Фемтолазерная лентикулярная коррекция миопии и миопического астигматизма постепенно становится ведущей технологией в кераторефракционной хирургии. Извлекаемая в результате операции роговичная лентикула (РЛ) (фрагмент стромального слоя) чаще всего утилизируется. Однако ее изучение может стать ключом к пониманию биомеханических свойств роговицы in vivo. Кроме того, лентикулы являются потенциальным донорским материалом для лечения кератоконуса, коррекции гиперметропии, гиперметропического астигматизма, пресбиопии. В многочисленных работах описываются лентикулы, сформированные и извлеченные в результате применения технологии SMILE (Small Incision Lenticula Extraction) [1‒7]. Ряд публикаций как отечественных, так и зарубежных авторов содержат описание методов и результатов исследования таких свойств РЛ, как форма, диаметр, толщина, прозрачность, рефракционная сила, упругость (после предварительной дегидратации и криоконсервации для создания глазного банка). Другие работы посвящены изучению характеристик и качества поверхности стромы роговицы и лентикулы после ее экстракции ex vivo (на свиных глазах) с проведением электронной сканирующей микроскопии и гистологического исследования [8‒12].

Цель исследования — изучить локальные механические свойства РЛ (с определением модуля Юнга) (мЮ) посредством сканирующей ион-проводящей микроскопии (СИПМ) у пациентов с миопией и миопическим астигматизмом, перенесших фемтолазерную лентикулярную коррекцию по технологии CLEAR.

Материал и методы

В клинике микрохирургии глаза ОКДЦ ПАО «Газпром» в период с августа по ноябрь 2024 г. 19 пациентам (11 (58%) мужчин и 8 (42%) женщин; 38 глаз), с миопией и миопическим астигматизмом, выполнена операция CLEAR на платформе фемтосекундного лазера LDV Z8 (Ziemer, Германия; программное обеспечение SW5835) с извлечением лентикул. Возраст пациентов варьировал от 21 года до 48 лет (31,0±8,99 года).

Исследование проведено в соответствии с этическими принципами, установленными Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации, а также с нормами регионального и международного права. Все участники предоставили соответствующее письменное информированное добровольное согласие.

Изучение биомеханических свойств лентикул осуществлено на базе научно-исследовательской лаборатории биофизики ФГАОУ ВО «НИТУ МИСИС» (Москва).

В исследование включено 34 лентикулы. Дооперационные характеристики были следующими: сферический компонент от –1,75 до –8,25 (–4,53±1,87) дптр, цилиндрический компонент от –0,0 до –1,75 (–0,72±0,47) дптр; центральная толщина роговицы (ЦТР) — 511,0‒607,0 (555,9±24,2) мкм, толщина «cap» — 100,0‒110,0 (108,2±3,87) мкм, диаметр оптической зоны — 6,2‒7,0 (6,77±0,19) мм. Интра- и послеоперационные характеристики: толщина удаленной лентикулы — 78‒159 (116,9±22,2) мкм, остаточная толщина роговицы — 392‒512 (438,9±31,1) мкм, индекс РТА (the percentage of tissue altered) — 33,1‒47,1 (40,6±3,83), глубина залегания задней поверхности лентикулы — 288‒402 (330,7±29,38) мкм.

После извлечения каждую лентикулу помещали в раствор для хранения роговицы Борзенка‒Мороз при температурном режиме 5—8 °C. Срок исследования лентикул составлял от 6 до 10 ч после операции. Сформированы 2 группы лентикул: 1-я группа — полученные у пациентов в возрасте 20‒36 лет, 2-я — у пациентов 41‒48 лет. Соответствующие данные представлены в табл. 1 и 2.

Таблица. 1. Диагностические данные пациентов обеих групп до операции (M±σ)

Примечание. Sph — сферический компонент, Cyl — цилиндрический компонент.

Таблица. 2. Хирургические параметры лентикул пациентов обеих групп (M±σ)

Всем пациентам проводили оптическую когерентную томографию (ОКТ) роговицы в режиме Corneal map для оценки толщины и равномерности эпителиального слоя. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица. 3. Показатели толщины эпителия роговицы (в мкм) у пациентов обеих групп до операции (M±σ)

Примечание. S — superior, I — inferior, N — nasal, T — temporal.

Сканирование топографии и определение жесткости методом СИПМ осуществляли с помощью сканирующего ион-проводящего микроскопа ICAPPIC (ICAPPIC Ltd., Великобритания; ООО «Нанопрофайлинг», Россия). Сканирующую платформу устанавливали на инвертированном оптическом микроскопе Nikon Ti-2 (Nikon, Япония). Внутри нанокапилляра, предварительно заполненного раствором Хэнкса и помещенного в держатель, устанавливали Ag/AgCl-электрод с целью создания ионного тока, для измерения величины которого нанокапилляр подводили к поверхности раствора Хэнкса. Диапазон размеров нанокапилляров от 45—50 нм проводил ток 1900—2200 пА. Сканирование проводили в растворе Хэнкса; чашку Петри помещали на сканирующую платформу, расположенную внутри камеры Фарадея в целях изоляции от внешних электрических шумов.

Процесс сканирования осуществляли в режиме «hopping mode» с амплитудой перемещения по оси Z 2000 нм. Расстояние между измеряемыми точками поверхности было равным 250 нм, количество пикселей в одном кадре — 256×256. Скорость нагружения нанокапилляра к поверхности составила 100 мкм/с; при приближении его острия к поверхности образца на расстояние, сопоставимое с радиусом нанокапилляра, наблюдалось снижение тока. Сканирование выполнялось посредством регистрации падения ионного тока, проходящего через острие нанокапилляра при подаче электрического напряжения между двумя Ag/AgCl-электродами. Расстояние между измеряемыми зонами задней поверхности роговичной лентикулы было равным ~0,5 мм, глубина деформации 300‒500 нм, размер одного кадра — 45×45 мкм (45 000 нм) (рис. 1).

Рис. 1. Схема сканирования задней поверхности роговичной лентикулы методом сканирующей ион-проводящей микроскопии.

Падение ионного тока на 0,5% от исходной величины соответствовало координатам топографии клеток. В ходе сканирования нанокапилляр достигал падения ионного тока на 2%. Координаты по оси Z при падении ионного тока на 1‒2% от исходного значения соответствовали величине деформации поверхности клеток ε (рис. 2).

Рис. 2. Кривые падения ионного тока на клетку и над субстратом.

Далее путем вычитания кривой падения тока на недеформируемом субстрате определяли истинную деформацию поверхности клетки. Затем для оценки модуля Юнга применяли теоретическую модель, описываемую в следующем виде:

,

где E — мЮ (Па), P — приложенное давление (Па), Ssub и Scell — наклон кривой на субстрате и клетке соответственно.

Обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения Image Viewer и Origin Lab.

Известно, что роговица благодаря регулярности строения характеризуется прозрачностью и высокой преломляющей способностью. Основная часть роговой оболочки — строма — сформирована параллельно расположенными (на расстоянии 20—40 нм друг от друга) коллагеновыми фибриллами, а также связующим веществом. Фибриллы, действующие как нагруженные опорные элементы, уложены, в свою очередь, в 300—500 переплетающих пластин. Вследствие этого напряженно-деформированное состояние ткани роговицы определяется прежде всего механическими свойствами самих волокнистых структур, их особой архитектоникой и взаиморасположением, внутри- и межмолекулярными связями, а также биохимическим составом. Фибриллы имеют характерную исчерченность с интервалом 64 нм. Диаметр фибрилл передних и задних стромальных пластин одинаков и равен 22 (27‒35) нм. Расстояние между фибриллами также приблизительно одинаковое: 43,2 нм в передних слоях и 45,6 нм — вблизи десцеметовой (задней пограничной) оболочки, при этом с возрастом оно уменьшается. Толщина одной пластины составляет от 1,5 до 2,5 мкм, ширина — от 9 до 260 мкм. Число коллагеновых пластин увеличивается от 300 в центральных участках роговицы до 500 на периферии. Таким образом, исследование с помощью сканирующего ион-проводящего микроскопа позволяет оценивать упругость роговицы на уровне фибрилл.

Результаты

Результаты СИПМ представлены в виде карты топографии исследуемого участка роговицы in vivo и мЮ в этой области (рис. 3).

Рис. 3. Результаты сканирующей ион-проводящей микроскопии: топография участка задней поверхности лентикулы и карта значений модуля Юнга.

В ходе работы впервые получены значения мЮ комплекса «фибрилл-межфибриллярного матрикса» средней стромы роговицы у пациентов 21‒48 лет (рис. 4, а, б).

Рис. 4. Значения модуля Юнга лентикул.

а — распределение значений модуля Юнга единичных лентикул; б — усредненные значения модуля Юнга лентикул в обеих группах (дисперсионный анализ One-Way ANOVA). ns — значения недостоверны.

В процессе исследования отмечены особенности проведения измерений в исследуемых группах. Лентикулы пациентов старше 40 лет нуждались в более частой коррекции положения, так как были более «вязкими» и при приближении нанокапилляра могли смещаться в сторону, чего не наблюдалось при исследовании лентикул в более молодой возрастной группе. При транспортировке были повреждены 4 лентикулы, исключенные из исследования. В 1-й группе полученные значения мЮ варьировали в диапазоне 128,7‒920,0 Па, во 2-й — в диапазоне 252,2‒641,1 Па. Эти показатели были достаточно низкими и сопоставимыми с таковыми для мягких гидрогелей [13].

Полученные результаты продемонстрировали отсутствие статистической значимой разницы (дисперсионный анализ One-Way ANOVA) между величинами мЮ в обеих группах. Такой факт можно объяснить тем, что патологические изменения при миопии происходят в областях высоких деформаций [14], в то время как в случае СИПМ глубина деформации составила 300‒400 нм.

Кроме того, изучена зависимость измеренного мЮ и толщины лентикулы. Анализ продемонстрировал наличие корреляции, для которой характерно снижение мЮ с увеличением толщины лентикулы как для 1-й, так и для 2-й группы (рис. 5, а, б).

Рис. 5. Зависимость значения модуля Юнга от толщины лентикулы.

а — в 1-й группе; б — во 2-й группе.

Обсуждение

Разработка фемтолазерных лентикулярных технологий открыла новые возможности для исследования биомеханических свойств стромальных тканей человека с использованием извлеченных лентикул. Изучение локальных механических свойств РЛ имеет важное значение для определения основных механизмов развития миопии и прогнозирования успеха рефракционной хирургии. Роговица обеспечивает ~70% рефракционной силы глаза, поэтому ее свойства крайне важны при коррекции рефракции. Во-первых, стромальную ткань можно исследовать с помощью прямых механических методов сразу после ее забора у пациента (в отличие от исследований донорских или животных глаз или косвенных измерений). Во-вторых, лентикулы рассматриваются как донорский материал для использования в тканевой инженерии роговицы, что требует наличия информации об их механической пригодности. Y. Xiang и соавт. [15] изучали механические свойства лентикул с помощью одноосных испытаний на растяжение. В этой работе возраст пациентов значительно варьировал и не указывалась информация о степени миопии. В более позднем исследовании Y. Song и соавт. [14] обнаружены корреляции между косвенными показателями, полученными с помощью прибора CORVIS ST (Oculus, Германия) и непосредственно измеряемой эластичностью роговицы. Однако указанные методики позволяют проводить измерения преимущественно на макроуровне, что не дает возможности обнаруживать патологические наноизменения РЛ.

С целью изучения биомеханических свойств роговицы in vivo предложены различные подходы, включая микроскопию Бриллюэна, оптическую когерентную эластографию и ультразвуковую эластографию. Микроскопия Бриллюэна — бесконтактный метод, позволяющий определять вязкоупругие свойства биообразцов, используя маломощный лазерный луч ближнего инфракрасного диапазона для определения продольного модуля упругости или механической сжимаемости ткани путем анализа спектра отраженного сигнала. Преимущество методики заключается в том, что с ее помощью можно создать полную 3D-карту всей роговицы без прямого контакта. Клинические данные также показали наличие биомеханических изменений после сшивания роговицы у пациентов с кератоконусом. Микронное пространственное разрешение и высокая чувствительность позволяют отображать внутриклеточный модуль и различать механические свойства ядра и цитоплазмы, а также обнаруживать изменения, вызванные возмущениями отдельных клеточных компонентов. В опубликованных работах имеются данные об изучении биомеханических и иных характеристик роговицы посредством количественной оценки частотных сдвигов по Бриллюэну. Многочисленные исследования показали, что этот способ может выявлять крайне незначительные изменения толщины роговицы и ее биомеханики при кератоконусе с высоким уровнем специфичности и чувствительности. Однако ограничения микроскопии Бриллюэна могут заключаться в длительности процедуры исследования использования и колебаниях точности в зависимости от состояния гидратации роговицы. Перспективные технологии, по-видимому, ориентированы на комбинацию ОКТ и микроскопии Бриллюэна [16‒18].

Наиболее широкое применение в исследованиях роговицы как в норме, так и после лазерного воздействия нашла атомно-силовая микроскопия (АСМ) [19, 20]. Лентикулы, полученные при SMILE-операциях, использовались для изучения нормальной роговичной стромы при различных условиях гидратации в работе D. Xia и соавт. [22]. Характеристики поверхностей таких лентикул изучены I.B. Damgaard и соавторами с точки зрения их применения при трансплантации роговицы [4]. Следует отметить, что форма лентикулы при различных технологиях отличается. В случае CLEAR формируются плосковыпуклые лентикулы в отличие от SMILE-лентикул с более выпуклым профилем передней поверхности.

В доступной литературе мы не встретили публикаций с описанием исследования биомеханических свойств РЛ, сформированных при использовании технологии CLEAR, с помощью СИПМ — относительно нового уникального и перспективного метода, в наибольшей степени способствующего решению поставленной нами задачи. СИПМ позволяет изучать морфологию, топографию и определять локальные механические свойства биообразцов и биологических систем (в том числе клеток и тонких структур) в физиологических условиях с высоким разрешением, что подтверждено результатами предыдущих работ [13, 21]. При помощи метода можно получать топографические изображения клеток в условиях, приближенных к физиологическим, обеспечивая неинвазивное воздействие. Наконец, СИПМ является идеальным инструментом для изучения эффектов различных лекарственных средств в отношении живых клеток в эксперименте [13, 21].

В отличие от АСМ СИПМ использует ионный ток через нанокапилляр, что минимизирует механическое воздействие на мягкие ткани. Проведенные ранее исследования демонстрируют, что обратная связь по ионному току позволяет определять точки регистрации поверхности образца зондом без силового воздействия на поверхность по сравнению с АСМ. Таким образом, метод делает возможным визуализацию в жидкости при поверхностных фибриллярных структур лентикул и с получением карты распределения значений мЮ с высоким разрешением при малых величинах наноиндентации (испытания материала посредством вдавливания в поверхность образца специального инструмента — зонда) поверхностных структур.

Посредством СИМП нам удалось получить впервые данные о биомеханических свойствах фибрилл средних слоев роговичной стромы на глубине в среднем 59,0±3,8% (от 52,9 до 66,9%) от значения толщины передней поверхности роговицы in vivo, описанные с помощью мЮ. В ходе проведения исследования возник целый ряд вопросов, которые предстоит решить в ближайшем будущем. Тем не менее данная работа посвящена безусловно перспективному направлению в изучении биомеханических свойств как отдельных роговичных слоев, так и роговицы в целом.

Выводы

Таким образом, основные результаты работы можно определить как следующие:

1. Впервые проведено исследование биомеханических свойств фибрилл средней стромы роговицы и описание их с помощью мЮ.

2. Показатели мЮ роговичных фибрилл составили в среднем 413,7 ±192,3 (от 128,7 до 919,7) Па: в 1-й группе пациентов 20‒36 лет 420,7±216,6, во 2-й группе 41‒48 лет — 396,4±123,5 Па.

3. Проведенный анализ зависимости измеренного модуля Юнга и толщины лентикулы продемонстрировал наличие корреляции, для которой характерно снижение мЮ с увеличением толщины лентикулы в обеих группах.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Кузнецова Т.С.

Сбор и обработка материала: Кузнецова Т.С., Колмогоров В.С.

Статистическая обработка: Кузнецова Т.С.

Написание текста: Кузнецова Т.С., Колмогоров В.С.

Редактирование: Антонюк В.Д., Файзрахманов Р.Р., Ерофеев А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.