Карпова Е.П.

Кафедра детской оториноларингологии Российской медицинской академии последипломного образования

Гуров А.В.

Кафедра оториноларингологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва

Бурлакова К.Ю.

Кафедра детской оториноларингологии Российской медицинской академии непрерывного профессионального образования, Москва, Россия, 125993; Детская городская клиническая больница им. З.А. Башляевой, Москва, Россия, 125373

Влияние состава микробиоты носоглотки на эффективность терапии при хроническом аденоидите и экссудативном среднем отите у детей

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2019;84(6): 100-107

Просмотров : 40

Загрузок : 3

Как цитировать

Карпова Е. П., Гуров А. В., Бурлакова К. Ю. Влияние состава микробиоты носоглотки на эффективность терапии при хроническом аденоидите и экссудативном среднем отите у детей. Вестник оториноларингологии. 2019;84(6):100-107. https://doi.org/10.17116/otorino201984061100

Авторы:

Карпова Е.П.

Кафедра детской оториноларингологии Российской медицинской академии последипломного образования

Все авторы (3)

Необходимо отметить, что в последние годы экссудативный средний отит (ЭСО) в детском возрасте имеет тенденцию к росту частоты встречаемости, а невысокая эффективность используемых в настоящее время традиционных методов консервативной терапии и высокая частота рецидивов заболевания диктуют необходимость разработки новых способов лечения.

При лечении детей с хроническим аденоидитом (ХА) и ЭСО выделяют консервативное и хирургическое лечение, к которому относятся тимпанопункция, миринготомия с установкой силиконового шунта в барабанную перепонку, а также аденотомия. В консервативном лечении часто применяют топические антибактериальные и антисептические препараты, что в последующем приводит к нарушению микробиоты слизистой оболочки носоглотки. Что касается хирургического лечения, согласно данным литературы, после шунтирования барабанной полости отмечается атрофическое рубцевание барабанной перепонки у 51% пациентов, миринго- и тимпаносклероз барабанной перепонки, стойкая перфорация, образование грануляционных тканей, развитие хронического отита и нейросенсорной тугоухости [1]. Учитывая высокую вероятность развития осложнений после хирургического вмешательства, одной из задач консервативной терапии является повышение ее эффективности.

ЭСО рассматривается как невоспалительное заболевание среднего уха, для которого характерно скопление экссудата за барабанной перепонкой при отсутствии перфорации в течение 3 мес или дольше [2]. Это приводит к снижению слуха, при этом увеличивается риск задержки формирования правильной речи у ребенка и поведенческих проблем [2—4].

Ранее общепризнанным являлся тот факт, что основным предрасполагающим фактором в развитии ЭСО в детском возрасте является ринофарингеальная обструкция.

Особое значение в развитии ЭСО уделяется гипертрофии лимфоидной ткани носоглотки, которая в детском возрасте рассматривается как ответ на респираторную антигенную вирусно-бактериальную нагрузку.

Вопрос о распространении воспалительного процесса на слуховую трубу при длительном сохранении в структуре лимфоидной ткани патогенных микроорганизмов, что характерно для персистирующих вирусных инфекций и дальнейшего развития ЭСО, в настоящее время остается дискутабельным [1—3, 5—7].

Тем не менее в последнее время появляются исследования, доказывающие значимость таких факторов, как аллергопатология, нарушения со стороны ЖКТ, наследственная предрасположенность, роль изменения микробиоты слизистой оболочки [7].

Все живые микроорганизмы, заселяющие определенную анатомическую нишу (вирусы, бактерии, грибы и др.), обозначаются в настоящее время термином «микробиота». Этот термин включает в себя как комменсалов, так и патогенные микроорганизмы. При более подробном изучении структуры микробиоты описывают ее бактериальную составляющую (количественную и таксономическую характеристику бактерий, колонизирующих исследуемый биотоп). Под термином «микробиом» подразумевается совокупность генов всех микроорганизмов, населяющих исследуемую область. Таким образом, микробиом можно рассматривать как коллективный геном микробиоты [8, 9]. Изменения в качественном и количественном составе микробиоты принято обозначать термином «дисбиоз». Дисбиотические изменения имеют важное значение в развитии воспалительной патологии, при этом некоторые широко используемые лекарственные средства (в том числе антибактериальные и антисептические) пагубно влияют на индигенные бактерии, которые сохраняют физиологические функции определенного органа. Индигенная микробиота обеспечивает свое количественное превосходство в наблюдаемом биотопе, обусловливает колонизационную резистентность слизистых оболочек и формирует устойчивость к чрезмерному росту патогенных микроорганизмов, за счет прямого угнетения их роста или других механизмов межмикробной конкуренции [9, 10]. Ключевыми отопатогенами являются нетипируемые штаммы Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis и, в меньшей степени, Staphylococcus aureus [4—7, 11]. Насколько микробиота слизистой оболочки носоглотки может влиять на развитие ЭСО, до конца не изучено. Однако известно, что индигенные микроорганизмы слизистой оболочки носоглотки защищают ее от агрессии отопатогенов. Необходимо отметить, что в современной литературе практически отсутствуют публикации, содержащие информацию о видовой структуре, межвидовых ассоциациях и характере колонизации слизистой оболочки носоглотки детей в норме и в условиях ЭСО. При этом в некоторых исследованиях было обнаружено, что низкое видовое разнообразие связано с развитием острого среднего отита, а в других исследованиях не было обнаружено никакой связи [12—14]. Достижения в области метагеномных высокомолекулярных методов диагностики в настоящее время предоставляют возможность анализировать целые смешанные бактериальные сообщества («микробиом»), заселяющие полость среднего уха и носоглотку у пациентов с ЭСО и ХА, что не удается выполнить другими существующими методами диагностики.

В связи с невысокой эффективностью лечения и развитием осложнений ХА и ЭСО разрабатываются новые терапевтические подходы, направленные на своевременное консервативное лечение, а также предупреждение необходимости хирургического лечения. В частности, одним из перспективных направлений является включение в схему лечения лизоцима, представляющего собой фермент мурамидазу [12].

Мурамидаза гидролизует β-1,4 гликозидные связи между основными компонентами клеточной стенки бактерий — N-ацетилмураминовой кислотой и N-ацетилглюкозамином гликополисахарида — и вызывает, таким образом, лизис ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Второй механизм противомикробного действия лизоцима — катионный. Молекулы лизоцима встраиваются в клеточную мембрану бактерий, образуя в ней поры. Благодаря этому механизму лизоцим вызывает осмотическую гибель бактериальной клетки [15].

Последние исследования свидетельствуют об антибактериальном и противовирусном действии лизоцима [16]. Кроме того, антимикробное действие лизоцима обусловлено также его способностью разрушать биопленки патогенных бактерий и грибов [17]. Включение лизоцим-содержащего препарата в комплексное лечение у детей обосновано тем, что концентрация и активность лизоцима в слюне несколько ниже, чем у взрослых [18].

Цель исследования — установление связи состава микробиоты слизистой оболочки носоглотки с клиническими проявлениями ХА и ЭСО. Проведение сравнительного анализа состава микробиоты на фоне традиционных методов терапии и терапии с включением в схему комплексного лечения биоценозосберегающего препарата, содержащего лизоцим, у детей c ХА и ЭСО.

Материал и методы

В исследование были включены 174 ребенка с хроническим аденоидитом и экссудативным средним отитом в возрасте от 3 до 14 лет (средний возраст 6,9±0,5 года). Нами разработан этапный диагностический алгоритм, включавший сбор анамнеза жизни, заболеваний и жалоб ребенка (или его родителей), а также оториноларингологический осмотр, эндоскопию носоглотки, отоэндоскопию, аудиологическое обследование, микробиологическое исследование методом ПЦР real-time. Детям, которым проводили консервативное лечение (82 человека), проводили полногеномное секвенирование (NGS) до лечения и через 1 мес в связи с тем, что это единственный метод высокомолекулярной диагностики, позволяющий изучить микробиом и максимально точно проанализировать все изменения микробиоты, происходящие в наблюдаемом биотопе. После проведения предложенного диагностического алгоритма мы разработали этапную лечебную тактику. По совокупности баллов, полученных при заполнении разработанной рабочей шкалы, определяли тяжесть заболевания. Пациентам с установленным диагнозом ХА, ЭСО легкой степени тяжести (81 ребенок) назначали консервативное лечение, им же было выполнено NGS мазков слизистой оболочки носоглотки; пациентам с установленным диагнозом ХА, ЭСО со средней и тяжелой степенью тяжести (93 ребенка) назначали хирургическое лечение.

Дети с ХА и ЭСО с легкой степенью тяжести на основании разработанной нами диагностической шкалы (81 из 174 человек), разделены методом адаптивной рандомизации на две группы:

— 1-я группа (основная) — 41 пациент, получавший традиционное консервативное лечение в соответствии с клиническими рекомендациями (клинические рекомендации «Отит средний у детей» МЗ Р.Ф. Национальная медицинская ассоциация оториноларингологов, 2016) с включением в схему лечения препарата Лизобакт (Босналек АО, Босния и Герцеговина) в возрастной дозировке (детям 3—7 лет по 1 таблетке 3 раза в сутки; детям 7—12 лет по 1 таблетке 4 раза в сутки; детям старше 12 лет по 2 таблетки 3 раза в сутки) курсом 9 дней;

— 2-я группа (контрольная) — 40 пациентов, которые получали традиционное консервативное лечение в соответствии с клиническими рекомендациями (ирригационно-элиминационная терапия, топическая антибактериальная терапия, продувание слуховых труб по Политцеру, пневмомассаж барабанных перепонок).

Проводили оценку клинической эффективности объективных данных по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) по 5-балльной системе, где 0 баллов — отсутствие симптома, 1 балл — слабо выраженный симптом или непостоянный, 2 балла — умеренно выраженный симптом, 3 балла — выраженный симптом, 4 балла — сильно выраженный симптом или постоянный, и микробиологических данных; на 10-е сутки, через 1 мес, через 3 мес.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью компьютерной программы Statistica 10.0, с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни для независимых выборок. Разницу считали статистически значимой при p<0,05.

В настоящее время в молекулярной биологии с целью исследования структуры микробиомов принято проведение метагеномных исследований, которые выполняют с помощью анализа гена прокариот 16S рРНК. Длина этого гена — 1500 пар нуклеотидов, он состоит из 9 вариабельных районов, чередующихся с консервативными областями. В настоящем исследовании были использованы праймеры, амплифицирующие вариабельный участок V3/V4, сиквенс которого позволяет определить наибольшее число таксонов в микробных сообществах.

1-й этап. Выделение ДНК из образцов мазков носоглотки и экссудатов из среднего уха производили с помощью DNeasy-Blood&Tissue Kit (Qiagen) согласно протоколу из описания к набору.

2-й этап. ПЦР. ПЦР для наработки фрагментов генов 16S рРНК ставилась со следующей структурой праймеров (рис. 1).

Рис. 1. Структура праймеров.

3-й этап. Секвенирование и анализ данных. Из полученных ПЦР-продуктов формировали эквимолярные пулы, которые секвенировали на приборах Illumina MiSeq и HiSeq 1500.

Идентификация микроорганизма проводилась до вида, а при невозможности такого определения (вследствие недостаточной глубины покрытия или отсутствия соответствующего вида в базе данных) — до рода.

Расчет параметра наглядности осуществлялся путем вычисления изменения показателей после лечения по отношению к данным параметрам до начала терапии в процентах [19].

Результаты исследования

При первичном осмотре по данным ВАШ пациенты 1-й и 2-й группы исследования не имели статистически достоверного различия между основными симптомами заболевания (p>0,05). На 9—10-й день от начала лечения, по данным ВАШ, выраженность нарушения функции носового дыхания была наименьшей у пациентов 1-й группы исследования и составила 1,24±0,4 балла, а во 2-й — 1,61±0,4 балла. Выраженность ринореи у пациентов 1-й группы — 0,9±0,3 балла, что имело достоверное различие (p<0,05) по сравнению с пациентами 2-й группы, где данный показатель составил 1,51±0,5 балла. Выраженность снижения слуха на 10-й день от начала лечения у пациентов 2-й группы составила 2,75±0,5 балла, во 1-й группе — 1,65±0,5 балла (p<0,05). При анализе показателей ВАШ через 4 нед от начала лечения выраженность затруднения функции носового дыхания составила у пациентов 1-й и 2-й групп 0,97±0,4 и 1,48±0,5 (p>0,05) балла соответственно. Выраженность выделений из носа была наименьшей у пациентов 1-й группы — 0,6±0,1 балла, у пациентов 2-й группы — 0,95±0,5 балла (p<0,05). Выраженность снижения слуха у пациентов групп исследования: в 2-й группе — 1,8±0,6 балла; во 1-й — 1,36±0,4 балла (p<0,05). При анализе показателей ВАШ через 12 нед от первичного визита выраженность затруднения носового дыхания составила у пациентов 1-й и 2-й групп 0,73±0,8 и 1,05±0,5 (p>0,05) балла соответственно; выраженность выделений из носа составила 0,29±0,4 и 0,62±0,4 (p<0,05) балла соответственно; выраженность снижения слуха у пациентов 1-й и 2-й групп исследования составила 0,61±0,41 и 1,15±0,5 балла (p<0,05) соответственно.

Согласно данным тимпанометрии, у всех пациентов, завершивших исследование, при первичном осмотре был диагностирован одно- или двусторонний ЭСО. При осмотре на 10-й день от начала лечения полная двусторонняя нормализация функции слуховой трубы и состояния полости среднего уха (тимпанограмма тип А) отмечена у 6 (12,2%) пациентов 2-й группы, 23 (43,4%) пациентов 1-й группы (p<0,05). При контрольном осмотре через 12 нед наилучшие показатели полного разрешения тубарной дисфункции также отмечали у детей 1-й группы исследования, где двусторонний тип, А на тимпанометрии был получен в 17 (42,5%) случаях, а у пациентов 2-й группы — в 10 (25%) случаях (p<0,05).

Таким образом, после проведенного лечения показания к хирургическому лечению отмечены в 1-й группе у 23 (57,5%) пациентов, в то время как во 2-й группе — у 31 (75%), что подтверждает более высокую клиническую эффективность консервативной терапии в 1-й группе пациентов с назначением лизоцимсодержащего препарата и снижение необходимости хирургического лечения. При опросе родителей пациентов на завершающем визите удовлетворение состоянием ребенка выразили в 31 (77,5%) случае в 1-й группе, в 19 (46,3%) случаях во 2-й группе (p<0,05).

Не выявлено ни одного случая нежелательных побочных эффектов, связанных с применением препарата Лизобакт.

Результаты микробиологического исследования методом ПЦР real-time при первичном визите

При микробиологическом исследовании методом ПЦР real-time отделяемого со слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО наиболее часто выявляли вирусно-бактериальные ассоциации (52 пациента — 29,9%), вирусные (34 пациента — 19,5%) и бактериальные ассоциации (16 детей — 14,4%), при этом у 63 (36,2%) пациентов этиологически значимых микроорганизмов не было обнаружено (рис. 2).

Рис. 2. Результаты микробиологического исследования отделяемого с поверхности слизистой оболочки глоточной миндалины у детей с хроническим аденоидитом и экссудативным средним отитом (n=174).

Лидирующую позицию по частоте встречаемости среди вирусных возбудителей занял риновирус (32 случая, 18,4%), вирус парагриппа (23 случая, 13,2%), аденовирус (20 случаев, 11,5%). В 7 (0,04%) случаях был идентифицирован РС-вирус, бокавирус — в 6 (0,03%) случаях, еще реже вирус гриппа типа В — в 2 (0,01%) случаях. Вирус парагриппа одинаково часто встречался у детей во всех возрастных группах. РС-вирус наиболее часто встречался у детей раннего возраста (26 случаев, 11%). Бокавирус был выявлен в единичном случае в группе детей в возрасте от 2 до 3 лет.

При этом среди возбудителей затянувушегося ЭСО и ХА наиболее часто встречались вирусно-бактериальные ассоциации — в 6 (46,1%) из 13 случаях. В структуре микробных ассоциаций, среди бактериальных микроорганизмов наиболее часто идентифицировали Streptococcus pneumoniae, среди вирусов — РС-вирус (табл. 1).

Таблица 1. Структура видов и частота выявления возбудителей у детей с хроническим аденоидитом и экссудативным средним отитом (n=174)
Анализируя результаты исследования, необходимо отметить, что S. pneumoniae и нетипируемые штаммы H. influenzae являются двумя основными бактериальными патогенами, которые были идентифицированы у детей с ХА и ЭСО [5, 11].

Результаты полногеномного секвенирования NGS

Установлены средние значения частот основных доминирующих микроорганизмов слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО до и после лечения у исследуемых пациентов. Нами выявлено: основными доминирующими условно-патогенными видами были в 1-й и 2-й группах соответственно: Moraxella (83,32%/76,59%), Veillonella (42,31%/30,04%), Prevotella (28,42%/43,64%), Staphylococcus (68,47%/73,84%), Haemophilus (68,36%/73,42%), Streptococcus (69,87%/67,27%), Neisseria (13,18%/11,24%), Pseudomonas (12,85%/14,21%), Alloicoccus (3,19%/5,12%), Fusobacterium (6,89%/0). Основными доминирующими индигенными видами были в 1-й и 2-й группах соответственно: Flavobacterium (3,25%/0), Corynebacterium (6,83/4,64), Bifidobacteria (1,76%/2,05%), Streptococcus salivarius (4,34%/6,64%), Bacillus (1,47%/2,36%).

Показано, что до начала лечения значения частот основных доминирующих микроорганизмов в наблюдаемом биотопе у пациентов обеих групп были сопоставимы, статистически значимых отличий не выявлено (p>0,05) (табл. 2, 3).

Таблица 3. Средние значения частот основных доминирующих индигенных микроорганизмов в биотопе до и после лечения, %
Таблица 2. Средние значения частот основных доминирующих условно-патогенных микроорганизмов в биотопе до и после лечения, %

По окончании терапии оценка параметров наглядности изменений показала:

— в 1-й группе (основная) после проведенной терапии применительно к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам отмечалось уменьшение колонизации слизистой оболочки родами Moraxella — на 83,3%; Veillonella — на 42,31%; Prevotella — на 28,42%; Staphylococcus — на 50,19%; Haemophilus — на 68,36%; Neisseria — на 13,06%; Pseudomonas — на 12,74%; Alloicoccus — на 3,19%; Fusobacterium — на 6,29%; а также уменьшение вида Streptococcus pneumoniaе на 68,81% (см. табл. 2).

При этом применительно к индигенным микроорганизмам отмечалось увеличение колонизации родов Flavobacterium на 20,08%; Corynebacterium — увеличение вида на 40,08%; Lactococcus — на 26,34%; Bifidobacterium — на 23,42%; Lactobacillus — на 12,95%; Dolosigranulum — на 3,09%; а также вида Streptococcus salvarius — на 62,3% (см. табл. 3).

— во 2-й группе (контрольная) после проведенной терапии: применительно к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам отмечалось уменьшение вида Moraxella — на 40%; Veillonella — на 10%; Prevotella — на 19,96%; Staphylococcus — на 41,02%; Haemophilus — на 17,59%; Neisseria — на 8,06%; Pseudomonas — на 12,8%; Alloicoccus — на 0,5%; Fusobacterium — на 0,6%, уменьшение вида Streptococcus pneumoniae — на 55,42% (см. табл. 2).

При этом применительно к индигенным микроорганизмам отмечалось увеличение представителей рода Corynebacterium на 12,06%; Bifidobacterium — на 1,02%; Lactobacillus — уменьшение на 2,36%; а также вида Streptococcus salvarius — на 4% [19] (см. табл. 3).

Обсуждение

Благодаря использованию именно этого метода высокомолекулярной диагностики нам удалось оценить изменения микробиома и сделать вывод, что микробиота слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО имеет более низкое родовое и видовое разнообразие, более высокую относительную распространенность транзиторных (условно-патогенных) микроорганизмов и более низкую относительную распространенность микроорганизмов-комменсалов, вследствие чего нельзя исключать влияния данных изменений на формирование ЭСО. Применение полногеномного секвенирования NGS позволяет максимально точно отследить все изменения, происходящие в наблюдаемом биотопе и установить связь микробиоты с развитием ХА и ЭСО у детей: низкое бактериальное разнообразие и высокое содержание Haemophilus, Moraxella, Staphylococcus, Pseudomonas и Neisseria в носоглотке являются маркером хронического воспаления, в то время как более высокие уровни содержания Corynebacterium, Lactococcus, Bacillus, Lactobacillus наблюдали во время выздоровления.

Вероятно, условно-патогенные микроорганизмы (S. pneumoniae, H. influenzaе и др.), которые в определенных условиях (увеличения их количественного состава, действие факторов окружающей среды, состояние макроорганизма и др.) могут выступать в роли эндогенных патобионтов и вызывать различные формы инфекционных процессов на слизистой оболочке. При этом прямое или опосредованное цитопатическое действие респираторных вирусов является фактором, который обусловливает дальнейшее стойкое бактериальное суперинфицирование штаммами микроорганизмов, обладающих определенной вирулентностью и относящихся к отопатогенам [12—14]. Данные микроорганизмы принимают непосредственное участие в разрушении эпителиального барьера респираторного тракта [8, 20], снижают мукоцилиарный клиренс [21]. Появление вязкого полисахаридного слизистого секрета является, в свою очередь, предрасполагающим фактором для формирования структуры патологической биопленки [13, 14, 22—24].

Возникающие дисбиотические изменения, выражающиеся в изменении количественно-качественного состава нормальной микробиоты носоглотки в сторону увеличения количества транзиторных микроорганизмов, могут увеличивать риск их дальнейшего попадания через слуховую трубу в полость среднего уха и последующего развития ЭСО. Тем не менее настоящее исследование не позволяет пока с уверенностью утверждать о распространении воспалительного процесса на слуховую трубу при ХА с развитием в дальнейшем экссудативного отита. Для этого требуются дополнительные исследования экссудата полости среднего уха с использованием метода полногеномного секвенирования.

После проведенного консервативного лечения клиническая результативность была отмечена в обеих группах, однако более выраженная клиническая эффективность и восстановление нормальной микробиоты слизистой оболочки носоглотки отмечены только в группе пациентов, которые получали препарат, содержащий лизоцим. Таким образом, дисбиоз слизистой оболочки носоглотки с увеличением количества условно-патогенных микроорганизмов у детей с ХА и ЭСО способствует более длительному сохранению воспаления с последующей хронизацией процесса.

Таким образом, восстановление микробиоты верхних дыхательных путей способствует сокращению клинических проявлений и наступлению выздоровления, снижает риски осложнений ЭСО, а также помогает сократить количество пациентов, которым требуется хирургическое лечение. Доказано, что применение препарата Лизобакт способствует уменьшению условно-патогенных и патогенных микроорганизмов при выраженном росте и увеличении разнообразия представителей индигенной микрофлоры в наблюдаемом биотопе. Применение препарата, содержащего лизоцим, является одним из перспективных направлений лечения ХА и ЭСО. Проведенное комплексное консервативное лечение с включением в схему препарата Лизобакт позволяет повысить клиническую эффективность лечения детей с ХА и ЭСО, сократить необходимость хирургического вмешательства и снизить количество осложнений ЭСО.

Вывод

Применение метода полногеномного секвенирования позволило выявить связь состава микробиоты с течением ХА и ЭСО у детей. Низкое родовое и видовое разнообразие является маркером хронического воспаления. Сдвиг состава микробиоты в сторону увеличения условных отопатогенов способствует длительному сохранению воспаления в носоглотке и экссудата в полости среднего уха.

Включение в терапию лизоцим-содержащего препарата Лизобакт («Босналек АО», Босния и Герцеговина) способствует колонизации носоглотки индигенными штаммами на фоне улучшения клинической картины и данных объективных методов исследований по сравнению с традиционным консервативным лечением, а также позволяет сократить необходимость хирургического лечения у детей с ХА и ЭСО.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail