АГ — артериальная гипертония

АД — артериальное давление

МИ — нефрит с минимальными изменениями

МКГН — мезангиокапиллярный нефрит

МН — мембранозная нефропатия

МПГН — мезангиопролиферативный нефрит

ПУ — протеинурия

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ТИФ — тубулоинтерстициальный фиброз

ФСГС — фокальный сегментарный гломерулосклероз

ХБП — хроническая болезнь почек

ХГН — хронический гломерулонефрит

ANGPT2 — ангиопоэтин 2-го типа

COL4 — коллаген IV типа

HIF — фактор, индуцируемый гипоксией

NGAL — липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов

TGF-β — трансформирующий β-фактор роста

THBS1 — тромбоспондин 1-го типа

VEGF-A — фактор роста сосудистого эндотелия A типа

Одной из центральных задач нефрологии является разработка методов стратегии нефропротекции[1, 2]. Для ее совершенствования большое значение имеют исследование механизмов прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) и определение комплекса связанных с ними биомаркеров, позволяющих мониторировать течение заболевания, оценивать эффективность существующих методов нефропротекции и разрабатывать новые подходы в том числе путем создания препаратов целенаправленного действия [3].

По-прежнему большое внимание уделяют гемодинамическим факторам прогрессирования ХБП, играющим важную роль не только при сосудистых нефропатиях, но и при хроническом гломерулонефрите (ХГН). В начале 90-х годов прошлого века L. Fine [4] выдвинул гипотезу о ведущей роли хронической ишемии почек в развитии тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ), тяжесть которого коррелирует с прогнозом более тесно, чем патология клубочков. Среди основных причин хронического гипоксического повреждения почечного тубулоинтерстиция при ХГН обсуждаются структурные изменения микрососудистого русла почек — облитерация перитубулярных капилляров [5, 6]. Механизмы ее развития на поздних стадиях ХГН до конца неясны; в качестве одного из них предполагают дефицит молекулярных медиаторов, отвечающих за регуляцию ангиогенеза, или дисбаланс между про- и антиангиогенными факторами [7—9].

В настоящее время проведение исследований, посвященных роли хронической ишемии в прогрессировании ХГН, ограничивается прежде всего трудностью ее оценки в клинических условиях. Доступные инструментальные методы позволяют выявлять изменения почечного кровотока в сосудах крупного и среднего калибра при сосудистых нефропатиях, однако эти методы недостаточно информативны в оценке выраженности расстройств почечной микроциркуляции при ХГН.

Состояние микрососудистого русла почки у больных ХГН наиболее предметно характеризует исследование почечной ткани, полученной путем пункционной биопсии, с оценкой плотности капиллярной сети и экспрессии факторов, регулирующих ангиогенез. Однако инвазивный характер процедуры ограничивает возможность повторных исследований.

Альтернативой изучению биоптата почки является определение величины экскреции с мочой молекулярных медиаторов повреждения/воспаления, отражающей их экспрессию в почечной ткани. К настоящему времени накоплен большой опыт, свидетельствующий о значении «мочевых тестов» как перспективного направления в изучении механизмов прогрессирования ХГН и информативного метода мониторинга результатов лечения [3, 10—12].

Цель данного исследования состояла в изучении у больных ХГН мочевой экскреции молекулярных факторов, регулирующих ангиогенез, — фактора роста сосудистого эндотелия A типа (VEGF-A), тромбоспондина 1-го типа (THBS1), ангиопоэтина 2-го типа (ANGPT2) по сравнению с мочевыми маркерами повреждения и фиброгенеза почек — липокалином, ассоциированным с желатиназой нейтрофилов (NGAL), коллагеном IV типа (COL4) и известными клиническими факторами риска ускоренного прогрессирования заболевания для оценки ее прогностического значения.

В исследование включили 82 больных с клиническим диагнозом ХГН, проходивших обследование и лечение в отделении нефрологии Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева 3-й Университетской клинической больницы Первого МГМУ им. И.М. Сеченова в 2014 г.

Критерии отказа от включения: возраст моложе 18 и старше 70 лет, острое повреждение почек, обострение инфекции мочевых путей на момент обследования, сахарный диабет, системные заболевания соединительной ткани, системные васкулиты, антифосфолипидный синдром, злокачественные новообразования, терапия, замещающая функцию почек.

Клиническое обследование проводили по традиционному для нефрологического стационара плану — оценивали активность/тяжесть поражения почек, выраженность гемодинамических и метаболических нарушений и других факторов риска прогрессирования ХБП и развития сердечно-сосудистых осложнений. Функцию почек определяли по скорости клубочковой фильтрации (СКФ), рассчитанной по формуле CKD-EPI [1].

На момент обследования возраст больных ХГН составил 36,5 (28,0; 55,0) года, мужчин 45%, женщин 55%. Артериальная гипертония (АГ) выявлена у 57 (69,5%) пациентов; тяжелая АГ — артериальное давление (АД) ≥160/100 мм рт.ст. без терапии или сохраняющееся АД ≥140/90 мм рт.ст., несмотря на адекватную антигипертензивную терапию, — у 26 (31,7%). Признаки клинической активности нефрита (протеинурия — ПУ более 0,5 г/сут и/или гематурия более 10 эритроцитов в поле зрения) наблюдались у 80,5% больных; у 26 (31,7%) имелся нефротический синдром (у 9 изолированный, у 17 в сочетании с АГ). Распределение по стадиям ХБП было следующим: ХБП I — 36,6%, ХБП II — 31,7%, ХБП IIIа — 15,9%, ХБП IIIб — 8,5%, ХБП IV — 4,9%, ХБП V — 2,4%.

С высокой частотой наблюдалась гиперлипидемия: повышение уровня холестерина в сыворотке крови — у 75,6%, уровня триглицеридов — у 69,5%. Гиперурикемия выявлена у 45,1% больных, индекс массы тела более 25 кг/м² — у 56,1% обследованных. Анемия (уровень гемоглобина в крови ниже 130 г/л для мужчин и ниже 120 г/л для женщин) отмечалась у 24,7% пациентов.

Учитывая, что выраженная ПУ и снижение функции почек являются основными независимыми факторами риска дальнейшего прогрессирования ХБП [1], мы выделили следующие 4 группы: 1-я — ПУ ≤3,5 г/сут, СКФ ≥60 мл/мин/1,73 м² (n=40); 2-я — ПУ ≤3,5 г/сут, СКФ <60 мл/мин/1,73 м² (n=18); 3-я группа — ПУ >3,5 г/сут, СКФ ≥60 мл/мин/1,73 м² (n=16); 4-я группа — ПУ >3,5 г/сут, СКФ <60 мл/мин/1,73 м² (n=8) (табл. 1).

Биопсию почки для уточнения диагноза и выбора оптимальной тактики терапии провели у 34 пациентов; из них у 8 (23,5%) выявлен мезангиопролиферативный нефрит (МПГН), у 6 (17,7%) — мезангиокапиллярный нефрит (МКГН), у 5 (14,7%) — нефрит с минимальными изменениями (МИ), у 3 (8,8%) — фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), у 8 (23,5%) — мембранозная нефропатия (МН), у 4 (11,8%) — фибропластический гломерулонефрит. Среди этих 34 больных выраженные склеротические изменения (склероз более 30% клубочков, фиброз интерстициальной ткани, занимающий более 30%) отмечались у 13 (38,2%). Морфологическое исследование выполнено на кафедре патологической анатомии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова проф. В.А. Варшавским.

Активная иммуносупрессивная терапия в момент обследования проводилась у 44 пациентов. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента или блокаторы рецепторов ангиотензина II 1-го типа с антигипертензивной и нефропротективной целями получали 54 из 82 обследованных соответственно.

Специальные методы исследования. Для определения мочевой экскреции биомаркеров VEGF-A, THBS1, ANGPT2, NGAL, COL4 (табл. 2) 10 мл утренней мочи собирали в сухие пластиковые пробирки и центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин, отделяли супернатант мочи, который замораживали и хранили в рефрижераторе при температуре –80 °С. Исследования проводили методом ELISA на базе межклинической иммунологической лаборатории (зав. А.Г. Серова) Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Для исключения погрешности, связанной с разной степенью разведения мочи в результате различного водного режима пациентов, полученные показатели выражали по отношению к эквивалентной концентрации креатинина мочи в граммах на литр.

Статистический анализ. Для описания распределения признаков рассчитывали медиану, 25-й и 75-й процентили. Значения показателя выше 75-го процентиля оценивали как высокие. Для оценки достоверности различий исследуемых показателей использовали методы непараметрической статистики (для независимых выборок): Манна—Уитни и критерий χ² Пирсона. Достоверными считали различия при p<0,05. Для оценки связей между исследуемыми показателями применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. О силе и направленности связи судили по величине и знаку коэффициента регрессии Rs. Достоверными считали различия и корреляции при p<0,05. Все расчеты проводили с использованием пакетов программ Statistica for Windows, версия 8,0, StatSoft, Inc., 1987—2007.

Результаты изучения показателей мочевой экскреции изученных биомаркеров — регуляторов ангиогенеза (VEGF-A, THBS1, ANGPT2) и маркеров повреждения почек (NGAL, COL4) у обследованных больных ХГН представлены в табл. 1.

Сопоставление экскреции всех трех регуляторов ангиогенеза (VEGF-A, THBS1, ANGPT2) показало, что между ними имеется прямая связь: VEGF-A и THBS1 одинаковым образом прямо коррелировали с уровнем ANGPT2 (Rs=0,37 и 0,37 соответственно; p<0,001), между VEGF-A и THBS1 также выявлена слабая положительная корреляция (Rs=0,20; 0,05≤p<0,1).

По нашим данным (см. табл. 2; табл. 3, 4), изменения всех 3 регуляторов ангиогенеза имели однонаправленный характер и одинаковым образом зависели от основных показателей активности/тяжести ХГН.

Высокая мочевая экскреция VEGF-A, THBS1, ANGPT2 отмечалась при наличии у больных ХГН выраженной протеинурии, нефротического синдрома и связанной с ними гиперлипидемии. Напротив, ассоциации уровня экскреции VEGF-A и ANGPT2 с высокой гематурией (более 10 эритроцитов в поле зрения в общем анализе мочи) не отмечалось, а уровень экскреции THBS1 при выраженной гематурии был даже ниже, чем в ее отсутствие, — 0,0 (0,0; 12,8) и 0,0 (0,0; 486,8) пг/г (р<0,05).

Не наблюдалось связи экскреции регуляторов ангиогенеза с уровнем А.Д. При этом уровень экскреции ANGPT2 коррелировал с числом получаемых антигипертензивных препаратов, отражающим тяжесть АГ, а уровень экскреции VEGF-A отрицательно коррелировал с длительностью АГ (см. табл. 3).

Не выявлено также корреляции уровня экскреции VEGF-A, THBS1 ANGPT2 с величиной СКФ. Однако сочетание высокой ПУ и сниженной СКФ (<60 мл/мин/1,73 м²) характеризовалось более высоким уровнем ANGPT2 по сравнению с таковым у пациентов со столь же высокой ПУ, но без дисфункции почек (см. табл. 1). Уровень экскреции VEGF-A, THBS1 ANGPT2 не связан и с выраженностью нефросклероза (по данным биопсии почки).

Высокий (>75-й процентиль) уровень экскреции VEGF-A наблюдался достоверно чаще среди пациентов с «подоцитарными» морфологическими вариантами ХГН — МИ, ФСГС и МН, чем с «мезангиальными» вариантами — МПГН и МКГН (43,8 и 7,1% соответственно; р<0,05), при этом достоверных различий по выраженности протеинурии между указанными группами не отмечено.

Уровень мочевой экскреция ANGPT2 высоко коррелировал с выраженностью анемии, в то же время связь мочевой экскреции VEGF-A с анемией оказалась недостоверной. Выявлена прямая корреляция между уровнем экскреции ANGPT2 и общими маркерами воспаления — уровнем фибриногена в сыворотке крови, СОЭ (см. табл. 3).

Нами отмечена тесная связь между уровнем мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза и маркеров повреждения почек — NGAL и COL4, которая в свою очередь определялась выраженностью протеинурии и степенью снижения функции почек (см. табл. 3).

Проведение иммуносупрессивной терапии в период исследования не влияло на величину экскреции VEGF-A. В то же время среди больных, получавших иммуносупрессанты, значительно чаще (37,2%), чем у больных, не получавших данную терапию (10,8%; р<0,01), отмечалась высокая экскреция THBS1. Высокая экскреция ANGPT2 также несколько чаще отмечалась у больных, получавших иммуносупрессивную терапию (32,6 и 16,2% соответственно; 0,05≤p<0,1).

Прием препаратов, подавляющих ренин-ангиотензиновую систему, не влиял на уровень экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2.

Изученные нами в моче больных ХГН молекулярные факторы по-разному участвуют в регуляции ангиогенеза и воспаления. Так, VEGF является мощным стимулятором ангиогенеза [13—15]. Показано, что он защищает эндотелий от повреждения, усиливает проницаемость сосудов, вызывает вазодилатацию, активируя систему NO, взаимодействует со свертывающей системой крови [7, 8, 14]. Все это имеет большое значение для пациентов с ХГН, у которых имеются дисфункция эндотелия и склонность к гиперкоагуляции. Кроме того, VEGF, синтезируемый почечными тубулоцитами, по паракринному механизму стимулирует их пролиферацию и подавляет апоптоз [16].

THBS1 относится к ингибиторам ангиогенеза, а также участвует в коагуляции крови, подавляет систему NO, т. е. по многим функциям противоположен VEGF [7, 8, 17]. Взаимодействуя с трансформирующим β-фактором роста (TGF-β), THBS1 регулирует клеточно-матриксные взаимодействия и оказывает профиброгенное действие [18, 19].

ANGPT2 нарушает контакт между эндотелиальными клетками, способствует регрессии сосудов, однако во взаимодействии с VEGF-A стимулирует неоангиогенез, т. е. играет важную роль в обновлении микрососудистого русла [20, 21].

Несмотря на различия в функциях, экскреция всех трех молекулярных медиаторов ангиогенеза, по нашим данным, одинаковым образом коррелировала с показателями активности/тяжести ХГН: отмечена высокая корреляция мочевой экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 с уровнем ПУ, но не с величиной гематурии и АД.

Выявленная связь высокой экскреции регуляторов ангиогенеза с уровнем ПУ не объясняется только механическим их проникновением из сыворотки крови у больных ХГН через поврежденный клубочковый фильтр. Полученные, в том числе в нашей клинике, данные убедительно свидетельствуют в пользу возможности локально-почечного происхождения этих биомаркеров, как и других молекулярных медиаторов повреждения почек, обнаруженных в моче больных ХГН, и в почечной ткани, полученной при биопсии [3, 10]. Локально продукция регуляторов ангиогенеза подоцитами и клетками канальцевого эпителия в последнее время доказана морфологически в экспериментальных моделях ХБП, а также в клинических исследованиях у больных ХГН [7, 8, 22, 23].

Для объяснения выявленной нами высокой мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 у больных ХГН с выраженной ПУ может быть предложено несколько гипотез.

Прежде всего прямая корреляция мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза с ПУ может быть обусловлена наличием активного иммунного воспаления в почечных клубочках, приводящего к повреждению почечного фильтра с повышением его проницаемости для белка, и в то же время сопровождается продукцией большого количества цитокинов, в том числе регуляторов ангиогенеза, которые могут вносить дополнительный вклад в усиление П.У. Так, установлено, что VEGF-A (а возможно, и другие регуляторы ангиогенеза), вырабатываемый в подоцитах, по паракринному механизму взаимодействует с эндотелием клубочков, увеличивая его фенестрацию и таким образом способствует повышению ПУ [7, 24].

Следует отметить, что выявленная нами прямая корреляция уровня мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза с ПУ не исключает защитно-приспособительный характер их повышенной локальной почечной продукции при ХГН. Наряду с данными о том, что повышенная экспрессия подоцитами VEGF-A у мышей ведет к развитию протеинурии [24], в других исследованиях показано участие VEGF в репарации почек после острого ишемического повреждения [25], что дает основание их рассматривать как компоненты локальной системы самозащиты. Косвенным подтверждением этого предположения может быть описанное в литературе развитие побочного эффекта на введение антител к VEGF-A у онкологических больных в виде массивной протеинурии [26].

Можно обсуждать и другую, «тубулярную», причину высокой экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 у больных с протеинурическими формами ХГН — хроническую гипоксию почечных канальцев. Тубулярную гипоксию при ХГН вызывают различные механизмы — сужение выносящей артериолы под действием ангиотензина II, редукция перитубулярного капиллярного русла, отек интерстициальной ткани, формирование в нем воспалительного клеточного инфильтрата, отложение внеклеточного матрикса [5]. В дополнение к этим известным механизмам можно допустить, что в условиях высокой ПУ резко повышенная функциональная нагрузка на клетки канальцевого эпителия по реабсорбции профильтровавшегося белка приводит к усугублению дефицита кислорода, являясь самостоятельным стимулом для локальной продукции факторов, регулирующих ангиогенез.

Отсутствие у обследованных нами больных ХГН снижения мочевой экскреции VEGF-A и повышения THBS1 на поздних стадиях ХБП и при наличии выраженного нефросклероза по данным биопсии почки кажется на первый взгляд парадоксальным, противоречащим данным литературы и результатам собственных прошлых исследований о развитии на поздних стадиях ХГН редукции перитубулярного капиллярного русла [9, 27—29]. Однако это может быть объяснено, если принять во внимание, что стимуляторы фиброгенеза, в частности TGF-β, при своей активации в процессе воспаления ремоделируют физиологическое действие факторов ангиогенеза при ХГН, подавляя их проангиогенные и усиливая антиангиогенные эффекты [30].

При наличии такого парадоксального ответа на эндогенные регуляторы ангиогенеза почечного микрососудистого русла попытки применения в лечебных целях при ХГН экзогенных аналогов или стимуляторов VEGF либо антагонистов THBS1 могут оказаться неоднозначными и нуждаются во взвешенном подходе. В связи с этим дальнейшие научные исследования факторов ангиогенеза при ХГН могут иметь большое практическое значение.

Выявление прямой связи мочевой экскреции факторов, регулирующих ангиогенез, с экскрецией маркеров повреждения почек NGAL и COL4, характеризующих состояние канальцевого эпителия, подтверждает наше предположение о тесной связи между протеинурическим ремоделированием тубулоинтерстиция, ведущим к формированию ТИФ, и продукцией факторов ангиогенеза.

Кроме локальных почечных эффектов, факторы, регулирующие ангиогенез, играют при ХГН важную роль в защите тканей всего организма от гипоксического повреждения в условиях анемии, характерной для поздних стадий ХБП. При снижении парциального давления кислорода в тканях активируется семейство факторов, индуцируемых гипоксией (hypoxia inducible factors — HIF), среди которых HIF-1 является мощным индуктором продукции стимуляторов ангиогенеза, в первую очередь VEGF [31, 32]. В нашем исследовании связь мочевой экскреции VEGF-A с уровнем гемоглобина крови оказалась недостоверной, однако выявлена его отрицательная корреляция с экскрецией ANGPT2, что свидетельствует об участии данного фактора при ХГН в адаптации к анемии.

Таким образом, полученные нами результаты о высокой экскреции с мочой у больных с протеинурическими формами ХГН регуляторов ангиогенеза VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 и ее связи с экскрецией маркеров повреждения почек свидетельствуют, что такая экскреция может рассматриваться как интегральный показатель, отражающий повреждение почечных клубочков и свидетельствующий о протеинурическом/гипоксическом ремоделировании тубулоинтерстиция. Локальная продукция регуляторов ангиогенеза усиливается под влиянием анемии, однако данный эффект оказывается недостаточным для предотвращения редукции перитубулярного капиллярного русла в рамках формирующегося ТИФ.

Полученные нами новые данные расширяют представления о патогенезе ХГН и механизмах действия традиционной нефропротекции, а также позволяют наметить перспективные направления целенаправленных методов лечения.