.

После трансплантации в установленном временном порядке для последующей оценки степени отторжения органа пациентам выполняют эндомиокардиальную биопсию, которая в настоящее время остается общепризнанным диагностическим стандартом. Однако световая микроскопия парафиновых срезов сердца наряду с преимуществами имеет ряд ограничений, в том числе стереотипность диагностируемых изменений и низкую чувствительность. Активно ведется поиск неинвазивных методов и надежных биомаркеров для скрининга отторжения трансплантата сердца [10]. Электронная микроскопия детализирует повреждение кардиомиоцитов и других клеточных элементов при отторжении кардиотрансплантата [11], кроме того, ультраструктурный уровень исследования позволяет раскрыть потенциал увеличения времени консервации донорского сердца.

Цель работы — на гистологическом и ультрамикроскопическом уровнях сравнить биоптаты донорского сердца в условиях стандартного (до 240 мин) и продленного (более 240 мин) периода фармакохолодовой консервации.

Материал и методы

Исследованы биоптаты ушка предсердия донорских сердец: 1-я группа — 8 образцов после холодовой ишемии трансплантата в растворе Bretschneider (Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Германия) до 240 мин: Me 140 мин [Q1 140; Q3 150], 2-я группа — 5 образцов после продленного периода холодовой ишемии более 240 мин: Me 375 мин [Q1 245; Q3 375] с помощью световой микроскопии полутонких срезов и трансмиссионной электронной микроскопии с последующим стереологическим и статистическим анализом. Исследование выполнено в соответствии с этическими принципами проведения медицинских исследований, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, и одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е. Н. Мешалкина» Минздрава России, в котором проводили операции по трансплантации донорских сердец и наблюдение пациентов-реципиентов.

Биопсию предсердия проводили перед операцией, образцы фиксировали в охлажденном 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,4). Перед проводкой ткань дофиксировали в 1% растворе OsO₄, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне и заливали в смесь эпоксидных смол; блоки полимеризовали в термостате при 60°C в течение 24 ч. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие (30—50 нм) срезы получали на ультрамикротоме LKB III (Швеция). Полутонкие срезы монтировали на обезжиренные предметные стекла и окрашивали на гистологическом столике (37°C) в капле 1% водного раствора толуидинового синего или азура II, затем изучали с помощью микроскопа Axio Scope.A1 (Zeiss, Германия) при увеличении 630. Контрактурные изменения миофибрилл кардиомиоцитов оценивали по критериям [12]. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца в парах щелочи натрия по Рейнольдсу и исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВт и увеличении от 2 до 20 тыс. (авторы благодарны Центру коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН (https://www.bionet.nsc.ru/microscopy) за предоставленное оборудование).

Тканевый и ультраструктурный стереологический анализы проводили на продольных срезах кардиомиоцитов (по 26 наложений тестовой решетки на группу) с помощью программы ImageJ 1.7. При статистической обработке данных использовали программное обеспечение MedCalcStatisticalSoftware, version 18.9.1 (https://www.medcalc.org; 2018) и пакет RStudio (https://www.rstudio.com/). Нормальность распределения полученных данных в группах проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка. Использовали методы непараметрической статистики: межгрупповые сравнения данных проводили с помощью критерия Манна—Уитни. Результаты представлены на графических рисунках в виде медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1; Q3), а также минимального (Min) и максимального (Max) показателей в выборке. Различия считали статистически значимыми при уровне p<0,05.

Результаты

В обеих группах при светооптическом исследовании полутонких срезов биоптатов выявлены различной степени выраженности дистрофические изменения большинства кардиомиоцитов, сопровождающиеся отеком периваскулярных и межклеточных пространств, а также очаговой или диффузной конденсацией компонентов межклеточного матрикса (рис. 1). Следует отметить, что слабо и умеренно выраженные изменения структурной организации кардиомиоцитов были заметны лишь при изучении продольных срезов с визуализацией миофибрилл (рис. 1, а, б, г, д) в отличие от поперечных срезов, на которых особенности сократительного аппарата кардиомиоцитов не просматривались (рис. 1, в, е). На первый план выступали диффузные контрактурные изменения кардиомиоцитов, обусловленные зонами умеренно выраженного сокращения миофибрилл (обратимыми), но достигающими значительной степени в единичных полях зрения в образцах 2-й группы, что визуализировалось по ретракции и интенсивной азурофилии цитоплазмы (рис. 1, г). Кроме того, на продольных срезах некоторых кардиомиоцитов в обеих группах обращали на себя внимание скопления гетерогенных плотных включений преимущественно в перинуклеарных зонах (рис. 1, б, д), которые при электронно-микроскопическом исследовании были расценены как эквиваленты массовой аутофагии по типу митофагии [13].

Рис. 1. Очаговые контрактурные (гиперхромные) и литические изменения миофибрилл в цитоплазме кардиомиоцитов в биоптатах левого предсердия донорских сердец при холодовой ишемии.

а — в — ишемия менее 240 мин, г — е — ишемия более 240 мин; б, д – скопления аутофагосом в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов (стрелки). Полутонкие срезы, окраска азуром II (а, г) и толуидиновым синим (б, в, д, е), ×630. Бар=50 мкм.

При проведении тканевого стереологического исследования на продольных полутонких срезах миокарда оценивали объемную плотность (V_v) паренхимы (кардиомиоцитов) без признаков аутофагии, кардиомиоцитов с наличием аутофагосом в цитоплазме, а также объемную плотность (V_v) стромы (в том числе микроциркуляторное русло и межклеточный матрикс) (таблица). При сравнении первичных стереологических данных, а также полученных на их основе вторичных стереологических показателей (отношения паренхимы к строме (рис. 2) и отношения фокусов аутофагии к сердечной паренхиме без аутофагии (рис. 3)) статистически значимые различия между двумя группами не выявлены, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния продленной фармакохолодовой ишемии на тканевую организацию миокарда и, следовательно, о возможности безопасного продления периода консервации донорского органа.

Первичные стереологические показатели тканевой и внутриклеточной организации донорского миокарда в условиях холодовой ишемии менее 240 мин (1-я группа) и более 240 мин (2-я группа)

Примечание. При сравнении средних величин пациентов ١-й и ٢-й групп по критерию Манна—Уитни: * — p=0,0196; ** — p=0,0106.

Рис. 2. Паренхиматозно-стромальное отношение в условиях холодовой ишемии донорского сердца менее 240 мин (1-я группа) и более 240 мин (2-я группа).

Отсутствие статистически значимых различий, критерий Манна—Уитни.

Рис. 3. Отношение паренхимы с аутофагосомами к паренхиме без аутофагии в условиях холодовой ишемии донорского сердца менее 240 мин (1-я группа) и более 240 мин (2-я группа).

Отсутствие статистически значимых различий, критерий Манна—Уитни.

При исследовании биоптатов донорских сердец с помощью трансмиссионной электронной микроскопии были детализированы особенности структуры, достаточно хорошо видимые в обеих группах на полутонких срезах: сохранение эухромности ядер, наличие ядрышек, параллельные пучки поперечно исчерченных миофибрилл.

При более высоком разрешении некоторые ядра характеризовались неровным и даже пилообразным контуром нуклеолеммы, диффузными мелкими глыбками гетерохроматина с тенденцией к маргинализации более крупных (рис. 4, а, г). Миофибриллы в большинстве кардиомиоцитов сохраняли продольную ориентацию, но были расслоены, истончены; саркомеры характеризовались очаговой редукцией Z-линий, сужением изотропных дисков и очаговой деструкцией миофибрилл (рис. 4, б, д); отмечены также литические изменения сократительного аппарата миоцитов (рис. 4, д). Состояние сокращения миофибрилл обусловливало регулярную, хорошо выраженную фестончатость сарколеммы (рис. 4, в). Межмиофибриллярные пространства содержали редуцированное по сравнению с физиологической нормой при отсутствии ишемии количество мелких гетерогенных полиморфных митохондрий с повышенной электронной плотностью матрикса и деструкцией наружной мембраны (см. рис. 4, б, д).

Рис. 4. Ультраструктурная характеристика кардиомиоцитов и эндотелиоцитов в биоптатах левого предсердия донорских сердец в условиях холодовой ишемии.

а — в — ишемия менее 240 мин, г — е — ишемия более 240 мин; а, г — в кардиомиоцитах параллельные пучки миофибрилл и очаги внутриклеточного отека. ×2500; б — в саркомерах редукция изотропных дисков; б, д — истончение, расслоение, очаговый лизис (д, стрелки) миофибрилл. ×20 000; в, е — внутриклеточный отек и вакуолизация мембранных органелл эндотелиоцитов микроциркуляторного русла; выраженная фестончатость сарколеммы кардиомиоцита (в, стрелки). ×6000. Трансмиссионная электронная микроскопия.

Почти для всех кардиомиоцитов обеих групп характерен в различной степени выраженный внутриклеточный отек, достигающий максимальных проявлений при сочетании с литическими изменениями миофибрилл (см. рис. 4, в, е). В свободном от миофибрилл и митохондрий электронно-прозрачном цитозоле отмечены одиночные короткие профили саркоплазматической сети, преимущественно свободные от рибосом. Зерна гликогена и липидные капли не выявлены; включения были сосредоточены преимущественно перинуклеарно и представлены крупными гетерогенными осмиофильными аутофагосомами, содержащими остатки митохондрий, что можно расценивать как митофагию, направленную на восполнение пластических ресурсов в условиях достаточно длительной для миокарда холодовой ишемии.

Поскольку на полутонких срезах скопления достаточно крупных аутофагосом локализовались в основном в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов (в отличие от единичных периферических), этот маркер усиленного метаболизма и/или патологического воздействия на клетки был исследован количественно на продольных ультратонких срезах кардиомиоцитов. В качестве первичных стереологических параметров при наложении тестовой решетки в двух группах выбирали цитоплазматический компартмент (исключали ядро) и сравнивали объемную плотность миофибрилл, митохондрий, элементов саркоплазматической сети, суммарно лизосом и аутофагосом, а также свободного цитозоля (см. таблицу), которые затем проанализировали на предмет внутриклеточных объемно-объемных взаимоотношений.

При сравнении первичных стереологических показателей обращало на себя внимание статистически значимое превосходство объемной плотности митохондрий кардиомиоцитов в 1-й группе (p=0,0196, критерий Манна—Уитни) и меньшее — саркоплазматической сети (p=0,0106) при относительном равенстве показателей других органелл и цитозоля. При отсутствии различий между группами в объемной плотности миофибрилл выявлена статистическая значимость вторичного стереологического параметра — показателя «насыщенности» миофибрилл митохондриями, вычисляемого как отношение объемной плотности митохондрий к объемной плотности миофибрилл: она имела более высокие значения в образцах 1-й группы (p=0,0019), т.е. при меньшей продолжительности холодовой ишемии (рис. 5).

Рис. 5. Объемно-объемное отношение митохондрий и миофибрилл в кардиомиоцитах 1-й группы статистически значимо превышает показатель 2-й группы.

Критерий Манна—Уитни, p=0,0196

Таким образом, сравнительное исследование биоптатов ушка левого предсердия донорских сердец в условиях стандартного и продленного периодов холодовой ишемии выявило стереотипные дистрофические изменения кардиомиоцитов на гистологичесеком и ультрамикроскопическом уровнях. Полутонкие срезы демонстрировали мозаичность паренхимы миокарда, обусловленную контрактурными и менее выраженными литическими изменениями миофибрилл кардиомиоцитов, которые сопровождались отеком стромы в обеих группах без статистически значимых различий изученных показателей по данным стереологического исследования. Ультратонкие срезы перинуклеарных зон кардиомиоцитов свидетельствовали о редукции и очаговом повреждении миофибрилл и митохондрий в сочетании с выраженной аутофагией; при этом при меньшей длительности холодовой ишемии стереологические показатели органелл кардиомиоцитов свидетельствовали о сравнительно лучшем обеспечении миофибрилл митохондриями.

Обсуждение

Решение проблемы нехватки доступных донорских сердец неразрывно связано с улучшением исходов трансплантации и ослаблением иммунного отторжения, что можно обеспечить с помощью совершенствования фармакохолодовой защиты органа от острой длительной ишемии. Одновременно с этим дефицит донорских сердец может быть уменьшен за счет обоснованного безопасного продления периода консервации. Применяемый раствор Bretschneider способствует сохранению клеточных мембран в сердце с одновременным уменьшением оксидативного стресса. Кроме того, для снижения ишемии применяют значительное охлаждение органа, однако при транспортировке до реципиента донорское сердце претерпевает комплекс повреждающих и защитных воздействий, чаще обозначаемых как холодовая ишемия [1, 6].

Как при трансплантации, так и при большинстве других патологических процессов повреждение миокарда связано с несколькими патологическими факторами [14]. Так, стресс изолированного донорского сердца приводит к обратимым и необратимым ишемическим дистрофическим изменениям паренхимы органа, сопровождающимся застойными сосудистыми нарушениями и отеком стромы. Выявленные на парафиновых срезах изменения в биоптатах донорских сердец являлись неспецифическими и расценивались как обратимые [15, 16]. Аналогичные изменения отмечены при синдроме Такоцубо, где ведущую роль играет повреждающий эффект катехоламинов, высвобождающихся в условиях стресса и повреждающих сердечную мышцу как непосредственно, так и за счет нарушения микроциркуляторного русла. Морфологически данный синдром характеризуется очаговыми повреждениями кардиомиоцитов, выраженным отеком интерстиция с мукоидным компонентом, а также умеренно выраженной лимфомакрофагальной инфильтрацией стромы [17]. Следует отметить, что при рутинном патоморфологическом светооптическом исследовании эндомиокардиальных биоптатов человека среди выявляемых повреждений миокарда наиболее часто регистрируется вакуольная дистрофия кардиомиоцитов, имеющая небольшую диагностическую ценность, поскольку чаще всего содержимое вакуолей невозможно идентифицировать, поэтому авторы настоятельно рекомендуют проводить электронную микроскопию при каждой процедуре эндомиокардиальной биопсии [13].

Электронная микроскопия ультратонких срезов кардиомиоцитов и анализ полутонких срезов (в том числе в сочетании с поляризационной микроскопией продольных парафиновых срезов миокарда) позволяют визуализировать стереотипные и специфические нарушения сократительного аппарата как в клинике, так и в эксперименте, при моделировании патологических процессов различного генеза. При фармакохолодовой ишемии в биоптатах донорских сердец выявлены доминирующие контрактурные и единичные литические изменения миофибрилл, являющиеся универсальными ультраструктурными маркерами дистрофии кардиомиоцитов, которые были ранее описаны при изучении поражения сердца различного генеза, ишемического и токсического, например, при антрациклиновой кардиомиопатии [12, 18].

Поскольку сократительная способность миофибрилл характеризуется высокой энергозависимостью, при ишемически-реперфузионном повреждении кардиомиоцитов особенно сильно страдают их митохондрии, поэтому одним из способов улучшения качества трансплантата сердца предлагают методику трансплантации митохондрий в кардиомиоциты, эффективность которой продемонстрирована в эксперименте [6]. Разрушенные митохондрии и органеллы с агрегированными митохондриальными кристами описаны при кардиомиопатии токсического генеза при воздействии циклофосфамида [19].

Наряду с поражением и уменьшением количества митохондрий в изученных биоптатах сердца при продленной фармакохолодовой ишемии (2-я группа) развивались процессы митофагии, что документировалось перинуклеарными скоплениями крупных митофагосом, заметных даже на полутонких срезах. Как известно, основным осложнением трансплантации сердца является его острое клеточное отторжение. При анализе биоптатов сердца с поиском новых ультраструктурных маркеров отторжения выделен новый структурный феномен — значительное увеличение объемной плотности перинуклеарных митохондрий, трактуемое как «кластеризация митохондрий» [20], которые могут подвергаться митофагии с формированием крупных аутофагосом в условиях острой ишемии.

Заключение

Сравнительное исследование биоптатов ушка левого предсердия донорских сердец в условиях стандартного (до 240 мин) и продленного (более 240 мин) периода фармакохолодовой ишемии выявило стереотипные обратимые дистрофические изменения кардиомиоцитов на гистологическом и ультрамикроскопическом уровнях. Полутонкие срезы демонстрировали мозаичность паренхимы миокарда, обусловленную контрактурными и менее выраженными литическими изменениями миофибрилл кардиомиоцитов, которые сопровождались отеком стромы в обеих группах без статистически значимых различий по данным стереологического исследования. Ультратонкие срезы перинуклеарных зон кардиомиоцитов свидетельствовали о редукции и очаговом повреждении миофибрилл и митохондрий в сочетании с выраженной аутофагией; при этом при меньшей длительности ишемии стереологические показатели органелл кардиомиоцитов свидетельствовали о сравнительно лучшем обеспечении миофибрилл митохондриями.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить, о достаточной высокой степени сохранности тканевой и ультраструктурной организации донорских сердец с продленной (более 240 мин) фармакохолодовой ишемией для восстановления адекватной сердечной деятельности после трансплантации сердца.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Надеев А.П., Кливер Е.Э., Сирота Д.А.

Сбор и обработка материала — Кливер Е.Э., Волков А.М., Фомичев А.В., Жульков М.О., Сирота Д.А., Кливер Е.Э.

Статистическая обработка — Волчек А.В.

Написание текста — Айдагулова С.В., Кливер Е.Э.

Редактирование — Надеев А.П., Волков А.М., Казанская Г.М., Айдагулова С.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.