АБП — антибактериальный препарат

АБТ — антибактериальная терапия

АМП — антимикробный препарат

АОБ — алкилоксибензолы

АР — антибиотикорезистентность

АТ — антибиотикотолерантность

ИСМП — инфекционные заболевания, связанные с оказанием медицинской помощи

КП I — «персистеры» I типа

КП II — «персистеры» II типа

КП — клетки-«персистеры»

СТА — система токсин—антитоксин

УПМ — условно-патогенные микроорганизмы

В настоящее время снижение инфекционной заболеваемости, связанной с оказанием медицинской помощи, — огромная, трудно решаемая проблема для всех стран мира [1]. Инфекционные осложнения, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), остаются существенным фактором ухудшения течения и прогноза многих заболеваний неинфекционной этиологии и опасных для жизни критических состояний.

Неэффективность антибактериальной терапии (АБТ) в отношении штаммов, которые вызывают инфекционные заболевания, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), у больных обусловлена развитием антибиотикорезистентности (АР) этиологически значимых штаммов УПМ к антимикробным препаратам (АМП). Широкое распространение устойчивых к АМП штаммов патогенных микроорганизмов и УПМ приводит к развитию инфекционных осложнений у пациентов разных групп, доходящих у больных со злокачественными новообразованиями до 70—80% [2, 3]. У пациентов с данной нозологией это становится основной причиной смерти. Одним из примеров является рост заболеваемости инфекцией Clostridium deficille в США, составляющий до 250 тыс. случаев в год [4]. При этом штаммы C. deficille становятся более устойчивыми к АБТ, приводя к увеличению летальности от этой инфекции (в 4 раза за период с 2000 до 2007 г.), достигающей 14 тыс. случаев в год [5]. Значительный вклад в хронизацию инфекционных болезней, в том числе ИСМП, обусловленные имплантатами или постоянным использованием устройств и изделий из пластика вносят биопленки, образуемые устойчивыми к антибиотикам бактериями [6]. Так, механическая вентиляция у больных с критическими состояниями, при которых требуется введение эндотрахеальной трубки, являясь спасающей жизнь медицинской процедурой, в то же время несет значительные риски формирования биопленок, содержащих устойчивую к антибиотикам микрофлору, вызывающую ИСМП — внутрибольничную пневмонию [7, 8]. Летальность при такой пневмонии достигает 30—70% [9—12]. Формирование устойчивыми к антибиотикам микроорганизмами биопленок в послеоперационных ранах и трофических язвах встречается часто, обусловливая их длительное незаживление и риск развития тяжелого сепсиса [13, 14]. Таким образом, устойчивость к антибиотикам является серьезной проблемой, с которой сталкиваются клиницисты самого разного профиля.

Согласно существующим представлениям возникновение АР рассматривается как процесс, связанный с модификацией генома бактерий в результате спонтанных мутаций и/или модификации бактериального генома внутри- и внеклеточными мобильными элементами, а также за счет рекомбинации. Эти генетические изменения приводят к изменениям экспрессии и структуры белков, участвующих в рецепции, трансмембранном транспорте и метаболизме антибиотиков, обеспечивая выживаемость микроорганизмов в присутствии антибиотических препаратов. В рамках этой доминирующей концепции АР рассматривается как свойство вегетирующих форм микроорганизмов, проявляющих метаболическую и пролиферативную активность.

В настоящее время накоплено большое количество доказательств фенотипической гетерогенности и пластичности генетически однородной популяции бактерий, что при воздействии на нее бактерицидных доз антибиотиков обусловливает выживание малочисленной субпопуляции (0,001—1%) на фоне гибели большинства клеток [15—17]. Причиной этого феномена, впервые обнаруженного в 1942 г. при наблюдениях за гибелью культуры стафилококка, обработанной пенициллином [18], является переход малого числа генотипически чувствительных к антибиотикам клеток в фенотип выживания (персистенции) в присутствии АМП [16, 19]. В соответствии с принятой точкой зрения эти клетки, названные «персистерами» (persister — стойкая бактерия) [20], безразличны к наличию любых антибиотиков в их окружении. Впоследствии это явление устойчивости, отличное от классической АР, получило название множественной лекарственной толерантности (multidrug tolerance — MDT), или антибиотикотолерантности (АТ) [19, 21]. Выживающие «персистеры» находятся вне пролиферативного цикла в отличие от АР-клеток, несущих гены резистентности к антибиотику (ам) [22]. Другим отличием фенотипа АТ клеток-«персистеров» (КП) является их способность при пересеве в свежую среду полностью воспроизводить родительскую популяцию антибиотикочувствительных клеток, в которой также будет формироваться очень малочисленная субпопуляция К.П. При пересеве в свежую среду АР-клеток в выросшей популяции все клетки сохраняют генотип АР, т. е. способности размножаться в присутствии данного антибиотика [23]. При этом в популяции генетически устойчивых АР-клеток будет присутствовать небольшая субпопуляция КП, обеспечивающих выживание популяции при действии других стрессорных факторов (антибиотиков иной природы, других факторов микроокружения).

Таким образом, основные функциональные отличия АТ от АР заключаются в том, что первая обеспечивает сохранение популяции как вида при экстремальных воздействиях, в том числе антибиотиков и лекарственных препаратов различной химической природы, а вторая определяет возможности размножения генетически приспособленных бактерий к изменившимся условиям существования (антибиотики или другие стрессоры).

Интерес к изучению покоящихся форм патогенных и условно-патогенных бактерий при различных инфекционных заболеваниях и инфекционных осложнениях соматических заболеваний резко вырос в последние годы (2012—2015 гг.). В настоящее время феномен бактериальной персистенции, обеспечивающей устойчивость инфекции к антибиотикотерапии, подтвержден для таких возбудителей, как Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma genitalium, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Brucella abortus и др. [24]. Установлена роль покоящихся форм в персистенции возбудителя туберкулеза [25, 26], патогенезе ассоциированных с установкой катетера инфекций [27], развитии пневмонии, ассоциированной с муковисцидозом или легионеллезом [28], хронические инфекции мочеполовой системы [29—32], билиарного тракта [33—35], инфекции среднего уха [33]. Доказано участие персистирующих форм H. pylori в патогенезе гастродуоденитов и язвы желудка, двенадцатиперстной кишки [33, 36]. Показано, что образование биопленок патогенными грибами рода Candida обусловлено наличием КП, толерантных к противогрибковым препаратам [37]. Связь дормантности, персистенции возбудителей и пленкообразования с хроническим течением инфекций, помимо туберкулеза, отмечена в отношении P. aeruginosa при муковисцидозе [38—41].

Со времени открытия и широкого клинического использования антибиотиков описаны несколько форм устойчивости патогенных микроорганизмов и УПМ, не имеющих отношения к генетически обусловленной АР. К ним относятся спорообразующие организмы, КП и длительно переживающие покоящиеся формы, включая некультивируемые клетки [42], цистоподобные покоящиеся клетки [43] неспорообразующих бактерий. Все эти формы существования микроорганизмов характеризуются резким снижением метаболической и пролиферативной активности. Следствием этого состояния микроорганизмов является отсутствие чувствительности к антимикробным препаратам, получившее в литературе название А.Т. Кроме самостоятельного значения покоящихся форм в формировании устойчивости бактерий к АМП, по данным литературы, АТ и развитие АР у патогенных микроорганизмов и УПМ в значительной степени взаимосвязаны [43]. Показано, что при индукции образования покоящихся форм микроорганизмов и КП, в том числе в присутствии АМП, образуются клоны с фенотипом АР. В то же время АМП могут выступать как индукторы состояния покоя у бактерий.

Таким образом, выявление и изучение клеточных и молекулярных механизмов формирования покоящихся форм и КП и связанной с ними АТ УПМ имеет фундаментальное значение для понимания молекулярных основ развития ИСМП. При этом целесообразно комплексное исследование функциональной роли молекул межклеточной коммуникации, антибиотиков, медиаторов врожденного и адаптивного иммунитета (про- и антивоспалительные цитокины, антибактериальные пептиды, нейромедиаторы) в формировании АТ бактерий, на основе которого могут быть предложены направления поиска фармакологически активных соединений, минимизирующих выживание микробной популяции при воздействии лекарственных (антибиотических) препаратов.

Фенотипическое и генотипическое разнообразие бактерий-«персистеров». В настоящее время различают два типа «персистеров»: образующиеся в растущей культуре (в фазе экспоненциального — замедленного роста) «персистеры» II типа (КП II), численностью около 0,01% и образующиеся в стационарной культуре «персистеры» I типа (КП I), численностью 1% и более [21, 44].

Другим фенотипом толерантности обладают так называемые индифферентные клетки, физиологическое состояние которых свойственно клеткам культур стационарной фазы [45]. Выход из клеточного цикла обусловливает их временную способность выживать в присутствии антибиотиков. В отличие от КП они чувствительны к антибиотикам хинолонового ряда (в том числе ципрофлоксацину) [46]. Так как стационарная фаза ассоциируется и с индифферентными клетками и КП I, важно различать эти формы толерантности. Еще одной формой временной толерантности бактерий к антибиотикам является метаболическая адаптивная устойчивость, связанная в том числе с изменением проницаемости клеточных оболочек [47]. Кроме того, к формам АТ относят клетки SCV-фенотипа, образующие очень мелкие колонии (диаметром ≤1 мм), крайне медленно растущие и вследствие этого устойчивые к антибиотикам [46]. Из всех форм АТ наибольшее внимание в настоящее время уделяется КП, поскольку они выживают в присутствии любых АМП, образуются как фенотип выживания и в популяциях клонов, резистентных к антибиотикам, и как считается ответственны за рецидивы хронических инфекций. Следует подчеркнуть, что КП образуются в развивающейся культуре всегда, вне зависимости от наличия антибиотиков, которые являются лишь селектирующим фактором, выделяющим КП из общей массы чувствительных к антибиотикам и потому лизирующихся клеток.

Имеется информация о положительном влиянии на образование толерантных клеток (переход обычного фенотипа в толерантный) при неблагоприятных условиях роста культур: недостаточности азота, обусловливающего голодание клеток [48], гипоксии или низких рН [49].

Относительно связи общего стрессового ответа популяции с развитием разных форм АТ-клеток информации практически нет. При этом остается неопределенной дальнейшая судьба КП в ситуации продолжающихся неростовых условий (в среде с антибиотиком).

Исследование транскриптома изолированной популяции КП показало негативную регуляцию экспрессии генов, участвующих в энергетическом обмене и синтезе факторов патогенности бактерий, таких как жгутики. В совокупности эти исследования подтвердили мнение о том, что КП находятся в состоянии метаболического и пролиферативного покоя. Идентифицированы конкретные гены, которые вовлечены в формирование фенотипа КП у Е. coli. К этим генам относят Rmf, sulA, ген ингибитора септации, ген ингибитора трансляции стационарной фазы и гены, кодирующие белки системы токсин—антитоксин (СТА) — relBE, dinJ и mazEF [50]. Особое внимание исследователи уделяют генам, кодирующим белки СТА. Показано, что накопление токсина приводит к угнетению метаболизма бактериальной клетки и блокирует ее пролиферацию, т. е. способствует формированию фенотипа, характерного для КП. В обычных условиях экспоненциального роста популяции бактерий молекула токсина блокирована молекулой соответствующего антитоксина, ген которого часто локализован в плазмидах. Предполагают, что нарушение сбалансированного синтеза токсинов и соответствующих антитоксинов может приводить к избыточной активности токсинов с развитием метаболического и пролиферативного покоя бактериальной клетки [15]. Дисбаланс в продукции компонентов СТА может быть обусловлен аллельными вариантами входящих в эти системы генов. Впервые это продемонстрировано на примере генов токсина и антитоксина, входящих в локус HypAB. Определенный генетический вариант белка — антитоксина HypB, обеспечивал повышенную активность белка — токсина HypA. Штаммы E. coli, несущие данный аллельный вариант, были способны формировать в 100—1000 раз более многочисленную популяцию КП при действии АМП. В случае генов RelB и MazF наблюдали гиперэкспрессию токсинов, ассоциированную с устойчивыми мутациями в этих генных локусах, что в конечном итоге фенотипически проявлялось в увеличении популяции персистирующих клеток на несколько порядков по сравнению с изогенными штаммами, имеющих «дикий» генотип [51]. Полученные результаты имеют значение для молекулярно-генетической диагностики повышенной резистентности к антибактериальным препаратам (АБП) у бактерий — возбудителей ИСМП.

Контроль образования КП. Анализ литературы позволяет предположить, что в контроле образования фенотипов персистенции могут быть задействованы следующие участники регуляторного контроля развития микробных популяций: 1) факторы, А — бутиролактоны, контролирующие программы развития стрептомицетов; ацилированные лактоны гомосерина (системы quorum sensing) — контролирующие биопленочный фенотип у бактерий; 2) белки семейства Rpf, синтезируемые в ранней фазе экспоненциального роста популяции и реактивирующие некультивируемые клетки; протекторы и адаптогены антиоксидантной защиты; циклические липопептиды — регуляторы адгезии клеток; алкилоксибензолы (АОБ) — полимодальные регуляторы [43, 52]. Эти участники в зависимости от их структуры (положения гидроксилов, длины алкильного радикала) и концентрации контролирующие плотность популяции, экспрессию стрессовых регулонов SOS-ответа и rpoS стационарной фазы, фазовые вариации пилей I типа у E. coli посредством способности АОБ могут модифицировать конформацию белков и, следовательно, влиять на их функциональную активность. Используя возможности бактериальных регуляторов, можно влиять на антибактериальный ответ на «лекарственную атаку»: контроль общего rpoS-регулона стационарной фазы через регуляцию генов SOS-ответа и модификацию регуляторных белков, можно регулировать фазовые вариации вирулентности (например, вариации пилей I типа у E. coli), направления диссоциативных переходов в гетерогенной популяции.

Стратегии борьбы с КП. Таким образом, для борьбы с АТ бактерий представляются перспективными следующие стратегии: 1) минимизация образования КП за счет регуляции окислительного и общего стресса; 2) принудительная реверсия КП к росту с последующей антимикробной атакой (тиндализация); 3) напротив, предотвращение прорастания КП для предупреждения рецидивов хронических инфекций; 4) перевод КП в состояние микромумий длинноцепочечными АОБ для стерилизации и борьбы с ИСМП; 5) регуляция фазовых переходов для предупреждения или минимизации развития вирулентных клонов; 6) популяционная регуляция минимизации образования покоящихся форм, так как похоже, что именно они ответственны за выживание (персистенцию) условных патогенов, выделение устойчивых к антибиотикам клонов.

При этом, учитывая недавно опубликованные данные о способности некоторых бактериальных метаболитов с функцией аларминов как индуцировать КП, так и модулировать активность клеток иммунной системы [53—57], представляется особенно важным интенсифицировать изучение тех взаимодействий макро- и микроорганизмов, которые приводят к генерации и сохранению К.П. Ведь накопление КП в компартментах тканей организма после разрешения или временного утихания воспалительных реакций может быть основой рецидивов инфекции при реверсии КП в бактерии с высоким пролиферативным потенциалом. Классический третий компонент эпидемического процесса — восприимчивый организм теоретически может иметь существенное значение и в эпидемиологии К.П. Если это так, то определение механизмов взаимодействия накапливающихся КП с компонентами, прежде всего врожденного иммунитета, представляет интерес как с точки зрения выявления молекулярных мишеней восприимчивого организма, участвующих в предотвращении накопления КП, так и для поиска биомаркеров, ассоциирующихся с генерацией и накоплением КП в организме. Результаты последних исследований обусловливают необходимость крупных изучений на уровне транскриптома, протеома, метаболома, эпигенома, секвенирования ДНК персистирующих форм. Результатом таких комплексных микробиологических, иммунологических, генетических и постгеномных исследований явилось бы создание системы мониторинга как штаммов с повышенной способностью к образованию КП, так и тех компонентов иммунной системы, которые особенно важны для борьбы с К.П. Поэтому наравне с продолжением фундаментальных исследований в области микробиологии персистирующих форм микроорганизмов для решения поставленных вопросов представляется необходимым инициировать исследования, направленные на решения следующих вопросов: как факторы иммунной системы влияют на генерацию КП? Какие параметры иммунной системы могут быть задействованы в иммунном ответе организма на ПК? Существуют ли особые механизмы «иммунного ускользания», способствующие сохранению бактериальных форм, подобных КП, в организме? Наконец, организация широких эпидемиологических исследований по проблеме персистирующих форм патогенных возбудителей и УПМ могла бы связать воедино фундаментальные морфофункциональные характеристики КП, факторы иммунной защиты и механизмы, определяющие эпидемиологическое значение образования, накопления и реверсии К.П. Такие исследования могли бы быть проведены на разных контингентах, включая больных с нарушенным в результате трансплантации, онкологического заболевания, медикаментозной терапии иммунитетом; больных, перенесших тяжелые операции, с длительным инфекционным процессом, инфекционными осложнениями критических состояний; возможно, после длительного и частого приема антибиотиков. Результаты таких исследований могут внести существенный вклад в понимание значения КП в эпидемических процессах и разработку методов борьбы на всех этапах их развития, в первую очередь там, где опасность КП наиболее очевидна, а именно при ИСМП.

Как показали многочисленные исследования, популяция КП имеется у большинства видов и штаммов УПМ. Это позволяет по-новому взглянуть на существующие принципы АБТ. Очевидно, что принятый подход, согласно которому необходимо обеспечивать максимальные терапевтические концентрации антибиотика в организме больного может быть неэффективен в отношении штаммов, способных формировать повышенное количество КП в ответ на стресс, индуцированный применяемым антибиотиком. Гибель большинства клеток патогена и нормализация клинических показателей лишь маскируют неизбежное рецидивирование заболевания из выжившей фракции персистирующих клеток. Более того, согласно недавним исследованиям в популяции персистирующих клеток сохраняются клетки, несущие генетические детерминанты АР и сохраняются условия для их горизонтальной передачи мобильными генетическими элементами, что повышает вероятность размножения АР-клонов возбудителя [58]. Поэтому очевидно, что более эффективным может быть подход, основанный на сочетании терапии АБП и препаратами, ингибирующими механизмы популяционной адаптации бактерий — формирование бактерий-«персистеров». Следует отметить, что подобный подход частично реализован в исследованиях группы, возглавляемой К. Lewis [15, 19]. Показано, что препарат ADEP-4, блокирующий протеазу ClpА (компонент ТА системы ClpAB), способен резко снижать популяцию КП E. сoli, что позволило в сочетании с рифампицином стерилизовать культуру данных клеток как в планктонной форме, так и в составе биопленки [59]. Более того, данная комбинация оказалась значительно эффективнее в защите экспериментальных животных от гибели, при экспериментальном заражении последних патогенными штаммами Е. coli по сравнению с монотерапией рифампицином.

Другой подход сводится к оптимизации схемы назначения АБП [60]. Суть подхода базируется на предположении, что персистирующая популяция бактерий, выжившая после курса АБТ, неминуемо вступит в пролиферативный цикл, являясь чувствительной к АБТ. Поэтому повторное назначение антибиотиков в определенные сроки после первоначального курса АБТ может эффективно предотвратить рецидив инфекционного процесса. Данный подход находит подтверждение при анализе опыта применения антибиотиков с момента начала их широкого применения. Так, в литературе имеется множество эмпирических данных, свидетельствующих о высокой эффективности интермитирующей антибиотикотерапии многих хронических инфекционных заболеваний. Однако этих данных недостаточно для формирования строгих клинических показаний к повторному курсу антибиотикотерапии. В то же время нерационально и абсолютизировать свойства АБП полностью уничтожать популяцию патогенных микроорганизмов. Очевидно лишь, что игнорировать значения КП в адаптации бактериального сообщества к неблагоприятным условиям существования, являющегося ключевым фактором перехода инфекции в хроническую форму, уже невозможно.

Все перечисленное иллюстрирует важность разработки методов клинической идентификации персистирующей фракции бактериальных патогенов, определения генетических маркеров риска формирования данных клеток у выделяемых штаммов возбудителей ИСМП, и, наконец, методов, верифицирующих переход ПК от покоя к фазе активной пролиферации, до появления клинических признаков рецидива инфекции. Следует отметить, что данные исследования находятся на самой начальной стадии во всем мире.