Проапоптотические полиморфизмы p53(C72G) и p21(C31A) как фактор риска первичной открытоугольной глаукомы у резидентов Забайкальского края

В настоящее время есть все основания относить глаукому к группе многофакторных заболеваний с пороговым эффектом, развивающихся при активации апоптоза, связанного с активацией проапоптотических генов и белковой перестройкой содержимого клеток [1]. Регуляция апоптоза осуществляется многочисленными сигнальными системами [4].

Установлена ключевая роль антионкогена р53 (опухолевого супрессора) в этом процессе. Опосредованная р53 остановка пролиферации в стадии G1 или G2 клеточного цикла необратима. Реализации такого эффекта р53 предшествует индукция циклинзависимого ингибитора киназ — р21. Установлено, что мишенями для р53 также являются несколько специфических генов, таких как антагонист гена Bax ген Всl2, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), связывающий белок IGF-BP3, компоненты ренин—ангиотензин-конвертирующей системы и белки, регулирующие ангиогенез [3]. Более того, в некоторых случаях показано участие в этом процессе трансэкспрессии генов антиапоптоза и даже некоторых нетранскрипционных механизмов. Изменения экспрессии и активности различных ДНКаз апоптоза, транскрипционного фактора р53, а также индуцируемых или репрессируемых им регуляторных белков, которые принимают участие в реализации апоптоза (катепсин, р21, IGF ВР-3, Вах и Всl2), составляют ядерный механизм, который тесно связан с митохондриальным, поскольку осуществляющие его белки (Вах и Всl2), а также продукция активных форм кислорода контролируются фактором р53. Большинство мутаций р53 возникает в позициях, где аминокислоты высококонсервативны [6].

Мутации р53 вызывают эффекты, связанные с изменениями свойств белка, его конформации, клеточной локализации от ядерной к цитоплазматической, а также изменения способности связываться с ДНК. Из известных более чем 30 полиморфизмов гена р53 функциональное значение имеет экзонный — С72G (Arg72Pro) — полиморфизм, изменяющий аминокислотную последовательность белка р53. Данная мутация приводит к снижению эффективности экспрессии гена и как следствие к снижению апоптотического индекса [2]. Трансформированный фенотип образуется в результате либо изменения обоих аллелей, либо точечной мутации в одном из аллелей, которая продуцирует доминантный негативный фенотип. Возрастание экспрессии нормального гена р53 (С-аллельный вариант С72Gр53) ведет к увеличению синтеза белка p53, что в свою очередь индуцирует ген р21, продукт которого является ингибитором клеточного цикла. Белок p21 подавляет комплекс CDK—циклин (циклинзависимые киназы), что приводит к остановке клеточного цикла в стадии G1. При мутациях, приводящих к потере генов белка p53, или при их изменениях блокады клеточного цикла не происходит, так как у мутантных форм теряется способность узнавать и связывать специфические последовательности ДНК регулируемых генов [5].

Основная цель исследования — оценка частоты встречаемости проапоптотических полиморфизмов генов р53(С72G) и р21(С31А) и оценка их прогностического значения в развитии заболевания у резидентов Забайкальского края в этническом аспекте.

В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.).

Методом сплошной выборки в исследование были включены 178 (90 женщин, 88 мужчин) больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) русской национальности, а также 78 (39 женщин и 39 мужчин) больных бурятской национальности, проживающих на территории Забайкальского края. Средний возраст больных составил 53,4 года (от 56 до 64 лет).

В качестве контрольной группы обследовано 190 русских (99 женщин, 91 мужчина) и 80 резидентов бурятской национальности (42 женщины, 38 мужчин) в возрасте от 46 до 60 лет (средний возраст 51 год), не имеющих острых и хронических заболеваний глаз и соматической патологии, приводящей к вторичному поражению органа зрения.

Все больные ПОУГ имели характерные изменения диска зрительного нерва, открытый иридокорнеальный угол и типичные дефекты полей зрения.

Для молекулярно-генетического исследования и получения образцов ДНК использовали буккальный эпителий, для выделения ДНК — набор Минипреп («Силекс») и реактивы Литех (Москва), полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs).

Продукты амплификации анализировали методом электрофореза. Для проведения электрофореза использовали 2% агарозный гель с добавлением бромида этидия.

Полученные данные обработаны статистически с помощью пакетов программ Biostat, Statistica 6,0 («StatSoft Inc.», США), с определением достоверности различий при достигнутом уровне значимости p<0,05. Для сравнения частот и групп по качественному бинарному признаку применяли критерий χ² (Пирсона). Для измерения силы и направления связи между изучаемыми явлениями использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Распределение полиморфизмов гена р53(С72G) имело следующий вид. Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 160 (84,2%) Arg гомозигот, 25 (13,2%) Pro/Arg гетерозигот, 5 (2,6%) Pro гомозигот. Среди 30 обследуемых, у которых выявлены аномальные гены, мужчин было 19 (63,3%), женщин — 11 (36,7%).

В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, распределение генотипов имело следующий вид: 82 (46,1%) Arg гомозиготы, 72 (40,4%) Pro/Arg гетерозиготы, 24 (13,5%) Pro гомозиготы. Частота аллели Pro среди больных ПОУГ составила q=0,32, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов (q=0,08; р<0,01). В то же время аллель Arg оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (q=0,68) по сравнению с контрольной группой (q=0,92; р<0,05) (табл. 1).

Таким образом, 96 (53,9%) больных ПОУГ имели проапоптотический аллельный вариант гена р53, в то время как среди здоровых резидентов данный полиморфизм встречался только у 15,8% (χ², р<0,05). Следовательно, носительство пролиновой аллели в русской этнической группе предрасполагает к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки и развитию ПОУГ.

Значительный процент гетерозиготного состояния проапоптотического варианта р53 в группе больных ПОУГ можно объяснить тем, что мутации в одной из аллелей гена р53 вызывают инактивацию продукта второй, неповрежденной аллели. Коэкспрессирующиеся нормальный и мутантный белок р53 образуют неактивные гетеромерные комплексы, что приводит к подавлению функции нормального белка р53 по доминантно-негативному механизму [5].

Что касается обследуемых бурятской национальности, то распространенность проапоптотической С-аллели (Pro) оказалась выше как среди больных ПОУГ, так и среди здоровых резидентов по сравнению с русской этнической группой (р<0,05). В группе здоровых бурят выявлены 24 (30%) Arg гомозиготы, 40 (50%) Pro/Arg гетерозигот и 16 (20%) Pro гомозигот. В группе больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности гомозиготное носительство Arg выявлено у 16 (20,7%) человек, гетерозиготное Pro/Arg у 22 (28%) человек, гомозиготное носительство Pro обнаружено у 40 (51,3%).

Установлено, что частота Pro-аллели среди больных ПОУГ составила q=0,55, что незначительно выше, чем среди здоровых резидентов (q=0,45; χ², р<0,05), частота Arg-аллели — соответственно q=0,45 и q=0,55 (см. табл. 1).

В группе русских больных ПОУГ корреляционная связь между наличием проапоптотической С-аллели р53(С72G) и заболевания сильно выражена (r=0,85; 0,71), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 6,32.

В группе больных ПОУГ бурятской национальности корреляционная связь между наличием проапоптотической аллели С72G р53 и наличием заболевания значительна (r=0,55; 0,51), чем среди лиц с С-аллельным вариантом, ОШ=1,66 (табл. 2).

Таким образом, наряду с более высокой распространенностью проапоптотической аллели р53 в бурятской этнической группе, пенетрантность С-варианта (Pro) выше у лиц русской национальности.

Среди больных с поражением обоих глаз частота проапоптотической аллели выше как среди бурят, так и среди русских резидентов (р<0,05). Из 85 русских пациентов с поражением обоих глаз 68 (80%) явились носителями проапоптотического полиморфизма р53, из них 20 (23,5%) — в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составила q=0,55, что выше, чем в общей группе больных ПОУГ (q=0,32; р<0,05).

Из 41 пациента бурятской национальности с поражением обоих глаз 33 (80,5%) оказались носителями проапоптотического варианта р53, из них 20 (48,9%) — в гомозиготном состоянии. В то же время частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составляет q=0,56, что незначительно превышает показатель в общей группе больных ПОУГ (q=0,55; p>0,05).

Принимая во внимание более высокую распространенность проапоптотической аллели у больных с двусторонним глаукоматозным процессом, можно предположить, что пролиновый вариант р53 влияет на скорость прогрессирования и тяжесть течения заболевания. Вместе с тем экспрессивность проапоптотического полиморфизма р53 выше в русской этнической группе.

В группе здоровых носителей пролиновой аллели р53 (С-вариант) русской национальности отмечался более низкий уровень внутриглазного давления (ВГД) по сравнению с остальными резидентами. Среди представителей группы контроля с проапоптотическими полиморфизмами р53 средний уровень ВГД составил 16,2±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых — 18,7±0,9 мм (р<0,05). Аналогичная тенденция, наблюдается и у здоровых лиц бурятской национальности. У бурятских резидентов с С-аллельным вариантом средний уровень ВГД составил 16,7±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых индивидуумов — 17,9±0,8 мм (р<0,05).

Известно, что повышение ВГД опосредованно запускает процесс апоптоза ганглиозных клеток сетчатки и приводит к поражению зрительного нерва [6].

Проапоптотическая активность гена р53 варьирует у разных индивидуумов в связи с генетическим полиморфизмом. Из полученных данных видно, что у здоровых резидентов с проапоптотическим полиморфизмом р53 более низкий уровень ВГД, чем у индивидуумов с антиапоптотическим полиморфизмом. Таким образом, можно предположить, что именно низкий уровень ВГД позволял данным индивидуумам избежать развития глаукоматозного процесса, в то время как лица с антиапоптотическим полиморфизмом р53 оставались здоровыми при более высоком уровне ВГД. Следовательно, полиморфизм р53, обусловливая проапоптотическую предрасположенность клетки, детерминирует резистентность ганглиозных клеток сетчатки к воздействию повышенного ВГД и определяет уровень толерантного ВГД.

При анализе полиморфизма р21(С31А) были получены следующие результаты.

Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 144 (75,8%) Ser гомозиготы, 32 (16,8%) Ser/Arg гетерозиготы и 14 (7,4%) Arg гомозигот.

В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, генотипы распределились следующим образом: 123 (69,1%) Ser гомозиготы, 41 (23%) Ser/Arg гетерозигота, 14 (7,9%) Arg гомозигот.

Частота проапоптотической аллели Arg среди больных ПОУГ составила q=0,28, что выше, чем среди здоровых резидентов — q=0,13 (р<0,01), в то же время аллель Ser оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (q=0,72) по сравнению с контрольной группой (q=0,87; р<0,05) (см. табл. 1).

Доля генотипов с проапоптотическим вариантом р21 в бурятской этнической группе в целом незначительно выше, чем среди представителей русской национальности.

Частота аллели Arg среди бурят, страдающих ПОУГ, составила q=0,29, что больше, чем среди здоровых резидентов — q=0,19 (р<0,05). Частоты Ser аллели для лиц с ПОУГ и здоровых людей — соответственно q=0,71 и q=0,81 (р<0,05) (см. табл. 1).

Корреляционная связь между наличием аномальной аллели р21 и глаукомой сильно выражена в русской этнической группе (r=0,8; 0,71), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами.

Риск развития заболевания у носителей аргининовой аллели в бурятской этнической группе в 1,1 раза выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами, ОШ=1,1 (см. табл. 2).

Полученные результаты демонстрируют роль полиморфизма р21(С31А) в развитии ПОУГ в обеих этнических группах. Частота проапоптотической С-аллели (Arg) выше среди больных ПОУГ русской и бурятской национальности, чем среди здоровых резидентов (р<0,01).

В группе больных распространенность С-варианта среди русских и бурят практически одинакова (р>0,05), но, принимая во внимание частоту проапоптотической аллели в этнической группах в целом (р<0,05), а также показатели относительного риска, можно утверждать, что пенетрантность проапоптотического полиморфизма р21 ниже у лиц бурятской национальности.

Из 85 русских пациентов с поражением обоих глаз 43 (50,6%) явились носителями патологического варианта С31А р21, из них 11 (12,9%) — в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз — q=0,36, что выше, чем в общей группе страдающих ПОУГ (q=0,28; р<0,05). В бурятской этнической группе 29,3% пациентов — носители проапоптотического варианта р21, из них 14,6% — в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg-аллели в группе бурят с двусторонним поражением глаз составила q=0,38, что также выше, чем в общей группе больных ПОУГ (q=0,29; р<0,05).

Таким образом, наряду с влиянием полиморфизма р21 на риск развития глаукомы, проапоптотические варианты данного гена также могут определять скорость прогрессирования и тяжесть течения глаукоматозного процесса как у русских больных ПОУГ, так и у бурят, причем на экспрессивность проапоптотических полиморфизмов р21 этнический фактор не оказывает значительного влияния.

1. Распределение частот проапоптотических аллельных вариантов р53(С72G) и р21(С31А) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Частота встречаемости р53(С72G) и р21(С31А) несколько выше среди лиц бурятской национальности как больных ПОУГ, так и здоровых.

2. Больные ПОУГ в обеих этнических группах являются носителями исследуемых проапоптотических полиморфизмов р53, р21 чаще, чем здоровые резиденты. Частота встречаемости неблагоприятных аллельных вариантов выше в группе больных ПОУГ бурятской национальности, что связано с высокой распространенностью проапоптотических аллелей среди бурятского населения в целом. Экспрессивность и пенетрантность проапоптотических полиморфизмов р53 выше среди русского населения.

3. Риск развития ПОУГ выше у носителей проапоптотических аллельных вариантов генов р53, р21 в обеих этнических группах. Относительный риск развития ПОУГ выше у носителей проапоптотических аллельных вариантов р53, р21 среди русских резидентов в сравнении с лицами бурятской национальности. Максимальная вероятность возникновения ПОУГ наблюдается в группе русских носителей проапоптотических полиморфизмов гена р53.

4. Частота встречаемости проапоптотических полиморфизмов р53 и р21 выше в группе больных с поражением обоих глаз русской и бурятской национальности. Наиболее неблагоприятное влияние на прогрессирование глаукоматозного процесса и развитие двустороннего поражения глаз оказывает сочетанный полиморфизм р53 в обеих этнических группах.