Введение

Одной из распространенных проблем, которая обусловливает снижение функции носового дыхания и сухость в носу, является перфорация перегородки носа (ППН) [1, 2]. Точная частота выявления ППН в общей популяции неизвестна, так как многие случаи могут быть бессимптомными или с минимальными проявлениями. Однако, согласно некоторым исследованиям, частота ППН у населения варьирует от 0,9% до 2,5% [3].

Выбор метода лечения зависит от размера и местоположения перфорации, а также от клинических проявлений и общего состояния здоровья пациента [4]. В настоящее время предложено большое количество хирургических методов для закрытия ППН, основная цель которых — механически заполнить дефект. Это позволяет восстановить анатомическую структуру и обеспечить нормальную аэродинамику полости носа [5].

Традиционно используют различные хирургические методы либо с костно-хрящевой поддержкой, либо без нее, включая аутотрансплантаты и аллотрансплантаты, свободные лоскуты и их комбинацию [6]. Однако на сегодняшний день сохраняются недостатки хирургического лечения, такие как трудности взятия материала, отторжение трансплантата, повышенный риск развития воспалительной реакции и образование фиброзной ткани, отсутствие комплаентности пациентов в послеоперационном периоде, боль в месте взятия лоскута, частые неудовлетворительные результаты [7].

Вероятность успеха хирургической коррекции ППН, по данным отечественной и зарубежной литературы, находится в широком диапазоне и составляет 30—95%.

Так, закрытие перфораций диаметром меньше 1 см наблюдалось в 84% случаев, для отверстий диаметром от 1 до 2 см этот показатель снижался до 64%, а для перфораций диаметром более 2 см составлял приблизительно 31% [8]. В настоящее время нет единой принятой техники закрытия ППН. Данные факторы являются предпосылкой для развития новых направлений в лечении указанной патологии.

На современном этапе продолжается разработка альтернативных методов закрытия ППН на основе регенеративной медицины и тканевой инженерии. Для этой цели применяются стволовые клетки как жировой ткани, так и другого происхождения, различные скаффолды или их комбинация [9]. Особый интерес представляют стволовые клетки жировой ткани, также известные как мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) , которые могут дифференцироваться в различные типы клеток и способствовать регенерации тканей, что доказано в условиях in vitro и in vivo в урологии, пластической и реконструктивной хирургии, травматологии и дерматологии [10—13].

Применение коллагеновой губки в качестве скаффолда и стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани in vivo для закрытия перфорации перегородки носа является перспективной методикой, улучшающей результаты коррекции дефекта перегородки носа за счет иммобилизации клеток и активного ангиогенеза при проведении имплантации.

Цель исследования — в условиях эксперимента изучить новый метод закрытия перфорации перегородки носа с применением коллагенового скаффолда совместно со стромально-васкулярной фракцией жировой ткани, содержащей мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки.

Материал и методы

Исследование одобрено локальным комитетом по этике ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (протокол №34-20 от 09.12.20).

Дизайн исследования

Эксперимент проведен на 24 самцах кролика массой 2500—4000 г (источник — центральный виварий Сеченовского университета). Условия содержания экспериментальных животных соответствовали требованиям ГОСТ P от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)».

На первом этапе всем животным под контролем эндоскопа хирургическим путем создавали сквозной дефект перегородки носа 3×4 мм² с одномоментной имплантацией конструкта. Равные экспериментальные группы по 6 животных формировались на основании типа вводимого в дефект перегородки носа продукта: животным 1-й группы (контрольной) имплатанцию конструкта не проводили; животным 2-й группы дефект заполняли только коллагеновым скаффолдом; у животных 3-й группы использовали коллагеновый скаффолд с ксеногенной СВФ жировой ткани; у животных 4-й группы использовали коллагеновый скаффолд в сочетании с аллогенной СВФ жировой ткани. Эндоскопический контроль проводили на 14-е сутки, через 1 мес и 3 мес в динамике. В случае отсутствия тенденции к восстановлению носовой перегородки повторяли введение конструкта. Через 6 мес всех животных выводили из эксперимента, после чего выполняли извлечение носовой перегородки. Полученные образцы подвергались морфологическому анализу с применением методов окрашивания гематоксилином и эозином, а также сафранином и метиловым зеленым (рис. 1).

Рис. 1. Дизайн эксперимента.

Подготовка клеточных продуктов для имплантации

Выделение ММСК жировой ткани человека. Мы получили первоначальную культуру ММСК человека методом механического извлечения СВФ из образцов материала, предоставленного биобанком Сеченовского университета. Эти образцы взяты у здоровых добровольцев, которые дали свое информированное добровольное согласие на исследование.

Выделение ММСК жировой ткани кролика. Проведена липосакция жировых отложений, сосредоточенных в области холки, что позволило легче осуществить хирургический доступ и получить достаточное количество материала липоаспирата. Далее липоаспират использован в качестве источника аллогенных ММСК.

Механическое получение СВФ жировой ткани аллогенного и ксеногенного происхождения. После получения липоаспират аллогенного и ксеногенного происхождения набирали в двухкомпонентный шприц 15 мл и устанавливали в центрифугу Rotofix 32 A (Andreas Hettich GmbH&Co. KG, Германия) 2500 оборотов на 4 мин. В шприце после центрифугирования содержимое разделено на 3 слоя. Нижний слой — водный, который удаляли через нижний этаж; верхний слой — масло, удаляли внутренним малым шприцом. Средний слой, представляющий собой сверхсухой жировой трансплантат, отделенный от масла и водной фракции, подвергался двойной дезагрегации через переходник диаметром 2,4 мм. Далее для получения СВФ жировой ткани проводилось повторное центрифугирование и удаление масла.

Хирургические методы

Создание модельного дефекта перегородки носа. Для обеспечения безболезненности манипуляций и миорелаксации использовалась аналгоседация путем внутримышечного введения тилетамина/золазепама из расчета 10—15 мг на 1 кг массы тела животного и раствора ксилазина 1—2 мг на 1 кг массы тела. После достижения необходимого уровня седации и снижения мышечного тонуса животное фиксировалось ассистентом в носоподбородочном подъеме. Интраназальный доступ достигался благодаря ригидному эндоскопу 0° диаметром 2,7 мм.

После достижения адекватного обзора полости носа лабораторного животного проводилось инструментальное создание сквозного дефекта перегородки носа. При необходимости осуществляли удаление кровяных сгустков и гемостаз путем прижатия ваты на зонде с навивкой, смоченной раствором адреналина. В послеоперационном периоде проводилась антибактериальная терапия: цефотаксим внутримышечно из расчета 75 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Имплантация клеточных продуктов. После формирования дефекта в хрящевой части перегородки носа проводилась имплантация материалов, соответствующих каждой группе, под контролем ригидного эндоскопа 0° диаметром 2,7 мм. В группах, в которых использовалась СВФ жировой ткани, подготовка проводилась непосредственно в операционной перед операцией.

Устанавливаемый в дефект перегородки носа конструкт состоял из двух компонентов: коллагеновый скаффолд, на который наносилась аллогенная/ксеногенная СВФ жировой ткани.

Ни в одном случае не отмечена гибель особи в результате развития каких-либо осложнений. В установленные контрольные сроки животные выводились из эксперимента путем избыточной внутримышечной инъекции тилетамина/золазепама: 24 кролика экспериментальных 1—4-й групп через 6 мес после имплантации.

Метод эндоназальной видеоэндоскопии с помощью ригидного эндоскопа 0° диаметром 2,7 мм использовался для динамических осмотров, оценки размеров дефектов и фиксации изображений.

Метод морфологического исследования. Образцы перегородки носа фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин «Гистомикс» (ООО «БиоВитрум», Россия). Микротомные срезы толщиной 4 мкм после депарафинизации окрашивали гематоксилином и эозином, а также сафранином О и метиловым зеленым. Препараты изучали и фотографировали с помощью универсального микроскопа Leica DM4000 B LED, оснащенного цифровой камерой Leica DFC7000 T, работающей под управлением программного обеспечения LAS v. 4.8 (LeicaMicrosystems CMS GmbH, Германия). Использовались режимы светлого поля и фазового контраста.

Результаты

Расчет размера дефекта перегородки носа производили по формуле площади круга, данные размера дефекта перегородки носа (медианы) у животных различных групп в сроки 14 дней, 1 мес, 3 мес и 6 мес представлены на рис. 2.

Рис. 2. Показатели площади перфорации перегородки носа (медиана) у лабораторных животных.

* — второе введение ксеногенной стромально-васкулярной фракции только животным 3-й группы; ** — третье введение ксеногенной стромально-васкулярной фракции только животным 3-й группы. Период наблюдения — срок эндоскопического осмотра животных всех групп.

При эндоскопическом осмотре у всех животных 1-й (контрольной) группы и 2-й группы (применение только коллагенового скаффолда) наблюдались омозолелые края ППН без тенденции к восстановлению носовой перегородки. У животных с применением СВФ жировой ткани с разной кратностью введения конструкта на 6-й месяц мы наблюдали полное закрытие ППН. У 4 особей 3-й группы (с использованием ксеногенной СВФ в сочетании с коллагеновым скаффолдом) результат достигнут после 3 введений, а животным 4-й группы потребовалось только однократное введение аллогенной СВФ в сочетании с коллагеновым скаффолдом (рис. 3).

Рис. 3. Эндофото через 1 мес и 3 мес наблюдения, макрофото препарата через 6 мес наблюдения за животными 1—4-й групп.

1-я группа — перфорация перегородки носа без имплантации конструкта; 2-я группа — перфорация перегородки носа с имплантацией коллагенового скаффолда; 3-я группа — перфорация перегородки носа с имплантацией коллагенового скаффолда + ксеногенной стромально-васкулярной фракции жировой ткани; 4-я группа — перфорация перегородки носа с имплантацией коллагенового скаффолда + аллогенной стромально-васкулярной фракции жировой ткани. Черным пунктирным овалом обозначена зона восстановленного дефекта у животных 3-й и 4-й групп с применением ксеногенного и аллогенного конструкта.

У животных 1-й и 2-й групп отмечен минимальный процесс регенерации многорядного цилиндрического мерцательного эпителия и хрящевой ткани, сопровождающийся усиленным формированием грубой фиброзной ткани и выраженными воспалительными явлениями по краям перфорации. В то же время у особей 3-й и 4-й групп продемонстрирована эффективная регенерация многорядного цилиндрического мерцательного эпителия, хряща, а также рост коллагеновых волокон и выраженный ангиогенез.

Обсуждение

На современном этапе предпочтение для закрытия ППН отдается традиционному хирургическому лечению. Однако ввиду затруднения осуществления хирургических методов как для пациента, так и для хирурга ведется активный поиск новых способов закрытия ППН [14]. По данным литературы, для закрытия ППН в экспериментальных условиях используют различные скаффолды: лактоферрин, мелатонин, карвакрил, целлюлозу, фибриновый клей, подслизистую оболочку тонкой кишки свиньи, полипропиленовую сетку, куркумин, децеллюляризованную слизистую оболочку трахеи свиньи, гелатин-метакрилат желатина. Данные материалы применяют отдельно или в сочетании с факторами роста и мезенхимальными стволовыми клетками, гиалуроновой кислотой и фибрином, богатой тромбоцитами плазмой, эластин-желатин-гиалуроновой кислотой совместно с ауто-/гомологичными хондроцитами, мезенхимальными стволовыми клетками пуповины и т.д. [15—21].

Перспективным, по нашему мнению, является использование СВФ жировой ткани, активно применяемой в различных областях медицины с положительным морфофункциональным результатом [22—24].

Данное экспериментальное исследование посвящено возможности использования ММСК из СВФ жировой ткани для закрытия сквозного дефекта перегородки носа кролика.

Наилучший результат в нашей работе получен у особей группы с использованием СВФ жировой ткани кролика в сочетании с коллагеновым скаффолдом. При использовании человеческой СВФ жировой ткани в сочетании с коллагеновым скаффолдом также отмечалось полное закрытие всех дефектов. Однако в некоторых случаях приходилось трижды вводить конструкт, что может быть связано с выраженной лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией у животных 4-й группы. В исследовании Y.-M. Kim и соавт. (2014) использовали ММСК жировой ткани человека без иммуносупрессии с целью заживления ран голосовых складок. При этом у кроликов не отмечались какие-либо нежелательные иммунологические реакции [25].

Заключение

Регенеративная медицина является сложной и неоднозначной отраслью современной развивающейся медицины. Регенерация дефекта перегородки носа входит в область активных исследований и разработок. Для получения эффективных и безопасных методов коррекции дефекта перегородки носа трудятся множество международных коллективов. На сегодняшний день некоторые вопросы остаются открытыми. К ним относятся механизмы регенерации перфорации перегородки носа; роль различных типов клеток, сигнальных путей и компонентов внеклеточного матрикса в процессе заживления; выбор источников клеток; поиск идеального опорного биосовместимого, биоразлагаемого и механически устойчивого материала; факторы регуляции для стимуляции регенерации тканей. Исследователи изучают различные комбинации компонентов для оптимизации регенеративного потенциала инженерных конструкций в восстановлении дефектов носовой перегородки. Важным аспектом разработки методов регенеративной медицины является этический компонент, который должен соответствовать регуляторным стандартам и учитывать такие вопросы, как использование источников клеток, полученных от людей, и потенциальные риски, связанные с трансплантацией.

Наше исследование показало, что использование стромально-васкулярной фракции, содержащей в себе мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, в комплексе с коллагеновым скаффолдом способствует полному закрытию перфорации перегородки носа у кролика. Это подтверждается и данными морфологического исследования: зона закрытого дефекта перегородки носа после имплантации конструкта содержит в том числе участки хрящевой ткани и приближается по строению к нативной перегородке носа. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности внедрения в клиническую практику данного метода закрытия перфорации перегородки носа.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.