Патогенетически ориентированная профилактика ретинопатии недоношенных (экспериментальное исследование)

За последние годы «клинический портрет» ретинопатии недоношенных (РН) претерпел значительные изменения. В структуре заболеваемости большое значение приобрели тяжелые атипичные формы патологии: задняя агрессивная форма РН и так называемая РН I зоны, развивающиеся у глубоко недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении [1—3].

Как известно, стандартом лечения классических форм РН, демонстрирующим высокую эффективность, является лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки [4]. Однако при «злокачественных» формах РН данный метод лечения не обеспечивает достаточно высокую частоту стабилизации патологического процесса (его эффективность не превышает 55—77%) [5], а также имеет очевидные ограничения, связанные с обширными зонами рубцовых изменений сетчатки после массивной лазеркоагуляции и соответствующим сужением полей зрения, миопией высокой степени, а также нарушением развития переднего сегмента глаза [6—8].

Альтернативой лазеркоагуляции аваскулярной зоны сетчатки при задней агрессивной форме РН и РН I зоны стало интравитреальное введение антиангиогенных препаратов [9]. Однако данный метод лечения при очевидных преимуществах (относительная простота и быстрота процедуры, быстрое развитие первичного эффекта, отсутствие «блокады» периферической сетчатки с возможностью продолжения роста сосудов и созревания сетчатки, меньшая частота развития и степень миопизации) также не лишен серьезных недостатков, таких как длительный период возможного появления рецидивов (до 70 нед), требует длительного наблюдения и частых осмотров, риск развития тракционных фиброваскулярных мембран, риск побочных системных эффектов, влияющих на развитие незрелых органов недоношенных детей [9—13].

Таким образом, в силу недостаточной эффективности и безопасности имеющихся методов лечения очевидной становится важность поиска новых возможностей профилактики развития «современной» РН как основы снижения инвалидности по зрению вследствие данной патологии. В серии проведенных нами ранее работ на модели экспериментальной РН (ЭРН) на новорожденных крысятах было показано, что интраперитонеальное введение экзогенного мелатонина в период развития сосудистой системы сетчатки крысят, находящихся в опытных условиях, т.е. на доклинической стадии развития патологии, предотвращает появление гистологических признаков развития ЭРН, способствует стабилизации гематоретинального барьера и оказывает выраженное антиоксидантное действие [14]. Превентивные свойства мелатонина открыли перспективы для проведения дальнейших исследований, в том числе направленных на изучение эффективности его аналогов, поскольку потенциальное применение в клинической практике нативного мелатонина ограничено его полифункциональностью и связанным с этим высоким риском побочных эффектов.

Цель работы — изучение механизмов влияния мелатонина и его аналогов на развитие ЭРН на доклинической стадии патологического процесса для обоснования новых подходов к профилактике РН в клинической практике.

Исследование было выполнено на 42 крысятах породы Вистар (84 глаза) в соответствии с ГОСТ 53434—2009 от 02.12.09 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP», постановлением главного государственного врача РФ №51 от 29.08.14 «Об утверждении СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)»«, Федеральным законом №61-ФЗ от 12.04.10 «Об обращении лекарственных средств». Протокол исследования был утвержден локальным этическим комитетом. Крысята были разделены на 6 групп: контрольная группа, опытная группа (крысята с ЭРН), опытные группы на фоне введения мелатонина, а также трех его аналогов — K-148, AL-3 и K-096.

Применяемая в работе модель ЭРН на новорожденных крысятах разработана и описана нами ранее, подтверждена иммуногистохимическими и гистологическими исследованиями, выявляющими характерные признаки заболевания, которые соответствуют 1—3-й стадиям активной фазы РН у детей [15].

Контрольную группу составили крысята, с момента рождения находившиеся в условиях с нормальным содержанием кислорода.

Еще четырем группам крысят, находившихся в опытных условиях, с 1-х по 14-е сутки интраперитонеально вводили раствор мелатонина (Sigma-Aldrich, США) или его аналогов по 0,1 мг в 30 мкл стерильного 0,05 М фосфатного буферного раствора (pH 7,4), содержащего 10% диметилсульфоксида. Аналоги мелатонина были синтезированы на кафедре медицинской химии и тонкого органического синтеза МГУ им. М.В. Ломоносова.

Крысят выводили из эксперимента на 7-е сутки (по 4—5 крысят, т.е. 8—10 глаз, из каждой группы на каждом сроке исследования). Всем крысятам проводили бинокулярную энуклеацию, выделяли сетчатки, гомогенизировали, после чего определяли концентрацию в гомогенатах фактора, индуцированного гипоксией (HIF-1α) и сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-А) методом иммуноферментного анализа (ELISA kit for hypoxia inducible factor 1 alpha, ELISA kit for VEGF A; Cloud-Clone Corp., США) и концентрацию общего белка по Лоури. Содержание HIF-1a и VEGF-А приводится в пересчете на количество белка в гомогенате сетчатки.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием статистических пакетов Microsoft Excel и Statistica 10.0. Для оценки достоверности различий между группами с уровнем значимости не менее 95% был применен непараметрический U-критерий Манна—Уитни.

Сравнительный анализ показал, что средний уровень HIF-1α в сетчатке крысят опытной группы (34,5±5,7 пг/мг белка) достоверно превышал данный показатель в контрольной группе (16,4±3,9 пг/мг белка; p<0,05). Интраперитонеальное введение мелатонина и его аналогов (К-148, AL-3, К-096) крысятам опытной группы приводило к снижению уровня данного регуляторного фактора практически до контрольных значений — 20,2±1,2; 14,2±3,7; 15,1±4,7 и 14,9±2,7 пг/мг белка соответственно (рис. 1). При этом аналоги К-148 и К-096 оказывали значимо более выраженное влияние на величину данного показателя, по сравнению с мелатонином (p<0,05).

Рис. 1. Средний уровень HIF-1α в сетчатке крысят исследуемых групп на 7-е сутки эксперимента.

Сходные результаты были получены при анлизе содержания VEGF-A. Его средний уровень в сетчатке крысят опытной группы, как и уровень HIF-1α, достоверно превышал данный показатель в контрольной группе — 52,2±3,6 и 34,3±3,7 пг/мг белка соответственно (p<0,05). Применение мелатонина и его аналогов (К-148, AL-3, К-096) приводило к нормализации этого показателя, снижая его до уровня контроля — 30,7±3,2; 35,6±2,5; 40,9±4,3 и 34,4±2,4 пг/мг белка соответственно (рис. 2). При этом в отличие от HIF-1α влияние мелатонина было достоверно более выраженным по сравнению с его аналогами (p<0,05).

Рис. 2. Средний уровень VEGF-A в сетчатке крысят исследуемых групп на 7-е сутки эксперимента.

Важно отметить, что 7-е сутки эксперимента в применяемой модели заболевания соответствуют сроку персистенции аваскулярных зон сетчатки, т.е. доклинической стадии развития патологического процесса. Нормализация уровней изучаемых ангиогенных факторов на фоне введения мелатонина и его аналогов именно на данном сроке свидетельствует об их превентивных свойствах и раскрывают механизм показанного ранее влияния на развитие патологической неоваскуляризации при РН.

Роль VEGF-А в развитии патологической вазопролиферации при РН довольно широко изучена и лежит в основе применения анти-VEGF- препаратов в лечении определенных форм РН во вторую фазу заболевания [16, 17]. Ангиогенные свойства HIF-1α также являются предметом активного изучения. Известно, что важнейшее свойство HIF-1α — способность к стимуляции экспрессии VEGF-А. Содержание активного HIF-1α в клетках снижается в условиях гипероксии и повышается при возвращении в условия нормоксии, что коррелирует с экспрессией VEGF-А. В период внутриутробного развития низкие концентрации кислорода подавляют активность пролилгидроксилазы, инактивирующей HIF-1a, в результате чего растет локальная концентрация активного HIF-1a и, как следствие, VEGF, что, в свою очередь, способствует нормальному васкулогенезу [18]. В нашей работе в сетчатке крысят с ЭРН содержание этих факторов роста было повышено еще до начала патологической вазопролиферации, что, вероятно, является причиной ее индукции в дальнейшем. Показанное в более ранних наших работах положительное влияние мелатонина на развитие ЭРН [14] можно объяснить блокадой данных факторов на столь раннем сроке.

Особого внимания заслуживают данные, полученные в отношении аналогов мелатонина, ввиду большей перспективности применения последних в клинической практике по сравнению с нативным мелатонином. Известно, что мелатонин представляет собой крайне полифункциональную молекулу. В многочисленных исследованиях было показано, что он обладает широким спектром антиоксидантных, противовоспалительных, нейропротекторных, а также антиангиогенных свойств [19—22]. Однако следует также помнить, что прежде всего он играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов, а также принимает участие в функционировании репродуктивной, цереброваскулярной, нейроэндокринной, иммунной и зрительной систем [23], так что его применение у недоношенных детей, особенно в раннем постнатальном периоде, может приводить к нарушению нормального созревания и функционирования данных систем. Важно отметить, что различные подтипы мелатониновых рецепторов широко представлены практически во всех структурах глаза, и воздействие на них может приводить к разного рода физиологическим и биохимическим изменениям в различных внутриглазных тканях. Поэтому особую важность приобретает вопрос применения селективных агонистов (или антагонистов) конкретных рецепторов мелатонина, что будет способствовать повышению эффективности выбранного лечения при одновременном снижении возможных побочных действий.

Полученные в данной работе результаты позволяют рассматривать применение изученных нами аналогов мелатонина в качестве перспективных средств профилактики развития РН. Требуется дальнейшее изучение механизмов, а также эффективности и безопасности их действия с целью возможности внедрения рассматриваемых препаратов в клиническую практику.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.К., Н.Ч.

Сбор и обработка материала: О.Б., Н.О., А.П.

Статистическая обработка: О.Б.

Написание текста: Н.О.

Редактирование: Л.К., Н.Ч.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.