Двухсотлетняя история развития кератопротезирования характеризируется поиском модели, способной сохранять целостность конструкции и свои оптические свойства на протяжении всей жизни пациента. В настоящее время в мире преимущественно используют 3 варианта: Бостонскую модель кератопротеза, остео-одонто-кератопротез и модель Федорова—Зуева [1, 2]. Несмотря на разнообразие форм, размеров и материала, доля отторжения кератопротезов, по данным литературы, составляет 10—75% случаев. Одной из причин этого являются конструктивные особенности опорных элементов кератопротеза, не обеспечивающих его надежную фиксацию в патологически измененной ткани роговицы, что сопровождается обнажением и протрузией имплантата [3].

Наряду с изучением физиологических процессов в роговице, обусловленных интрастромальной фиксацией опорной части кератопротезов, проводился ряд экспериментов на глазах животных в поиске оптимального материала для их изготовления, обладающего максимальной биоинертностью по отношению к тканям глаза [4]. C. Dolhman, H. Cardona, T. Chirila и ряд других авторов в качестве материала для опорной пластины использовали синтетические полимеры. Авторами предложены модели с опорной частью из полиметилметакрилата, пропласта, полиуретана, полигидроксиэтилметакрилата и др. [5—7]. Клинические наблюдения показали, что предпочтение следует отдать использованию гидрофобных полимерных материалов ввиду их более высокой прочности на фоне достаточной биоинтеграции в слои роговицы [8].

Позднее J. Legeais, V. Trinkaus-Randall и соавторы пришли к выводу, что наличие отверстий в опорных пластинах предотвращает полное разобщение передних и задних слоев роговицы, способствует лучшей удерживаемости кератопротеза в роговице и снижает риск отторжения в результате асептического некроза поверхностных слоев ткани [9—11]. Однако имплантация усовершенствованных моделей не привела к полному устранению послеоперационных осложнений. Основные причины неуспеха, с нашей точки зрения, заключались в структуре материала и неоптимальном дизайне опорной пластины кератопротеза. Следует также констатировать, что вышеперечисленным авторам так и не удалось найти подходящих для кератопротезирования химических параметров полимера и предложить материал с заданной структурой пористости [12, 13].

Таким образом, потребность в повышении эффективности метода кератопротезирования, обусловленная значительной долей осложнений в виде асептического некроза поверхностных слоев роговицы, приводящего к протрузии протеза, свидетельствует о необходимости дальнейшей работы в этом направлении.

В качестве предпосылки к данному этапу работы с использованием технологических возможностей оригинального метода фотополимеризации нами разработан ряд новых моделей опорных пластин кератопротеза (ОПК), выполненных из гидрофобного акрила. Модели имеют ячеистую структуру, толщину 100 мкм и форму с изгибом, соответствующим кривизне роговицы, а также общий диаметр, равный 4 мм [14]. Данные параметры оптимизированы для проведения эксперимента на глазах животных (кролики). ОПК изготовлены ООО «Репер-НН» (Нижний Новгород, РФ). Для проведения эксперимента отобраны две модели, имеющие сквозные отверстия различной конфигурации, позволяющие максимально интегрироваться в ткань роговицы и не нарушать ее питание после имплантации.

Цель исследования — изучить биосовместимость разработанных моделей ОПК после имплантации в роговицы экспериментальных животных (кролики) методами клинической оценки, биомикроскопии и оптической когерентной томографии (ОКТ) в динамике послеоперационного периода, а также при помощи световой и сканирующей электронной микроскопии.

Материал и методы

Материалом для исследования in vivo послужили кролики породы Шиншилла (n=15). Исследования проводили в экспериментальной лаборатории Калужского филиала ФГАУ НМИЦ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России. Для проведения экспериментов в соответствии с типом и дизайном имплантируемых материалов были сформированы три группы исследования. В 1-ю группу вошло 5 кроликов (5 глаз), в роговицу которых имплантировали ОПК из гидрофобного акрила со сквозными квадратными отверстиями размерами 220×220 мкм (модель №1), 2-ю группу составили 5 кроликов (5 глаз), в роговицу которых имплантировали ОПК из гидрофобного акрила со сквозными отверстиями трапециевидной формы и изменяющейся величиной от периферии к центру с размерами ячеек от 170×130 до 180×70 мкм (модель № 2). Животным 3-й (контрольной) группы имплантировали ¹/₂ часть ОПК модели Федорова–Зуева, выполненную из титана.

При моделировании эксперимента на животных учитывали факт наличия у кроликов тонких роговиц (от 350 мкм в центральной области и до 400 мкм на периферии), что предопределяло техническую сложность хирургического вмешательства, связанную с высоким риском перфорации роговицы. С учетом биоэтических норм и правил гуманного обращения с животными операции проводили под общей анестезией.

После обработки операционного поля и установки векорасширителя производили несквозной разрез в прозрачной части роговицы кролика протяженностью 5 мм на ²/₃ глубины концентрично лимбу с отступом от него на 1—1,5 мм. Металлическим расслаивателем формировали карман в центральной зоне роговицы диаметром 4 мм, что соответствовало диаметру ОПК. Опорные пластины имплантировали в сформированное роговичное ложе, на разрез накладывали узловые швы (нейлон 10-0) с последующим введением под конъюнктиву растворов антибиотика (гентамицин) и стероида (дексаметазон). Операцию завершали частичной блефарорафией единичным швом (викрил 6-0). В послеоперационном периоде проводили терапию в виде инстилляций в конъюнктивальную полость растворов антибиотика (Вигамокс) и стероида (Офтан-дексаметазон) 2 раза в день в течение 7 дней.

В каждой группе экспериментальных животных наблюдали в сроки 1, 3, 7, 14, 30 и 90 дней с выполнением биомикроскопии и ОКТ роговицы (Optovue, США). На сроке 3 мес животных выводили из эксперимента. Глаза энуклеировали, выделяли корнеосклеральные диски, которые использовали для проведения морфологических исследований.

Для гистологических исследований материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Выполняли серии гистологических срезов, окрашивая их гематоксилином и эозином. Препараты изучали под микроскопом Leica DM LB2 с камерой DFC-320 при 50- и 200-кратном увеличении с последующим фотографированием. Световая микроскопия полученных образцов была выполнена в Лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГАУ НМИЦ МНТК «Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Федорова Минздрава России (зав. лабораторией к.м.н. А.В. Шацких).

Для подготовки образцов к электронно-микроскопическому исследованию роговично-склеральные диски извлекали из фиксирующего 10% раствора формалина, далее с помощью вакуумного трепана Barron (Katena, США) диаметром 6 мм выкраивали сквозной роговичный диск. Затем проводили два разреза на роговице по краю сформированного роговичного кармана для вскрытия его полости. После этого одним пинцетом фиксировали часть выкроенного диска со стороны десцеметовой мембраны, а другим — край роговичного клапана и производили раскрытие с отсечением крышки и обнажением ложа роговичного кармана. После вскрытия данного кармана во всех исследуемых группах изучали поверхность имплантированной ОПК, поверхностные слои — «крышку» и стромальное ложе роговицы. Исследования проводили в Центре фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (зав. центром д.м.н., проф. С.А. Борзенок). На этапе подготовки образцов применяли метод обезвоживания с использованием ацетоновой батареи (10, 20, 30, 50, 70, 90 и 100%) трехкратно по 10 мин в каждом растворе с последующим вакуумным высушиванием в критической точке (K850 Critical Point Dryer, Quorum).

Далее все образцы фиксировали на алюминиевых предметных держателях (по одному для каждого образца) с помощью карбонового скотча таким образом, чтобы поверхность стромы роговицы была обращена вверх. После фиксации производили напыление образцов золотом (проба 999, толщина слоя 5 нм) с помощью установки (JEOL Company Smart Coater, Япония) для обеспечения электронно-оптической плотности. Затем образцы помещали в камеру двулучевого сканирующего электронного микроскопа JCM-6000 PLUS (JEOL Company, Япония) и анализировали в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ при увеличениях 20, 100, 400, 1000, 2000.

Результаты

При биомикроскопии к концу 1-й недели (7 дней) у 1 кролика (1 глаз) 1-й группы отмечали незначительную инъекцию сосудов концентрично лимбу, локальное помутнение передних слоев роговицы в области залегания ОПК (рис. 1, а). Во 2-й группе в ранние сроки наблюдения (первые 3 суток) во всех случаях отмечали наличие незначительного отека роговицы в области операционного шва (см. рис. 1, б). Умеренная поверхностная инъекция сосудов конъюнктивы расценивалась нами как ответная реакция ткани роговицы кролика на хирургическую травму. Она постепенно исчезала к 14-м суткам после операции. Атипичное течение послеоперационного периода на 30-е сутки наблюдения отмечено у 1 экспериментального животного (1 глаз) из 2-й группы. При биомикроскопии роговицы над зоной ОПК, не имеющей ячеистой структуры, определяли небольшую зону стромального помутнения, с последующей десквамацией эпителия, истончением слоев роговицы и формированием язвенного дефекта (см. рис. 1, в).

Рис. 1. Биомикроскопическая картина глаз кроликов.

а — 7-е сутки наблюдения (1-я группа); б — 3-и сутки послеоперационного периода (2-я группа); в — 30-е сутки после имплантации ОПК (2-я группа); г — 30-е сутки наблюдения (контрольная группа).

По истечении 3 мес при выполнении биомикроскопии в 1-й группе животных (1 глаз) и во 2-й группе (2 глаза) наблюдали помутнение передних отделов роговицы над ОПК и протрузию у 1 кролика (1 глаз) в 1-й группе. В остальных случаях в опытных группах визуализировали роговицу без признаков воспалительной реакции, ОПК сохраняли правильное положение в роговичном кармане. В 3-й (контрольной) группе положение ОПК модели Федорова–Зуева в интрастромальном кармане было стабильным во всех случаях. При этом окружающая роговица сохраняла прозрачность, видимых дефектов передних отделов стромы не наблюдали (см. рис. 1, г).

При помощи ОКТ определяли толщину роговицы над центральной областью ОПК, а также глубину формирования интрастромального кармана. В 1-й группе в одном случае (1 глаз) на 30-е сутки визуализировали выпячивание ОПК в направлении переднего эпителия с истончением надлежащих слоев стромы роговицы до 101 мкм с последующей протрузией ОПК на 90-е сутки (рис. 2, а). Во 2-й группе у 1 кролика (1 глаз) определяли зону стромального помутнения с истончением слоев роговицы до 44 мкм над центральной областью ОПК на 30-е сутки послеоперационного периода (см. рис. 2, б). При этом в 3-й (контрольной) группе во всех случаях на 30-е и 90-е сутки в проекции интрастромального кармана визуализировали ОПК, равномерно располагающиеся в средних слоях стромы роговицы (см. рис. 2, в).

Рис. 2. Оптическая когерентная томограмма глаз кроликов.

а — 30-е сутки наблюдения (1-я группа); б — глубина формирования интрастромального кармана — 152 мкм (2-я группа); в — 30-е сутки после имплантации ОПК (контрольная группа). Глубина формирования интрастромального кармана — 287 мкм.

На сроке наблюдения 3 мес при проведении световой микроскопии в 1-й группе (4 глаза) и во 2-й группе (5 глаз) визуализировались полости в строме центральных отделов, повторяющие ячеистую форму протеза (рис. 3). Роговица была эпителизирована не полностью, в строме передних отделов отмечался умеренный отек, в задних отделах признаков патологических изменений не обнаружено (см. таблицу).

Рис. 3. Гистологический препарат роговицы кролика.

а — 1-я группа, ув. 50; б — 2-я группа, ув. 50; в — 3-я группа, ув. 50; г — 1-я группа, ув. 200 (окраска гематоксилином и эозином).

Гистологические параметры роговицы кролика, определяемые методом световой микроскопии

При этом во 2-й группе визуализировалась полость в строме с фрагментами капсулообразования, в 1-й группе элементы капсулы в полости отсутствовали (см. рис. 3, а, б). В контрольной группе (5 глаз) в зоне сформированного роговичного кармана определялся центральный отдел стромы с фрагментами фиброзного капсулообразования и незначительным наличием клеточных компонентов по периферии, поверхность роговицы была полностью эпителизирована (см. рис. 3, в).

В процессе электронно-микроскопического исследования проводили оценку образцов всех групп на наличие клеточных, коллагеновых элементов, степени деформации ОПК на изучаемых поверхностях. В опытных группах на поверхности роговичного ложа определяли комплементарно сформированные ячеистые структуры ОПК с прорастанием волокнами соединительной ткани (рис. 4).

Рис. 4. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

а — поверхность ложа роговицы с повторением конструкции ОПК кролика 1-й группы (ув. 100); б — 1-я группа (ув. 400); в — интрастромальный карман вскрыт, визуализируется ¹/₂ ложа роговицы кролика 2-й группы (ув. 22); г — поверхность ложа роговицы с повторением контуров ячеистой структуры ОПК кролика 2-й группы (ув. 100).

В опытных группах на поверхности роговичной крышки визуализировались подобные структуры с коллагеновыми волокнами разного диаметра и в меньшем количестве по сравнению с поверхностью ложа (рис. 5). В обеих опытных группах на поверхности ОПК наблюдали незначительное количество клеточных элементов и коллагеновой волокнистой ткани, заполняющей ячейки опорной пластины кератопротеза (рис. 6). Во 2-й опытной группе вокруг ОПК отмечали участки капсулообразования из молодой соединительной ткани (рис. 7). В контрольной группе поверхность титанового опорного элемента была шероховатой, с участками неровных, острых краев и отсутствием клеточных элементов и молодых коллагеновых фибрилл (рис. 8).

Рис. 5. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

а — поверхность крышки роговицы кролика 1-й группы (ув. 100); б — 1-я группа (ув. 400); в — поверхность крышки роговицы кролика 2-й группы (ув. 400); г — 2-я группа (ув. 1000).

Рис. 6. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

а — поверхность ОПК 1-й группы (ув. 100); б — поверхность ОПК 2-й группы (ув. 100).

Рис. 7. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

Поверхность ОПК 2-й группы: а — ув. 200; б — ув. 400.

Рис. 8. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

Поверхность ¹/₂ ОПК модели Федорова—Зуева (контрольная группа): а — ув. 22; б — ув. 100.

Обсуждение

Многочисленные исследования в области кератопротезирования направлены на улучшение анатомических результатов данного метода за счет использования биоматериалов, способствующих адгезии клеточных элементов и лучшей биоинтеграции ОПК в строму роговицы. Этот процесс зависит от ряда факторов, таких как поверхностный заряд полимера, адсорбция (гидрофильность/гидрофобность), пористость материала и других [15—17]. При этом в соответствии с клиническими требованиями материал для полимера должен быть нетоксичным, небиорезорбируемым в связи с длительным пребыванием в роговице, сохраняя заданную форму [18]. Известно, что опорный элемент кератопротеза, выполненный из пористого гидрофобного материала, способствует проникновению в эти поры стромальных фибробластов, пролиферации и синтезу белков и гликозаминогликанов соединительной ткани, обеспечивающих надежную фиксацию синтетического материала в строме роговицы [14].

Наблюдаемое нами течение послеоперационного периода в опытных группах, осложненное протрузией ОПК, возможно, было связано с имплантацией в поверхностные слои стромы на глубину менее 160 мкм. При этом происходило нарушение питания роговицы в области без ячеистой структуры ОПК (2-я группа) с последующей потерей ее прозрачности и развитием асептического некроза, что было подтверждено результатами исследования с помощью оптического когерентного томографа.

Согласно результатам электронно-микроскопических исследований, в ячейках полимерных пластин и на их поверхности нами обнаружены адгезированные волокнистые элементы, которые во 2-й опытной группе образовывали участки капсулообразования, совпадающие с данными световой микроскопии. Формирующиеся волокнистые структуры вокруг опорных пластин оказывают стабилизирующее влияние на их положение в роговице. В контрольной группе были обнаружены минимальные адгезивные свойства титановой пластины к соединительно-тканному остову стромы роговицы без наличия клеточных элементов и молодых волокон. Представленная картина, по всей вероятности, обусловлена биоинертными свойствами титана.

Наличие волокнистых структур на внутренней поверхности ложа в большем количестве, чем на поверхности «крышки», вероятнее всего, обусловлено механическим повреждением внутренней поверхности роговицы в процессе имплантации ОПК (альтерации) как первой фазы воспалительного процесса с последующим формированием капсулообразования. Также не исключены различия пролиферативного ответа, характерного для поверхностных и глубоких слоев роговицы в результате различия клеточного состава и условий питания последних.

Согласно результатам проведенных исследований, ОПК из гидрофобного акрила (опытные группы) являются наиболее перспективными для конструирования новых моделей кератопротезов.

Заключение

Результаты морфологических исследований позволяют заключить, что пребывание исследуемых опорных пластин из гидрофобного акрила в строме роговицы кроликов (опытные группы) вызывало более выраженную инкапсуляцию по сравнению с таковыми в контрольной группе. В опытных группах реакция со стороны стромы роговицы и прорастание волокнами соединительной ткани было больше, что обусловлено ячеистым строением изделий и физическими свойствами данного материала. Нами сделан вывод, что опорные пластины, изготовленные из гидрофобного акрила, являются потенциально пригодными для проведения дальнейших экспериментальных исследований в качестве основы для изготовления новых моделей кератопротезов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Б.М., С.Б., Е.К., А.Г., А.Э., М.Д.

Сбор и обработка материала: А.Э., А.Ш., Д.О., А.Б.

Статистическая обработка: А.Э.

Написание текста: А.Э.

Редактирование: Б.М., С.Б., Е.К., А.Г., А.Ш.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.