Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) — сложное, многофакторное нейродегенеративное заболевание тканей глазного дна, которое становится причиной нарушения и потери зрения у людей пожилого и старческого возраста [1]. В основе патогенеза ВМД лежат характерные для старения дистрофические процессы с поражением хорио-капиллярного слоя пигментного эпителия, мембраны Бруха и хориоидеи сетчатки [2, 3] с последующим формированием хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) [4]. Сложные взаимодействия средовых и генетических факторов определяют склонность человека к развитию заболевания. К факторам риска развития ВМД относят кардиоваскулярные заболевания, пожилой и старческий возраст, атеросклеротические изменения сосудов, особенности питания, курение, светлый цвет глаз. Конкретные молекулярно-генетические механизмы развития ВМД, способствующие переходу нормальных физиологических возрастных изменений сетчатки в патологический процесс, на сегодняшний день обсуждаются. Известно, что повреждение сосудов, ишемия и гипоксия сетчатки сопровождаются целым комплексом клеточных и воспалительных процессов и каскадом реакций с участием воспалительных цитокинов [5, 6]. Для ХНВ характерно нарушение нормального баланса цитокинов, в частности, рядом авторов показано снижение количества апоптогенного цитокина TNFa, влияющего на апоптоз эндотелиоцитов и определяющих превалирование в хориоидее и сосудах сетчатки глаза пролиферативных процессов над апоптотическими [7]. С другой стороны, есть данные об увеличении экспрессии TNF и IL-1β ретинальным пигментным эпителием (РПЭ), объясняющие воспалительный компонент ХНВ, а также изменение баланса IL-2, IL-6 и IL-10, но их роль до конца не ясна [8].

Поэтому, наряду с процессами дистрофических изменений сетчатки в межклеточном матриксе, патологического ангиогенеза, нарушения липидного обмена, окислительного стресса, широко обсуждаются процессы иммунного воспаления как фактора развития ВМД. Кроме того, выявлена ассоциированность отдельных полиморфизмов генов IL4, IL6, IL8, IL10, IL18 с развитием ВМД и ХНВ [9, 10]. Показано, что генетический полиморфизм промоторных регионов генов цитокинов оказывает влияние на их транскрипционную активность, что приводит к межиндивидуальным различиям продукции цитокинов [11]. Мы предположили, что полиморфизм генов ключевых цитокинов может быть важной детерминантой развития ВМД, и провели анализ полиморфизма полиморфных вариантов генов цитокинов TNF-A863C; TNF-A308G; TNF-A238G; IL1β-C-31T; IL4-C590T; IL6-C174G; IL10-A 1082G и IL10-А592C у пациентов с ВМД относительно здоровых аналогичного возраста. Предполагается, что носители различных генотипов в полиморфных регуляторных участках генов обладают различным базовым уровнем продукции цитокинов, что в свою очередь может оказывать влияние на характер развития патологического процесса.

Обследованы 202 человека (404 глаза), прошедшие диагностическое обследование на базе Новосибирского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» в 2013—2014 гг. Все пациенты фенотипически относились к представителям европеоидного населения РФ и идентифицировали себя и своих родителей как лиц русской национальности, длительное время проживающих на территории Сибири, языком общения которых является русский. Все пациенты в зависимости от наличия ВМД были разделены на 2 группы: основную группу составили 102 пациента с ВМД, группу сравнения — 100 человек без ВМД. Характеристика обследованных групп представлена в табл. 1.

Критериями включения в основную группу являлись наличие диагноза ВМД и возраст старше 60 лет, в группу сравнения — отсутствие диагноза ВМД в аналогичном возрасте. Критерием исключения для обеих групп являлось наличие у пациентов острых и обострения хронических воспалительных заболеваний органа зрения, глаукомы, увеита различной этиологии, полной осложненной катаракты, отслойки сетчатки, рубеоза радужки.

Также из исследования исключались пациенты с сахарным диабетом, аутоиммунными и опухолевыми процессами любой локализации. Диагноз ВМД поставлен на основании результатов стандартного офтальмологического обследования, включающего визометрию, тонометрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, периметрию, оптическую когерентную томографию макулярной области. Исследование было одобрено комитетом по биомедицинской этике Новосибирского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». У всех пациентов было получено информированное согласие на забор крови, а также использование данных исследования в научных целях.

Исследовали однонуклеотидный полиморфизм (SNP — single nucleotide polymorphism) промоторного региона генов TNFα-863 C→A, TNFα-308 G→A, TNFα-238 G→A, IL1β-31 С→T, IL4−590 С→T, IL6−174 G→C, IL10−1082 G→A и IL10−592 А→С. Генотипирование осуществляли методом рестриктного анализа длин продуктов амплификации (RFLP — restriction fragment length polymorphism). Участки промоторного региона генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров [12], затем продукты амплификации подвергали гидролизу эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2,5% агарозном геле.

При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR, odds ratio) с расчетом 95% доверительного интервала (95% Confidence Interval — 95% CI) [13—15]. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вейнберга [13]. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию χ² с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [16]. Для оценки диагностической значимости генетических признаков использовали показатель специфичности, расчет которого осуществляли с использованием общепринятых методов медико-биологической статистики [17]. При OR больше 1 специфичность рассчитывали как долю отрицательных результатов генетического теста в группе сравнения, а при OR меньше 1 — как долю отрицательных результатов генетического теста в основной группе [18].

Исследовано 8 полиморфных вариантов 5 генов цитокинов TNF-A863C; TNF-A308G; TNF-A238G; IL1β-C31T; IL4-C590T; IL6-C174G; IL10-A1082G и IL10-А592C у пациентов с ВМД и в группе относительно здоровых лиц аналогичного возраста без признаков ВМД. Все полиморфные сайты локализованы в промоторных регионах генов и ответственны за уровень их экспрессии. Частоты генотипов исследуемых генов в сопоставляемых группах находятся в равновесии Харди—Вейнберга. Достоверные различия частот отдельных генотипов между группами показаны только для двух полиморфных позиций. Наличие в геноме пациентов гетерозиготного генотипа TNF-308 GA (OR = 2,91 95% CI 1,39—6,11) и IL10−1082 GG (OR = 2,21 95% CI 1,08—4,52), частота которых увеличена в группе пациентов с ВМД, является фактором риска развития заболевания. В то же время минорный генотип TNF-308 АA протективен в отношении заболевания (OR = 0,22 95% CI 0,06—0,81). Не следует забывать, однако, что при любом процессе воспаления цитокины образуют определенную регуляторную сеть (каскад цитокинов) с многофункциональным действием. Взаимосвязь между цитокинами приводит к тому, что в действии многих из них наблюдается синергизм, а некоторые цитокины являются антагонистами. Аналогичную «сеть» образуют и гены цитокинов. Поэтому при исследовании ассоциированности генов цитокинов с заболеванием необходимо, по возможности, учитывать каскадность цитокинов со сложной прямой и обратной связью и с клетками — носителями соответствующих рецепторов. Поэтому было принято решение проанализировать частоту встречаемости комплекса полиморфных вариантов генов ряда ключевых цитокинов, выявляемых в геноме каждого обследуемого пациента. В данном исследовании были проанализированы 8 полиморфных вариантов 5 ключевых генов цитокинов и проведен дальнейший анализ комплексных генотипов генов цитокинов, позволяющий выделять при высокой их специфичности носителей с высокими значениями отношений шансов развития ВМД. Выявлено 48 комплексных генотипов, позитивно ассоциированных с заболеванием и достоверно различающихся между группами. В табл. 2 представлены генотипы со значением показателя OR больше 5. Уровень специфичности комплексных генотипов составляет 98—99%, при этом значения OR более высоки, чем при анализе моногенотипов. Нами установлены максимальные значения OR, равные 10,76, при носительстве комплексных генотипов TNF-863 CC: IL1B-31 TT: IL6−174 GC: IL10−592CC и TNF-863 CC:TNF-238 GG:IL1B-31 TT:IL6−174 GC:IL10−592CC при 99% специфичности. При гомозиготном носительстве во всех позитивно ассоциированных с ВМД генотипах, включая непредставленные в табл. 2, соблюдается определенный баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Провоспалительные цитокины представлены генотипами, ассоциированными с низким уровнем транскрипционной активности гена, в то время как генотипы гена IL10 в двух полиморфных позициях представлены генотипами, ассоциированными с высоким уровнем экспрессии. Негативно ассоциированы с ВМД 32 комплексных генотипа, часть из которых со значениями OR меньше 0,3 представлена в табл. 3. В негативно ассоциированных с заболеванием комплексных генотипах провоспалительный цитокин TNFa в полиморфной позиции -863 представлен в основном гетерозиготным генотипом, ответственным за более высокий уровень белкового продукта. В комплексах, содержащих 3 полиморфные позиции промоторного региона гена TNFa, в позиции -308 представлен генотип АА, ответственный за высокий уровень белкового продукта и встречающийся в популяции с частотой всего 1,54%. Противовоспалительный цитокин IL10 в позиции -1082 представлен либо гомозиготным генотипом АА с низким уровнем экспрессии, либо гетерозиготным генотипом, а в позиции -592 — преимущественно гетерозиготным генотипом, также ответственным за более низкий уровень белкового продукта.

Кроме более специфичного выделения групп повышенного риска развития заболевания, комплексный анализ позволяет критически посмотреть на некоторые ассоциации единичных полиморфных позиций с заболеванием. Так, выявленная в нашем исследовании ассоциированность TNF-308 GA с ВМД реализуется только в комплексе с IL4-C590Т генотипом. Во всех остальных комплексных генотипах эта позиция представлена ассоциированным с низким уровнем продукции генотипом TNF-308GG. Аналогично протективный в отношении заболевания минорный генотип TNF-308 АA реализуется только в сложном генотипе из трех полиморфных позиций промоторного региона данного гена. В то же время моногенотип IL10−1082 GG, частота которого повышена у пациентов с ВМД, является составляющей компонентой большинства комплексных генотипов, ассоциированных с патологией. Кроме того, в комплексных генотипах более четко прослеживается и смещение баланса про- и противовоспалительных цитокинов за счет их асссоциированности с определенным уровнем белковой продукции.

Таким образом, проведенное исследование показало, что комплексный анализ полиморфных вариантов генов цитокинов оказался более информативным при рассмотрении вопроса о роли генетической компоненты в развитии ВМД. Комплекс генотипов цитокинов, присутствующий в геноме каждого пациента, оказался более тесно ассоциирован с развитием возрастной патологии в сравнении с характером ассоциированности ВМД с единичными полиморфными участками регуляторных областей генов цитокинов. Нам представляется, что дальнейшие исследования в этом направлении могут предоставить возможность значительного повышения прогностической значимости выявления различных комплексов генов цитокинов и других регуляторных белков у пациентов на ранних этапах развития ВМД с целью формирования групп повышенного риска развития этой офтальмопатологии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Ш., В.К., В.Ч., А.Е., Л.Д., Н.К., А.Т.

Статистическая обработка данных: А.Ш., В.П.

Написание текста: А.Ш.

Редактирование: В.К.

Конфликт интересов отсутствует.