АНФ — антинуклеарный фактор

АТА — аутоантитела к топоизомеразе I

АЦА — аутоантитела к центромерам

ДИ — доверительный интервал

ДФ — диффузная форма

ИПЛ — интерстициальное поражение легких

ЛФ — лимитированная форма

ОШ — отношение шансов

ПП — поражение пищевода

ПС — поражение сердца

ССД — системная склеродермия

SNP — однонуклеотидный полиморфизм

STAT — сигнальные трансдукторы (датчики) и активаторы транскрипции

Системная склеродермия (ССД) — одно из наиболее инвалидизирующих аутоиммунных заболеваний, характеризующееся обширным фиброзным процессом, который затрагивает большинство органов и тканей. Этиология ССД до сих пор неясна, однако большинство исследователей считают, что к развитию ССД приводит взаимодействие средовых факторов с индивидуальными генетическими факторами. В настоящее время наши знания о генетических факторах, участвующих в предрасположенности к ССД или ее клиническим фенотипам, резко ограничены. Одним из центральных событий, ответственных за развитие ССД, является нарушение регуляции иммунной системы. Измененный иммунный ответ при ССД характеризуется повышенной активацией Т-клеток и секрецией провоспалительных медиаторов, которые способствуют формированию фиброзных изменений и нарушению функции эндотелия — основных признаков ССД. Из нескольких механизмов, регулирующих активацию и дифференцировку Т-клеток, один является наиболее важным, так как связан со специфической активацией транскрипции гена после стимуляции цитокином. Сигнальные трансдукторы (датчики) и активаторы транскрипции (STAT) представляют собой семейство транскрипционных факторов, которые играют фундаментальную роль в стимулировании дифференциации и сигнальной функции Т-клеток. Среди 6 описанных белков STAT, STAT-4 приобрел наибольший интерес. Белок STAT-4 участвует в дифференцировке клеточных популяциях Т-клеток Th1 и недавно описанных Th17, которые вовлечены в патогенез ССД [1].

Ряд ассоциативных и полногеномных исследований убедительно подтвердили роль гена STAT4 как фактора предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, воспалительное заболевание кишечника и сахарный диабет 1-го типа [2—7].

Ген STAT4 кодирует белок STAT-4, который передает цитокиновые сигналы от интерлейкинов-12, 23 и интерферона-1 в Т-клетки и моноциты [8]. Полиморфизм rs7574865 гена STAT4 представляет собой однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism — SNP), связанный с заменой гуанина тимином (G/T), функциональное значение которого остается неясным. В 3-м интроне гена STAT4 обнаружено несколько SNPs находящихся в неравновесном сцеплении c rs7574865, для которых подтверждено участие в регуляторных эффектах [9]. ССД представляет собой комплексное генетическое заболевание. Клинически она характеризуется ранней генерализованной ангиопатией, нарушениями иммунной системы и массивным отложением внеклеточного матрикса в соединительной ткани кожи и многих внутренних органов. На основании площади вовлеченной кожи заболевание классифицируется как локальная форма (ЛФ) и диффузная форма (ДФ) ССД. Последний клинический фенотип характеризуется более быстрым прогрессированием фиброза кожи и висцеральных органов и неблагоприятным прогнозом [10]. Заболевание характеризуется также образованием специфических антител к топоизомеразе I (АТА), аутоантител к центромерам (АЦА) и аутоантител к РНК-полимеразе III [11, 12]. Следует отметить, что клинические и серологические характеристики ССД различаются в разных этнических популяциях. У пациентов коренной американской этнической группы индейцев племени Choctaw, афроамериканцев и китайцев чаще, чем у пациентов европейского происхождения, развивается ДФ ССД [13—15]. Кроме того, у пациентов перечисленных этнических групп и тайцев, корейцев и китайцев чаще встречаются АТА [13—15].

Хотя патогенез заболевания до сих пор неясен, установлено, что генетические факторы играют важную роль в развитии предрасположенности к ССД. Исследования показали участие генов, локализованных в области HLA. Последние полногеномные исследования (GWAS), проведенные в европейских и американских популяциях [16], показали существование множества не-HLA генетических локусов и генетических полиморфизмов, ассоциированных с ССД. Выявлено резкое снижение сигналов внутри гена STAT4 у больных ССД. Этот ген является транскрипционным фактором, передает сигнал и активирует транскрипцию внутри функционирующих Т-клеток в ответ на стимуляцию цитокинами и факторами роста [17]. В российской популяции больных ССД роль полиморфизмов гена STAT4 в предрасположенности к развитию ССД и ассоциации с клиническими и аутоиммунными фенотипами не изучена.

Цель настоящего исследования — изучение ассоциации полиморфизма rs7574865 гена STAT4 c риском развития интерстициального поражения легких (ИПЛ), других висцеральных органов и специфических аутоиммунных фенотипов ССД среди российских больных.

Обследовали 203 индивидуумов, проходивших лечение в клинике Института ревматологии им. В.А. Насоновой в период с 2011 по 2014 г., из которых у 102 имелся диагноз ССД. Средний возраст обследованных 49,8±12,4 года, средняя длительность заболевания 11,2±9,3 года. Контрольная группа представлена 103 здоровыми не родственными лицами, проживающими в московском регионе сопоставимыми по полу и возрасту. Все пациенты согласно клиническому диагнозу отвечали критериям Американской коллегии ревматологии классификации ССД 1980 г. [18]. Группа больных представлена в основном пациентами с легочным фиброзом (79%), а также пациентами, имеющими типичную развернутую картину болезни.

На основании медицинской документации (диагноз при выписке) все пациенты классифицированы по клиническому фенотипу — ЛФ и ДФ, по наличию ИПЛ, поражения сердца (ПС) и поражения пищевода (ПП). Диагноз ИПЛ установлен 77% пациентов на основании характерной картины по данным мультиспиральной компьютерной томографии грудной клетки. ПС устанавливали на основании клинических данных, а также результатов электро- и эхокардиографии; при показаниях выполняли холтеровское мониторирование электрокардиограммы. ПП диагностировали на основании клинических данных и результатов эндоскопии желудочно-кишечного такта.

Аутоиммунные фенотипы констатировали у пациентов, в сыворотке которых выявлены антинуклеарные факторы (АНФ) — АТА или АЦА.

АНФ и АЦА определяли методом непрямой иммунофлюоресценции на HEp-2 клетках (НПИФ-HEp-2) с помощью набора реагентов IMMCO Diagnostics (США), АТА — методом иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов Orgentec. Положительные результаты исследования АНФ и АЦА составляли ≤1/160 ед/мл, АТА >25,0 ед/мл.

Иммунологические исследования выполнены в лаборатории иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФБГНУ НИИР им. В.А. Насоновой.

Исследование одобрено этическим комитетом НИИР им. В.А. Насоновой и письменное информированное согласие получено от всех пациентов.

Генотипирование. У всех участников взяты образцы венозной крови. ДНК выделена из свежих или замороженных образцов крови солевым методом. Полиморфизм rs7574865 гена STAT4 изучен с использование аллельспецифической полимеразной реакции в реальном времени. Меченные праймеры и зонды, условия амплификации синтезированы и разработаны в ЗАО «СИНТОЛ» (Москва). Исследование проведено с использованием амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Москва).

Различия в распределении частот генотипов между больными и контролем оценены с применением таблиц сопряжения 2×2 и точного критерия Фишера. В качестве референсного использовали наиболее частый генотип GG. Клинические фенотипы представлены как дихотомические вариабельности. Возраст и длительность заболевания представлены как среднее ± стандартное отклонение (М±δ). Дисперсионный анализ связи между дихотомическими вариабельностями и изученным полиморфизмом гена STAT4 проведен с помощью АNOVA. Различия при р<0,05 считали статистически значимыми. При малых значениях вариабельностей использован двусторонний точный критерий Фишера. Все анализируемые данные обработаны с применением пакета программ Statistica 6.0 («StatSoft Inc.», Tulsa, США).

Демографические, клинические и серологические фенотипы исследованных больных представлены в табл. 1.

Распределение частот генотипов и аллелей гена STAT4 в группе больных и контроле представлено в табл. 2. Распределение частот генотипов в группах контроля и пациентов находилось в согласии с законом Харди—Вайнберга, при использовании критерия χ². Частоты генотипов GT и GT+TT также статистически значимо выше у пациентов по сравнению с соответствующими частотами в контроле (47,1 и 33%; р=0,040; ОШ 1,80 при 95% ДИ 1,0 до 3,3) и (51 и 36,9%; р=0,042; ОШ 1,78 при 95% ДИ от 1,0 до 3,2) соответственно. Анализ распределения частот аллелей показал повышенную частоту аллеля Т у пациентов по сравнению с контрольной группой (27,5 и 20,4%), однако различия не достигали статистической значимости (р=0,094). Дисперсионный анализ распределения частот генотипов полиморфизма rs7574865 гена STAT4 в зависимости от клинического и иммунологического фенотипа выявил различия между пациентами с ИПЛ, ПС и серопозитивностью по АТА.

Ассоциация полиморфизма rs7574865 в зависимости от кожного подтипа ССД представлена в табл. 3. Распределение частот генотипов и аллелей у больных с ЛФ не выявило статистически значимых различий при сравнении с контролем. При анализе больных с ДФ выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов GT и GT + TT по сравнению с контролем. Полученные данные указывают на более чем двукратный риск развития ДФ у носителей генотипа GT и аллеля Т (генотипы GT и TT) по сравнению с контролем (ОШ 2,12 и 2,31 соответственно).

Ассоциация полиморфизма rs7574865 гена STAT4 с ИПЛ у больных представлена в табл. 4. Анализ показал, что распределение частот генотипов в группе пациентов с ИПЛ статистически значимо отличалось от распределения в контроле (χ²=9,28; р=0,010). Установлены статистически значимые более высокие частоты генотипов GT и объединенного генотипа GT+TT у пациентов с ИПЛ по сравнению с контрольной группой (р=0,0037; р=0,0024 соответственно). У больных также статистически значимо повышена частота аллеля Т (р=0,010). Представленные данные указывают на более чем двукратный риск развития ИПЛ у пациентов с ССД, которые являются носителями генотипа GT и аллеля Т (генотипы GT и TT) по сравнению с контролем.

Распределение частот генотипов полиморфизма rs7574865 гена STAT4 в зависимости от ПС в группе больных отражено в табл. 5. Анализ распределения частот генотипов в группе пациентов с ПС показал статистически значимые различия с соответствующим распределением в контроле (χ²=9,81; р=0,007). Анализ распределения частот генотипов и аллелей rs7574865 полиморфизма гена STAT4 показал статистически значимо более высокую частоту генотипа GT и объединенного генотипа GT и TT у больных с ПС по сравнению с контрольной группой (63,6 и 33%; р=0,0018 и 67,7% и 36,9%; р=0,0027 соответственно). Риск развития ПС у носителей генотипа GT или генотипа GT+TT более чем в 3 раза выше, чем у индивидуумов с соответствующими частотами в контрольной группе (ОШ 3,55 при 95% ДИ от 1,5 до 8,8 и ОШ 3,42 при 95% ДИ от 1,4 до 8,7 соответственно).

Серопозивность по АТА у пациентов имела статистически значимую связь с полиморфизмом rs7574865 гена STAT4 (табл. 6). Число носителей генотипа GT и генотипа GT+TT среди больных, серопозитивных по АТА, больше, чем в контроле (52,9 и 33%; р=0,017 и 58,8 и 36,9%; р=0,010 соответственно). У больных — носителей генотипов GT и GT+TT и аллеля Т риск развития серопозитивности по АТА более чем в 2 раза выше, чем в контроле (ОШ 2,28 при 95% ДИ от 1,1 до 4,8; ОШ 2,44 при 95% ДИ от 1,2 до 5,1 и ОШ 1,72 при 95% ДИ 1,0 до 3,0 соответственно). Не выявлено статистически значимой ассоциации полиморфизма rs7574865 гена STAT4 с ЛФ, ПП, серопозитивностью по АНФ и АЦА.

Генетические исследования при ССД, проведенные в разных этнических популяциях, показали существование некоторых клинических и серологических различий, которые могут быть связаны со специфическими генетическими факторами. Установлена генетическая ассоциация гена STAT4 с предрасположенностью к ССД в североамериканской, испанской, европейской [19] и японской популяциях [20]. Обнаружено, что в европейской и японской популяциях полиморфизм rs7574865 гена STAT4 находится в ассоциации с ЛФ и/или серопозитивностью по АЦА [19, 20]. В то же время в китайской популяции показана сильная ассоциация генетических вариантов rs7574865, rs10168266 и rs3821236 гена STAT4 с ДФ, серопозитивностью по АТА и фиброзом легких [21]. В нашем исследовании мы также смогли выявить статистически значимую ассоциацию аллеля Т полиморфизма rs7574865 гена STAT4 с предрасположенностью к ССД и ряду клинических и серологических фенотипов в российской популяции. Необходимо отметить, что наблюдаемая частота аллеля Т в нашей контрольной группе 20,4% хорошо сопоставима с частотами, ранее изученными в других этнических популяциях, включая белых североамериканцев, испанцев, европейцев и японцев. Наши данные отличаются от результатов, полученных в исследованиях среди европейцев и японцев. В этих популяционных группах описана ассоциация полиморфизма rs7574865 с ЛФ и/или с серопозитивностью по АЦА [19, 20]. Вместе с тем они сопоставимы с данными, полученными в китайской популяции [21], где авторы показали связь изученного полиморфизма гена STAT4 с клиническими фенотипами ДФ, ИПЛ и повышенными уровнями АТА. При этом среди российских больных ССД нами впервые установлена статистически значимая ассоциация полиморфизма rs7574865 гена STAT4 с предрасположенностью к ИПЛ и риску возникновения заболеваний сердца. Стойкие и сильные ассоциации между полиморфизмами STAT4 и ССД во многих независимых и различных этнических популяциях подтвердили важную роль этого гена в патогенезе данного заболевания. Известно, что ген STAT4 является транскрипционным фактором, который передает сигналы от интерферона-1, интерлейкинов-2, 12 и 23 в Т-клетки и моноциты при регуляции врожденного и приобретенного иммунитета [22].

В настоящее время функциональная роль изученного полиморфизма и 2 других, расположенных в 3-м интроне гена STAT4, не установлена. Следует отметить, что у мышей, дефицитных по гену STAT4, проявляются сниженные уровни воспалительных цитокинов благодаря контролю Т-клеточной активации и пролиферации и проявляется протективное действие против фиброза, вызванного блеомицином [23]. Эти данные подтверждают важную роль гена STAT4 в патогенезе склеродермии. Кроме того, у пациентов — носителей аллеля Т, чаще обнаруживались АТА и Д.Ф. Наши данные не согласуются с данными, описанными ранее в статье B. Rueda и соавт. [19]. Эти авторы показали ассоциацию генотипа TT полиморфизма rs7574865 у больных с ЛФ в испанской и датской когортах. Среди японских пациентов с ССД показана ассоциация этого генотипа с серопозитивностью по АЦА [20]. Причины полученных различий до сих неясны. Одним из возможных объяснений могут быть различия в соотношении клинических кожных форм ССД в разных этнических когортах. Например, в изученных испанской и датской когортах число пациентов с ДФ составляло 27 и 30% соответственно, поэтому у большинства оставшихся больных имелась ЛФ (у 73 и 70% соответственно) [19]. В японской когорте больных ССД [20] найдены равные соотношения АТА и АЦА среди серопозитивных пациентов (31 и 31%). В китайской когорте пациентов с ССД число пациентов с ДФ достигало 56%, а число серопозитивных по АТА пациентов составляло 48% [20]. Наши данные совпадают с китайскими — число пациентов с ДФ составляло 51%, и доля серопозитивных по АТА пациентов также была высокой (51%). Кроме того, в китайском исследовании число пациентов с ЛФ составляло 44%, а серопозитивных по АЦА — 13%, что сопоставимо с нашими данными (52 и 15% соответственно).

Таким образом, разные количества клинических фенотипов ССД могут влиять на статистическую силу изучаемых показателей. Исходя из этого, необходимо верифицировать полученные результаты, связанные с полиморфизмом rs7574865 и другими полиморфизмами гена STAT4, на более крупных выборках клинических и серологических фенотипов ССД.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.