Введение

Воспалительный процесс — это универсальная типовая реакция организма, развивающаяся в динамике и характеризующаяся определенными изменениями биохимических и иммунологических параметров, которые могут варьировать в зависимости от этиологического фактора, локализации в тканях и органах, а также состояния иммунной системы организма. В ходе ответа организма на какой-либо повреждающий фактор активируется ряд клеток, которые осуществляют выработку различных воспалительных факторов в виде простагландинов, хемокинов, цитокинов, что приводит к дальнейшей мобилизации клеток в очаг воспаления, их кооперации и включению механизмов элиминации патогена и восстановления нормальной ткани [1]. Тип воспалительного процесса влияет на вовлечение тех или иных компонентов иммунной системы в большей или меньшей степени, что характеризуется изменениями определенных иммунологических показателей, динамика которых позволяет определять течение воспаления и иметь возможность его фармакологического контроля на более качественном уровне. При этом прогностическая значимость разных лабораторных методов зависит от места локализации воспаленной ткани.

Ротоглотка представляет собой одно из первых мест контакта организма человека с различными микроорганизмами и другими посторонними веществами, присутствующими в пище и вдыхаемом воздухе. Небные миндалины человека являются вторичным лимфоидным органом и структурой первой линии защиты организма от патогенных агентов за счет функционально активного гетерогенного клеточного состава в виде эпителиоцитов, разных субпопуляций Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов, натуральных клеток-киллеров, стромальных клеток, включая фибробласты и васкулярные эндотелиальные клетки. Миндалины относятся к основным структурам местной защиты организма от чужеродных антигенов [2, 3]. В результате клетки, входящие в структуры миндалин носоглотки и ротоглотки, служат местом индукции гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа [4]. Поверхности слизистых оболочек постоянно омываются физиологическими жидкостями, поступающими из слюнных желез, секреторных клеток носовой полости, десневых щелей и секретов лимфоидных органов ротоглотки. Одновременно в глотке находится множество факторов, обладающих антимикробной активностью, включая иммуноглобулины, лизоцим, лактоферрин, антимикробные пептиды, во многом способных влиять на бактериальную колонизацию [5]. Основой патогенеза любого острого фарингита служит воспалительный процесс в месте входных ворот инфекции [6]. Доминирует продукция цитокинов Th1-типа [7]. Повышенная концентрация фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерлейкинов (IL)-1β и IL-6 в ткани является результатом локальной гиперпродукции вследствие активации моноцитов-макрофагов, вызванной многократной стимуляцией патогенными агентами [8]. Поскольку основной задачей воспаления является изоляция и устранение повреждающего фактора с последующей тканевой регенерацией, основная реакция развивается преимущественно локально, т.е. в очаге воспаления [1]. Поэтому считается, что наиболее информативным является изучение показателей местного иммунитета. Так, при остром назофарингите количество IL-6, IL-8 в сыворотке крови в первые 2 дня заболевания находится в пределах общепринятых нормативных значений, в то же время при изучении аналогичного спектра провоспалительных цитокинов в назальной слизи выявлен их повышенный уровень [9, 10].

Сложность проведения такого рода исследований заключается в отсутствии общепринятых референсных значений нормы, так как тесты чаще проводят в научных целях и в единичных крупных лабораториях научно-исследовательских институтов, используя оборудование и реактивы разных фирм-производителей. Поэтому каждая исследовательская группа должна высчитать собственный диапазон референсных значений в зависимости от применяемых тест-систем, реактивов и региона проживания пациентов и условно здоровых людей, входящих в группу контроля. Второй трудностью является отсутствие в оториноларингологии стандартизированной методики взятия биологического материала для этих тестов.

При воспалительных заболеваниях полости носа проводилось больше исследований, чем при заболеваниях ротоглотки. В назальных смывах определяли содержание IL-1β, IL-10, IL-8, TNF-α [11], секреторного иммуноглобулина A (sIgA) сорбционным методом [12]. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) выявляли содержание IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, интерферона (IFN)-α и sIgA в носовой слизи среднего [9, 10, 13] или общего носового хода [14] или в клеточном супернатанте из соскобов слизистой оболочки нижних носовых раковин [15]. Кроме того, содержание цитокинов в назальном секрете определяли мультиплексным анализом при аллергическом рините [16]. При полипозном риносинусите определяли мРНК цитокинов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [17] либо белки цитокинов при помощи ИФА или мультиплексного анализа [18, 19] непосредственно в тканях носовых полипов.

При заболеваниях ротоглотки некоторые коллеги определяли содержание ряда цитокинов в слюне утром на голодный желудок [20], предварительно ротовую полость пациента обрабатывали антисептиками, затем собирали слюну в сухую пробирку [21, 22]. Между тем слюна является больше ротовой жидкостью и состоит из секрета больших и малых слюнных желез, десневой жидкости, выделений пародонтальных карманов, слущенного эпителия, остатков пищевых продуктов и не отражает состояния патологического процесса непосредственно в лимфоидной ткани ротоглотки [23, 24]. При иммунологическом исследовании содержимого крипт небных миндалин использовали устройство, разработанное в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи» Минздрава России. Вводили 0,1 мл раствора натрия хлорида 0,9% в закрытую пробкой крипту, затем перемешивали ее содержимое трехкратным надавливанием на головку шприца и при последнем отпускании извлекали материал из крипты для исследований. Следует учитывать, что травматизация ткани небных миндалин при остром воспалении может усугубить патологический процесс. Кроме того, доказана разница в количественном составе микробиоты с поверхности и из лакун небных миндалин у пациентов с хроническим тонзиллитом и у здоровых людей [25], по аналогии такая же разница может быть и при исследовании показателей локального иммунного ответа. Российские коллеги при определении цитокинов методом твердофазного ИФА брали материал следующим способом: после полоскания физиологическим раствором ротоглотки с помощью специального шприца содержимое лакун изливалось в полость рта и выплевывалось больным в стерильный контейнер [26]. Ограничением этого метода служит примесь слюны. Исследование экспрессии цитокинов в ткани небных миндалин после тонзиллэктомии может быть проведено только однократно и только при тех патологических формах, которые послужили причиной проведения хирургического лечения, поэтому также не подходит при острой воспалительной патологии или прослеживании динамики патологического процесса [27]. Таким образом, остается актуальным определение методики забора биологического материала для исследования диагностически значимых параметров локального иммунитета в лимфоидной ткани и других анатомических структурах ротоглотки.

Цель исследования — валидизировать методики забора биологического материала для исследования параметров местного иммунитета слизистой оболочки при острых воспалительных заболеваниях ротоглотки.

Материал и методы

В период с августа по ноябрь 2019 г. на базе оториноларингологических отделений ФГБУ «Объединенная больница с поликлиникой» Управления делами Президента Российской Федерации и ФГБУ «Поликлиника №3» Управления делами Президента Российской Федерации обследованы 30 человек (13 мужчин, 17 женщин), средний возраст 38,43±3,14 года, с диагнозом острого фарингита, у которых период от появления первых симптомов до обращения к врачу составлял не более 24 ч. Для включения в исследование пациенты направлялись на осмотр к врачу-оториноларингологу врачами-терапевтами, предупрежденными о начале проведения исследования и наборе материала. Иммунологические исследования проводились в лаборатории инфекционной иммунологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Критерии включения: наличие на момент обращения жалоб и типичных признаков острого фарингита при объективном осмотре, а также повышение температуры тела выше 37,8°C, что необходимо для получения репрезентативной выборки. Наблюдалось острое начало заболевания с наличием симптомов интоксикации (головная боль, миалгия, артралгия, слабость). Катаральные явления проявлялись при фарингоскопии в виде признаков воспаления слизистой оболочки ротоглотки и жалоб на першение, сухость задней стенки глотки, боль при глотании, сухой кашель. Критерии невключения: любые признаки стрептококкового, грибкового тонзиллофарингита, наличие налетов на слизистой оболочке небных миндалин, респираторная аллергия, беременность, применение средств местной терапии заболеваний ротоглотки (таких как аэрозоли, растворы для полоскания, таблетки для рассасывания) в течение <24 ч до включения в исследование, лечение иммуномодулирующими препаратами и антибиотиками в сроки <3 мес до включения пациента в исследование, онкозаболевания и аутоиммунная патология. Группа контроля — 30 человек (12 мужчин, 18 женщин), средний возраст 36,07±3,59 года, состояла из здоровых добровольцев, не имеющих воспалительных явлений дыхательных путей в момент взятия материала и в течение 6 мес до этого момента, не отличающихся по полу и возрасту от пациентов основной группы и не соответствующих критериям невключения. Забор материала у каждого участника исследования проводили 7 способами:

1) собирали слюну пассивным потоком;

2) стерильный ватный тампон одинакового размера и массы помещали в полость рта, оставляли его на 3 мин, затем пропитанный слюной тампон пинцетом помещали обратно в пробирку;

3) стерильный ватный тампон, накрученный на металлический зонд, поочередно прикладывали к передней поверхности небных миндалин и боковых валиков задней стенки глотки с двух сторон;

4) стерильный бумажный диск из лабораторной фильтровальной бумаги диаметром 0,7 см поочередно помещали на описанные в 3-м способе поверхности;

5) специальным стандартным зондом-цитощеткой, представляющей собой урогенитальный одноразовый стерильный зонд типа D2 в виде щетки со спиральной установкой ворсинок, смонтированных на тонком пластиковом основании, производились соскобы со слизистой оболочки задней стенки глотки в области боковых валиков и небных миндалин;

6) этим же специальным зондом-цитощеткой производились соскобы со слизистой оболочки только задней стенки глотки, исключая область небных миндалин;

7) этим же специальным зондом-цитощеткой производились соскобы со слизистой оболочки только небных миндалин.

Клинический материал помещали в пробирки, содержащие транспортную среду в виде фосфатно-солевого буфера 1 мл при pH=7,4.

При способах №5—7 материал снимали с инструмента для забора образца интенсивным встряхиванием. В дальнейшем все пробирки центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин с использованием центрифуги лабораторной многофункциональной 5804R («Eppendorf AG», Германия). Время между взятием образца и центрифугированием составляло не более 10 мин. Супернатант и осадок собирали раздельно и замораживали при температуре –80°C, для этого использовано медицинское оборудование для хранения крови, компонентов лекарственных средств и вакцин MDF-U74V («Panasonic (Sanyo)», Япония). Выделение тотальной РНК из осадка клеток осуществляли с использованием наборов Extract RNA (ЗАО «Евроген», Россия). Количество выделенной РНК и синтезированной кДНК определяли флуориметрическим методом с использованием флуориметра Qubit 3.0 («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и коммерческих наборов («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). Синтез первой цепи кодирующей ДНК (кДНК) осуществляли с использованием наборов MMLV-RT (ЗАО «Евроген», Россия). Количественное определение мРНК IL-1β и мРНК референсного белка домашнего хозяйства фосфоглицераткиназы 1 (PGK1) осуществляли методом ПЦР-РВ с использованием оборудования «BioRad Laboratories, Inc.» (США) и наборов HS Taq ДНК-полимераза (ЗАО «Евроген», Россия). Список использованных в работе праймеров представлен в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров генов IL1B и PGK1

Результаты представляли в виде содержания транскриптов целевых генов относительно содержания транскриптов гена PGK1 и обозначали в условных единицах (conventional units, cu).

Метод анализа кривых амплификации — пороговый метод 2^(Ct PGK — Ct IL-1β), где Ct — цикл выхода кривой амплификации на заданный уровень интенсивности флуоресценции интеркалирующего красителя SYBR Green.

Статистическая обработка данных проводена с использованием программы IBM SPSS Statistics 23.0. Статистическую значимость различий в распределении частоты встречаемости изучаемых показателей в сравниваемых группах определяли с помощью критерия c² (для попарного сравнения использовали точный метод Фишера). Числовые данные представлены в виде медианы с 25-м и 75-м процентилями. Для сравнения распределений числовых показателей в двух сравниваемых группах использовали дисперсионный анализ и непараметрический критерий Манна—Уитни.

Результаты

При исследовании уровня экспрессии гена IL1B при всех способах наблюдались статистически значимые различия с контрольной группой и между собой (табл. 2). Самые минимальные его значения наблюдались при способе №1, в котором клиническим материалом была слюна, собранная пассивным потоком. Медиана составила 0,095 [0; 3,45] усл. ед. При заборе слюны на ватный тампон способом №2 уровень мРНК IL-1β определялся в более высоких значениях по сравнению со способом №1, но статистически значимо меньше, чем в пробирках способов №3—7 (0,21 [0,1; 3,82] усл. ед.). Количество мРНК в материале, полученном при способах №3 и №4 на ватном тампоне и бумажном диске, статистически значимо не различалось, было выше, чем при способах №1 и №2 и ниже по сравнению со способами №5—7. Их значения определялись как 0,75 [0,11; 4,22] и 0,73 [0,09; 4,1] усл. ед. соответственно. Не выявлены статистически значимые различия между значениями IL-1β в пробирках при соскобах отдельно только с поверхности небных миндалин и только с поверхности задней стенки глотки (способы №6 и №7), которые были статистически значимо выше значений при способах №1—4 и ниже по сравнению со способом №5: 1,74 [0,45; 5,27] и 1,71 [0,53; 5,16] усл. ед. соответственно. Максимальные значения получены при способе №5 — взятии соскобов со слизистой оболочки боковых валиков задней стенки глотки и небных миндалин одновременно: 4,76 [0,92; 8,13] усл. ед.

Таблица 2. Уровень экспрессии гена цитокина IL-1β при остром фарингите с интоксикационным синдромом

Обсуждение

В норме через слизистую оболочку оториноларингологических структур в организм постоянно поступают чужеродные молекулы. Иммунный ответ должен подавить инфекцию и нанести минимальное повреждение организму, а скорость его развития должна превышать скорость размножения микробных агентов [1, 28]. Цитокины — естественные компоненты, обеспечивающие нормальную работу иммунной системы и ее взаимодействие с другими органами и системами организма. При остром воспалительном процессе ротоглотки в области патологического очага создается их высокая концентрация и формируется отек слизистой оболочки, сопровождающийся привлечением новых клеток. Активизируется каспазный каскад, посредством которого неактивные проформы некоторых цитокинов, включая IL-1β и IL-18, путем их протеолитического расщепления становятся биологически активными. Продукция провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-18, γ-интерферона относится к феномену ранней цитокиновой реакции — это неспецифический ответ организма на инфицирование в результате взаимодействия повреждающих агентов с макрофагами [9, 29].

Измерение уровня цитокинов, продуцируемых клетками слизистой оболочки ротоглотки, позволяет определить выраженность и направленность воспалительного процесса, а исследование их уровня в динамике на фоне применения разных способов лечения даст возможность выяснить механизм действия того или иного препарата [10]. Проблема забора материала в ротоглотке кроме отсутствия единого мнения относительно технологии усугубляется наличием у некоторых пациентов рвотного рефлекса вследствие раздражения нервных окончаний X и IX пары черепно-мозговых нервов (блуждающего и языкоглоточного), расположенных на поверхности мягкого нёба, глотки и глоточной части корня языка. Часто эти пациенты имеют нестабильный эмоциональный фон, повышенную тревожность, ипохондрические расстройства [30]. Орошение слизистой оболочки ротоглотки местным антисептиком нежелательно, так как может ухудшить количественные и качественные характеристики результатов исследования.

Ранее подобные работы по валидизации методов забора материала для иммунологических тестов при заболеваниях ротоглотки не проводились. IL-1β в качестве исследуемого цитокина выбран вследствие его активного участия в начальной стадии любого острого воспалительного процесса, в том числе острого назофарингита [9]. Мы включили в исследование пациентов с интоксикационным синдромом, поскольку активация острофазового ответа на уровне организма происходит при гиперпродукции этого цитокина [29]. Наличие следовых концентраций экспрессии гена IL1B у лиц группы контроля подтверждает наличие минимального физиологического воспалительного процесса в ротоглотке в нормальных условиях в связи с постоянным воздействием патогенов окружающей среды. Согласно полученным результатам, методика взятия материала путем соскоба зондом-цитощеткой со слизистой оболочки одновременно с поверхности небных миндалин и с задней стенки глотки позволяет получить наиболее качественный материал для проведения лабораторных иммунологических тестов.

Выводы

Полученные результаты свидетельствуют о том, что методика взятия соскобов со слизистой оболочки, возможно, является наиболее эффективной для оценки содержания цитокинов в слизистой оболочке ротоглотки. Максимальный результат получен при одновременном взятии материала со слизистой оболочки задней стенки глотки и боковых валиков задней стенки глотки.

В то же время следует отметить, что разобщенное взятие соскобов со слизистой оболочки небных миндалин или боковых валиков задней стенки глотки позволит при необходимости оценить воспалительный ответ автономно в лимфоидной ткани и отдельно на слизистой оболочке задней стенки глотки.

Благодарности. Авторский коллектив выражает благодарность ООО «Бионорика» за финансовую поддержку в проведении работы в части выполнения лабораторных исследований методом иммуноферментного анализа.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.