апо (а) - апобелок (а)

АТ - антитела

аутоАТ - аутоантитела

ДИ - доверительный интервал

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

КА - коронарные артерии

КГ - коронарография

ЛНП - липопротеиды низкой плотности,

Лп (а) - липопротеид (а)

окЛНП - окисленный ЛНП

ОХС - общий холестерин

ОШ - отношение шансов

ТГ - триглицериды

Тh17 - Т-хелперы 17-го типа

sCD25 - растворимая форма рецептора CD25

Th1 - Т-хелперы 1-го типа

Хронический воспалительный процесс, развивающийся в стенке артерий на фоне нарушения липидного обмена и повреждения эндотелия, является одной из основных составляющих атеросклеротического процесса. Воспаление сопровождается накоплением лейкоцитов в интиме и продукцией широкого спектра цитокинов и других биологически активных веществ, способствующих ремоделированию стенки сосуда и формированию атеросклеротического поражения.

В атеросклеротических бляшках человека локализованы макрофаги и Т-лимфоциты, среди которых преобладают Т-хелперные клетки 1-го типа (Th1), играющие предположительно проатерогенную роль [1, 2]. Полагают, что Т-лимфоциты «узнают» аутоантигены, представленные макрофагами и дендритными клетками, и продуцируют цитокины, вызывающие активацию макрофагов, лимфоцитов и гладких мышечных клеток, которые в свою очередь способствуют дальнейшему привлечению лейкоцитов в стенку сосуда [3]. Проатерогенным действием согласно ряду экспериментальных работ [4] обладают также Т-хелперы 17-го типа (Th17) - недавно открытая субпопуляция лимфоцитов CD4+, продуцирующая интерлейкин (ИЛ) 17. Th17 принимают участие в иммунной реакции против собственных и чужеродных антигенов путем привлечения в очаг воспаления клеток миелоидного ряда, активации лимфоцитов и секреции провоспалительных цитокинов [5]. По данным немногочисленных клинических исследований, активация Th17 или повышение количества этих клеток в кровотоке может быть связано с прогрессированием атеросклероза и возникновением осложнений ишемической болезни сердца (ИБС) [6].

В качестве потенциальных аутоантигенов в атерогенезе чаще всего упоминаются модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), например окисленные или альдегидмодифицированные ЛНП, а также липопротеиды, содержащие окисленные фосфолипиды (окЛНП) [7-9]. Повышенный уровень в крови аутоантител (аутоАТ) к окЛНП ассоциирован с ангиографически верифицированным коронарным атеросклерозом [10] и повышенным риском прогрессирования атеросклероза сонных артерий[11].

Липопротеид (а) [Лп (а)] представляет собой сложный надмолекулярный комплекс, в котором апобелок В100 ЛНП-подобной частицы соединен дисульфидной связью с молекулой апобелка (а) [апо (а)], гомологичного молекуле плазминогена. В отличие от других липопротеидов уровень Лп (а) в крови контролируется генетически, варьирует в очень широком диапазоне и устойчив к медикаментозной терапии. Доказано, что повышенная концентрация Лп (а) в плазме является независимым фактором риска возникновения и развития атеросклеротических поражений различной локализации [12, 13]. Концентрация Лп (а) более 30 мг/дл отмечена у 38-42% индивидуумов с высоким риском развития ИБС (по шкале National Cholesterol Education Program) и только у 14% пациентов без такого риска [14, 15].

Накопление Лп (а) в атеросклеротических бляшках коронарных артерий (КА) и сонных артерий, начиная с момента образования липидных полос [16, 17], позволяет предположить выраженное «проатерогенное» действие данного липопротеида. Обнаруженная в нашей предыдущей работе связь аутоАТ к Лп (а) с наличием и степенью тяжести коронарного атеросклероза может свидетельствовать об участии Лп (а) в атерогенезе на уровне гуморального и клеточного иммунитета [18].

Цель настоящей работы состояла в изучении роли Лп (а) как потенциального аутоантигена, вызывающего активацию иммунокомпетентных клеток при атеросклерозе.

В одномоментное ретроспективное исследование включили 104 мужчин с различной степенью атеросклероза КА, верифицированного ангиографически. В исследование не включали пациентов с острым коронарным синдромом и перенесенным в течение последних 6 мес инфарктом миокарда, мозговым инсультом, операцией коронарного шунтирования или транслюминальной баллонной ангиопластики КА, острыми или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, хронической почечной или печеночной недостаточностью, сахарным диабетом.

Уровень общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ) в плазме крови измеряли с использованием реагентов Biocon (Германия) ферментативным колориметрическим методом. Концентрацию Лп (а) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноспецифических поликлональных антител (АТ) барана против Лп (а) человека, как описано ранее [19]. Уровень специфических аутоАТ к Лп (а) оценивали методом твердофазного ИФА по методике, описанной ранее [18]. В качестве проявляющих АТ использовали иммуноглобулины козы к иммуноглобулинам G или M человека, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности по методике Boyum [20]. Клетки концентрации 5 млн/мл ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки человека. Для активации клеток в культуру вносили 25 нг/мл форболмиристатацетата, 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы Sigma, США). Клетки инкубировали 5 ч при температуре 37 °C и 5% СО₂.

Иммунофенотипирование клеток осуществляли методом цитофлуориметрии в потоке, для выявления поверхностных антигенов использовали флюоресцентно меченные моноклональные АТ CD4-FITC, CD4-PC5,CD25-PC5, CD127-PE (Becton Dickinson Immunocytometry Systems - BDIS - фирм «Becton Dickinson&Co» и «eBioscience», США). Для идентификации внутриклеточных белков использовали наборы для фиксации и пермеабилизации клеток и флюоресцентно меченные АТ (интерлейкин - ИЛ-17-РЕ, ИЛ-10-PEи ИНФγ-FITC (все реактивы фирмы «eBioscience», США). Окрашивание клеток АТ к цитокинам проводили после активации в культуре. Лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов, фиксацию и пермеабилизацию клеток осуществляли в соответствии с протоколами производителей. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлуориметрии в потоке (FACSСalibur, BDIS). Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния. Т_рег типировали как Т-лимфоциты СD4⁺CD25highCD127low, активированные Т-хелперы [Т_акт] - как CD4⁺CD25low [21], Th1 и Th17 - как CD4⁺ИНФ-γ⁺ и Т-лимфоциты CD4⁺ИЛ-17⁺ соответственно, Т-клетки, продуцирующие ИЛ-10, - как Т-лимфоциты CD4⁺ИЛ-10⁺.

Концентрацию sCD25 в сыворотке крови определяли хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC, «Siemens», Германия). Концентрацию С-реактивного белка измеряли высокочувствительным методом на нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия - США).

Статистический анализ данных выполняли с помощью пакетов статистических программ Statistica 8.0 и MedCalc 12.5.0. Нормальный характер распределений доказывали с помощью критерия Шапиро-Уилка, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. При несоответствии распределения данных нормальному закону для их описания использовали медиану и межквартильный интервал. Для множественного межгруппового сравнения в случае нормально распределенных данных использовали критерий t Стьюдента, в случае несоответствия нормальному закону - тест медиан и критерий Крускала-Уоллиса. Для попарных межгрупповых сравнений в случае нормально распределенных данных использовали критерий t Стьюдента, в случае несоответствия нормальному закону - критерий U Манна-Уитни. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков применяли критерий χ². Для анализа взаимосвязи Лп (а) и субпопуляционного состава Т-лимфоцитов с коронарным атеросклерозом рассчитывали отношение шансов (ОШ) при сравнении подгрупп с показателями меньше и равном и более медианы для каждого параметра в исследованной когорте в целом. Анализ проводили в группе с прогрессирующим и тяжелым атеросклерозом (объединенная 3-я и 4-я группа) по сравнению с пациентами с малоизмененными КА (1-я группа). Корреляционный анализ по Спирмену и Пирсону, а также множественный регрессионный анализ использовали для изучения связи между показателями. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

По данным коронарографии (КГ) сформировали 4 группы пациентов: 1-я - 20 больных с малоизмененными и/или без клинически значимого поражения (менее 50% просвета сосуда) КА, 2-я - 33 пациента без прогрессирования атеросклероза в течение 23,8±8,4 мес наблюдения, 3-я - 19 пациентов с прогрессированием коронарного атеросклероза в течение 22,4±8,7 мес наблюдения, 4-я - 31 пациент с трехсосудистым поражением коронарного русла. Во 2-ю и 3-ю группы включали больных, перенесших коронарное стентирование за 2 года до включения в исследование. Под прогрессированием коронарного атеросклероза понимали появление новых стенотических поражений КА, суживающих на 50% и более просвет сосуда, либо увеличение выраженности ранее отмеченного стеноза на 30% и более, в артериях, ранее не подвергавшихся вмешательству. Группы статистически значимо не различались по основным клиническим и лабораторным характеристикам (табл. 1). В 1-й группе в отличие от остальных отсутствовали случаи ИМ. В 4-й группе по сравнению с 1-й было статистически значимо больше курильщиков.

В обследованной группе больных концентрация Лп (а) в крови связана с тяжестью поражения КА по данных однофакторного анализа (r=0,24; р=0,019). Кроме того, по данным многофакторного корреляционного анализа, концентрация Лп (а) является предиктором тяжести поражений КА (β=0,28; p<0,005) независимо от возраста, уровней ОХС и ТГ, концентрации глюкозы, содержания Th17, маркера активации лимфоцитов sCD25, субпопуляций Т-лимфоцитов и других исследуемых показателей.

Уровень Лп (а) в плазме крови в группе больных с многососудистым поражением оказался достоверно выше, чем в группе пациентов с малоизмененными КА (38,3±44,8 и 12,3±13,4 мг/дл соответственно) (рис. 1).

Не обнаружено статистически значимых различий по показателям клеточного иммунитета, а также по распределению субпопуляций лимфоцитов, за исключением уменьшения относительного содержания Т_рег (в процентах от количества Т-лимфоцитов CD4⁺) в группах с более тяжелым поражением КА (табл. 2). Мы также наблюдали тенденцию к увеличению концентрации sCD25 (растворимой формы рецептора ИЛ-2), свидетельствующей об активации лимфоцитов.

Уровень Лп (а) не связан ни с одним из исследуемых биохимических и клеточных показателей, за исключением концентрации ОХС (r=0,214; p<0,05), что объясняется включением Х.С. Лп (а) в уровень ОХС. Кроме того, на данной выборке больных мы не обнаружили взаимосвязи Лп (а) и титра аутоАТ как к Лп (а), так и к ЛНП и их окисленным производным.

Для анализа взаимного влияния Лп (а) и показателей клеточного иммунитета как возможных независимых факторов риска развития атеросклероза проанализированы подгруппы больных, разделенных относительно медианы изучаемых показателей клеточного иммунитета и Лп (а), а также их сочетания. Показано, что у больных с концентрацией Лп (а) более 11,8 мг/дл (отношение шансов - ОШ 2,76 при 95% доверительном интервале - ДИ от 0,92 до 8,31) и абсолютной концентрацией в крови Th17 ≥11,4 тыс/мл (ОШ 2,67 при 95% ДИ от 0,84 до 8,46) наблюдается риск прогрессирующего и множественного поражения КА по сравнению с больными, у которых концентрация показателей ниже медианы. Напротив, относительное содержание (в процентах от Т-лимфоцитов CD4+) Т_рег ≥4,3%, Th1 ≥20% и Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-10, ≥3,6% демонстрировало тенденцию к двукратному предотвращению развития тяжелого и прогрессирующего атеросклероза КА в обследованной группе больных (табл. 3).

Сочетание повышенной концентрации Лп (а) и повышенного содержания в крови Th17 увеличивало риск развития тяжелого и прогрессирующего атеросклероза многократно (ОШ 10,0 при 95% ДИ от 1,03 до 97,05; p<0,05) (табл. 4). Наличие концентрации Лп (а) более 11,8 мг/дл на фоне сниженных показателей Т_рег и Т-лимфоцитов CD4⁺, продуцирующих ИЛ-10, также достоверно увеличивало вероятность множественного и прогрессирующего атеросклеротического поражения КА (см. табл. 4).

Таким образом, в нашей работе впервые показано, что повышенная концентрация Лп (а) на фоне сдвигов в содержании про- и противовоспалительных субпопуляций Т-лимфоцитов значительно потенцирует риск быстро прогрессирующего и множественного поражения КА.

Титр аутоАТ к Лп (а), относящихся к классу IgM, у пациентов с малоизмененными КА оказался незначительно выше, чем у пациентов с различной степенью поражения сосудистого русла (0,095±0,024 и 0,085±0,018 опт. ед. соответственно; p<0,05), хотя межгрупповые различия не достигали статистической значимости. Для аутоАТ класса IgM к ЛНП и окЛНП статистически значимых различий не обнаруживалось. Уровень аутоАТ класса IgG как к Лп (а), так и к ЛНП и их окисленным производным демонстрировал тенденцию к последовательному увеличению по мере нарастания тяжести поражения КА, что согласовалось с ранее полученными результатами [18], и в группе больных с трехсосудистым поражением был достоверно выше, чем у больных без прогрессирования атеросклероза (см. табл. 2).

Абсолютное содержание Th1 коррелировало с уровнями аутоАТ класса IgG, специфичных ко всем исследованным в нашей работе атерогенным липопротеидам: Лп (а) (r=0,213; p<0,05), окЛп (а) (r=0,337; p<0,001), ЛНП (r=0,233; p<0,05) и окЛНП (r=0,262; p<0,05), что подтверждало участие Лп (а) в гуморальном и клеточном адаптивном ответе, в регуляцию которого вовлечены Th1. Такая взаимосвязь может объясняться способностью Th1 активировать продукцию IgG, относящихся ко 2-му подклассу (IgG₂), В-клетками [22].

У пациентов с уровнем аутоАТ класса IgG к окЛНП, превышающим медиану, выявлялась тенденция к более частому тяжелому поражению коронарного русла (ОШ 1,57 при 96% ДИ от 0,55 до 4,49), тогда как при сочетанном повышении уровня аутоАт к окЛНП на фоне увеличенной концентрации Лп (а) больные с множественным и прогрессирующим поражением КА встречались в исследованной нами когорте в 4,7 раза чаще (ОШ 4,66 при 95% ДИ от 0,94 до 23,09).

Следует отметить статистически значимую обратную связь между концентрацией sCD25 и уровнем аутоАТ к Лп (а) и ЛНП. sCD25 - растворимая («отщепленная» с поверхности клетки) форма рецептора ИЛ-2. Основным источником sCD25 являются активированные лимфоциты [23], и уровень sCD25 значительно повышается при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях [24]. Наиболее выраженной такая корреляция является для аутоАТ класса IgM, специфичных к Лп (а) (r=–0,36; p<0,005), менее выраженной - для ЛНПи окЛНП (r=–0,21 и r=–0,24; p<0,05 соответственно; рис. 2).

У пациентов с уровнем IgМ к Лп (а), равным медиане или превышающем ее (0,085 опт. ед.), тяжелое и прогрессирующее поражение КА встречалось в 3 раза реже, чем у пациентов, имеющих сниженный уровень аутоАТ (ОШ 0,33 при 95% ДИ от 0,10 до 1,06). При сочетанном повышении концентрации Лп (а) более 11,8 мг/дл и сниженном уровне IgM частота многососудистого и прогрессирующего атеросклероза увеличивалась семикратно (ОШ 6,90 при 95% ДИ от 1,26 до 38,44; p<0,05). Подобные, но менее выраженные и статистически незначимые закономерности наблюдались и для аутоАТ к ЛНП, как нативным, так и окисленным медью.

Полученные нами результаты относительно аутоАТ согласуются с результатами недавнего исследования, демонстрирующими, что аутоАТ к окЛНП класса IgM и вырабатываемые клетками В₁, могут оказывать кардиопротективное действие, в то время как вырабатываемые клетками В₂ IgG и образуемые ими иммунные комплексы являются проатерогенными [25, 26].

Полагают, что аутоАТ к модифицированным ЛНП, принадлежащие к классу IgM, могут относиться к так называемым естественным аутоАТ, которые являются частью защитного врожденного иммунного ответа. Согласно результатам, полученным в экспериментах с использованием животных моделей, аутоАТ к модифицированным ЛНПи окЛНП, принадлежащие к классу IgM, могут предотвращать развитие атеросклероза, в частности за счет ингибирования захвата окЛНП макрофагами. Причем защитный потенциал таких АТ в значительной степени зависит от их способности распознавать специфические окисленные эпитопы как на ЛНП, так и на апоптотических клетках. Напротив, аутоАТ к окЛНП класса IgG могут активировать макрофаги, взаимодействуя с их рецептором Fcγ, тем самым ускоряя развитие атеросклероза [27].

В результате нашей работы впервые показано, что даже незначительно повышенная концентрация Лп (а) более 11,8 мг/дл на фоне сдвигов в содержании субпопуляций Т-лимфоцитов значительно потенцирует риск быстро прогрессирующего и множественного поражения КА у обследованных больных. Связь титра аутоАТ к Лп (а) класса IgМ с маркером активации лимфоцитов и аутоАТ класса IgG с Th1, по нашему мнению, демонстрируют участие именно Лп (а) в процессах аутоиммунного воспаления при атеросклерозе.

Конфликт интересов отсутствует.