Атеросклероз - многофакторное хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся формированием атеросклеротических бляшек (АСБ) в интиме артериальной стенки [1]. В настоящее время активно изучается роль адаптивного иммунитета в инициации и прогрессировании атеросклероза. Аутоантигены (окисленные липопротеиды низкой плотности и их компоненты, в частности АроВ-100, а также белки теплового шока и др.) фагоцитируются и презентируются дендритными клетками и макрофагами Т-лимфоцитам, вызывая их активацию и пролиферацию [2-7]. Основную популяцию эффекторных Т-клеток в АСБ составляют Т-хелперы 1-го типа (Тh1), характеризующиеся экспрессией внутриклеточного фактора Т-bet и секрецией цитокинов интерферона-γ (IFN-γ) и α-фактора некроза опухоли (TNF-α), оказывающих провоспалительные эффекты и способствующих дестабилизации АСБ.

В экспериментальных работах доказано проатерогенное действие Тh1 и продуцируемых ими цитокинов. Так, введение лимфоцитов CD4⁺ мышам с иммунодефицитом ускоряло образование атеросклеротических поражений одновременно с увеличением уровня IFN-γ в крови. «Выключение» фактора транскрипции T-bet или подавление секреции клетками IFN-γ приводило к уменьшению размера и количества АСБ у мышей с гиперхолестеринемией [8-11].

В АСБ содержатся также Т-клеточные субпопуляции, ограничивающие воспаление и замедляющие прогрессирование атеросклероза. Естественные регуляторные Т-лимфоциты (nTreg) образуются в тимусе и являются ключевыми клетками, поддерживающими иммунологическую толерантность к аутоантигенам. nTreg экспрессируют общие с Т-хелперными клетками антигены CD4 и CD3, для них характерны высокая экспрессия рецептора интерлейкина-2 (CD25), сниженная экспрессия рецептора интерлейкина-7 (CD127) и экспрессия внутриклеточного фактора транскрипции FoxP3. Treg ограничивают активность эффекторных Т-лимфоцитов посредством контактного межклеточного взаимодействия, синтеза гранзимов и перфоринов, цитокинов интерлейкина-10 (IL-10) и трансформирующего β-фактора роста (TGF-β), а также путем подавления активности антигенпрезентирующих клеток. Регуляторные Т-лимфоциты FoxP3⁺ могут образовываться на периферии в ходе иммунного ответа (так называемые индуцибельные Treg - iTreg). iTreg осуществляют регуляторную функцию в первую очередь посредством синтеза IL-10 и TGF-β [12-15]. У животных с экспериментальным атеросклерозом Treg оказывают противовоспалительный и антиатерогенный эффект. Введение дефицитным по гену АроЕ мышам Treg вызывало значительное замедление прогрессии атеросклероза, что проявлялось формированием меньших по размеру и более стабильных АСБ. Вмешательства, ассоциированные с повышением содержания Treg, также приводили к торможению атерогенеза у экспериментальных животных [6, 16-18].

Продуцирующие интерлейкин-17 (IL-17) Т-хелперы (Тh17) - недавно открытая популяция лимфоцитов, играющая ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний. IL-17 обладает выраженной провоспалительной активностью, стимулируя синтез цитокинов и хемокинов клетками различных типов [19-23]. Роль Тh17 в атерогенезе однозначно не определена. В то время как подавление эффектов IL-17 в эксперименте обеспечивало защиту от атеросклероза в различных экспериментальных моделях, введение рекомбинантного IL-17 ограничивало развитие АСБ на ранних стадиях у мышей, дефицитных по гену рецептора липопротеидов низкой плотности [24-26].

Участие описанных субпопуляций Т-лимфоцитов в атерогенезе в достаточной мере изучено на моделях атеросклероза у мышей. Клинические данные в настоящее время «отстают» от эксперимента. Большинство из них получено для пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС): показано снижение количества циркулирующих Treg у пациентов с ОКС по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией (СС) и донорами без клинически значимого поражения коронарного русла [27-30].

В некоторых исследованиях также отмечено увеличение содержания «провоспалительных» клеток, в частности Th1 и Тh17, и продуцируемых ими цитокинов у пациентов с ОКС по сравнению со СС и контрольной группой [31-33] и уменьшение количества Тreg и концентрации TGF-β [34]. В то же время Т. Simon и соавт. [35] в 2013 г. обнародовали данные проспективного исследования, согласно которым низкая концентрация IL-17 в периферической крови у пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) напрямую связана с более высоким риском развития острых коронарных осложнений в течение последующих 2 лет, что привело к заключению о важной иммуномодулирующей роли IL-17 в сосудистом воспалении.

Результаты исследований, посвященных изучению иммунного баланса - соотношения содержания про- и противовоспалительных субпопуляций лимфоцитов у пациентов со стабильными проявлениями коронарного атеросклероза, противоречивы. В исследовании Q. Li и соавт. [36] участвовали пациенты с ОКС (ИМ и нестабильной стенокардией), СС и коронарным атеросклерозом, подтвержденным ангиографически, а также пациенты контрольной группы без клинически значимого поражения коронарного русла. Количество Treg и их супрессорная активность, а также содержание IL-10 в крови оказались ниже у пациентов с ОКС по сравнению с данными в остальных группах; у пациентов со СС этот показатель был ниже, чем у пациентов с неизмененными коронарными артериями (КА). Содержание Тh17 и IL-17 в крови у пациентов с ОКС превышало аналогичные данные в других обследуемых группах [36]. Напротив, в исследовании Е. Ammirati и соавт. [37] статистически значимых изменений в уровне циркулирующих Тreg и экспрессии мРНК лимфоцитами FoxP3 у пациентов с различными клиническими проявлениями коронарного атеросклероза (отсутствие стенокардии, СС, ОКС) по сравнению с контрольной группой не выявлено. Следует отметить, что в данной работе в контрольной группе с множественными факторами риска развития ИБС, отсутствие коронарного атеросклероза не подтверждено ангиографически [37].

В настоящем исследовании мы оценили количество регуляторных Т-лимфоцитов, Тh1 и Тh17 и ассоциируемых с ними маркеров в крови у больных со стабильным течением ИБС. Для подтверждения участия данных субпопуляций лимфоцитов в развитии атеросклеротических поражений у человека мы сопоставили полученные результаты с данными о степени распространенности атеросклероза и скорости прогрессирования заболевания, полученными при проведении коронарографии (КГ). Нами также изучена зависимость иммунологических показателей от пола пациентов и наличия ИМ в анамнезе.

Пациенты. В исследование включили 80 пациентов, которых по результатам КГ распределили на 4 группы: 1-я группа - 18 больных без клинически значимого поражения КА, 2-я группа - 21 пациент без прогрессирования атеросклероза, 3-я группа - 16 пациентов с прогрессированием коронарного атеросклероза, 4-я группа - 25 больных с трехсосудистым поражением коронарного русла. Во 2-ю и 3-ю группы включали больных, ранее перенесших коронарное стентирование. Под прогрессированием коронарного атеросклероза понимали появление новых стенотических поражений КА, суживающих на 50% и более просвет сосуда, либо увеличение выраженности ранее отмеченного стеноза на 30% и более, в артериях, ранее не подвергавшихся вмешательству. В исследование не включали пациентов с ОКС, перенесенными в течение последних 6 мес ИМ, мозговым инсультом, операцией коронарного шунтирования или транслюминальной баллонной ангиопластики КА, острыми или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, хронической почечной или печеночной недостаточностью, сахарным диабетом.

Получение и активация мононуклеарных клеток крови. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности по методике Boyum [38]. Клетки в концентрации 5 млн/мл ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки человека. Для активации клеток в культуру вносили 25 нг/мл форболмиристатацетата, 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы «Sigma»). Клетки инкубировали в течение 5 ч при температуре 37 °С и 5% СО2.

Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлюориметрии в потоке. Для выявления поверхностных антигенов использовали флюоресцентно меченные моноклональные антитела CD4-FITC, CD25-PC5, CD127-PE (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, eBioscience). Для идентификации внутриклеточных белков использовали наборы для фиксации и пермеабилизации клеток (eBioscience) и флюоресцентно меченные антитела (Foxp3-Аlexa488, IL17А-РЕ, и IFN-γ-FITC, eBioscience). Окрашивание клеток антителами к цитокинам проводили после активации в культуре. Лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов, фиксацию и пермеабилизацию клеток выполняли в соответствии с протоколами производителей. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлюориметрии в потоке (FACSСalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния. nTreg типировали как Т-лимфоциты CD4⁺CD25highCD127low. Тh1 и Th17 типировали как Т-лимфо­циты CD4⁺IFN-γ⁺ и CD4⁺IL17⁺, соответственно. Treg типировали также в мононуклеарной фракции как Т-лимфоциты CD4⁺FoxP3⁺.

Определение содержания IL-17, IL-10, высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ), sCD25 в крови больных. Концентрацию sCD25 и IL-10 в сыворотке крови определяли хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC-Siemens). Концентрацию IL-17 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом с использованием набора Bender MedSystems. Концентрацию СРБ определяли высокочувствительным методом на нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия - США).

Статистический анализ данных. Нормальный характер распределений оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. При несоответствии распределения данных нормальному закону для их описания использовали медиану и квартили (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для межгрупповых сравнений в случае нормально распределенных данных применяли критерий t Стьюдента, в случае несоответствия нормальному закону - критерий U Манна-Уитни. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков использовали критерий &khgr;². Корреляционный анализ проводили с использованием метода Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. В работе применялся пакет статистических программ Statistica 7,0.

Группы больных статистически значимо не различались по основным клинико-анамнестическим характеристикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови (табл. 1).

Содержание nTreg CD4⁺CD25highCD127low в 1-й группе (пациенты без клинически значимого поражения КА) статистически значимо выше, чем в 4-й группе (пациенты с многососудистым поражением коронарного русла) (см. рисунок, а).

Мы оценили баланс про- и антиатерогенных субпопуляций лимфоцитов по отношению количества Th17 к Treg CD4⁺FoxP3⁺, Th1 и суммарного количества (Th1⁺ Th17) к Тreg CD4⁺FoxP3⁺. В 3-й и 4-й группах отношения Th17 к Treg CD4⁺FoxP3⁺ была статистически значимо выше, чем в 1-й группе (см. рисунок, в). Аналогичные результаты получены для отношения Th17 к nTreg CD4⁺ CD25highCD127low (p<0,05). У больных с прогрессирующим течением атеросклероза КА (3-я группа) отношение Тh1/Тreg и (Тh1⁺Тh17)/Тreg выше, чем у больных без прогрессирования коронарного атеросклероза (2-я группа) (см. рисунок, г).

Статистически значимых межгрупповых различий по уровням IL-10, IL-17, вч-СРБ в крови не выявлено. Концентрация sCD25 в крови у пациентов 4-й группы выше, чем у пациентов 1-й группы (табл. 2).

Среди обследуемых больных было 68 (85%) мужчин и 12 (15%) женщин. Группы мужчин и женщин сопоставимы по основным клинико-анамнестическим характеристикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови. У женщин содержание лимфоцитов CD4⁺ и Тreg CD4⁺ FoxP3⁺, выраженному в процентах от числа лимфоцитов, оказалось выше, чем у мужчин -52 (46,5; 54,5)% и 42 (38; 50)% (p<0,05) и 4,2 (3,65; 4,95)% и 3 (2,3; 3,8)% (p<0,05) соответственно.

Среди обследованных доля пациентов, перенесших инфаркт миокарда (ИМ), составила 34% (n=27), доля пациентов без ИМ в анамнезе - 66% (n=53). Давность перенесенного ИМ составила 59 (19; 70) мес. В группе пациентов, перенесших ранее ИМ, доля курильщиков на момент обследования была значимо больше, чем среди пациентов без ИМ в анамнезе. По остальным основным клинико-анамнестическим характеристикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови указанные группы были сопоставимы.

По сравнению с пациентами с неотягощенным анамнезом у больных с ИМ в анамнезе выявлены увеличение содержания лимфоцитов CD4⁺, уменьшение содержания nTreg CD4⁺CD25highCD127low и увеличение содержания Th17. У пациентов с отягощенным по ИМ анамнезом отношение Treg, определяемое как CD4⁺CD25highCD127low и CD4⁺FoxP3⁺, к Th17 оказалось меньше, чем у пациентов без ИМ в анамнезе (табл. 3).

Состояние эффекторного и регуляторного звена иммунитета при ИБС привлекает в последние годы особое внимание ученых и клиницистов. В большинстве исследований продемонстрированы снижение уровня и супрессорной активности Тreg и повышение количества Th17 в кровотоке у больных СС и различными формами обострения ИБС - ОКС, нестабильной стенокардией и ИМ - по сравнению с индивидами без коронарного атеросклероза. Следует отметить, что при ОКС иммунологические изменения могут быть следствием некроза миокарда и острого эмоционального стресса [39].

В настоящем исследовании мы оценили баланс проатерогенных (Th1 и Th17) и антиатерогенных (Тreg, в том числе nTreg) популяций лимфоцитов и ассоциированных с ними растворимых маркеров у больных со стабильным течением ИБС, различной выраженностью и скоростью прогрессии коронарного атеросклероза. У больных с тяжелым многососудистым атеросклерозом КА (4-я группа) по сравнению с пациентами без значимого коронарного атеросклероза (1-я группа) мы наблюдали изменение субпопуляционного состава лимфоцитов крови - снижение содержания регуляторных Т-лимфоцитов и увеличение содержания Тh17. У больных с прогрессирующим течением коронарного атеросклероза (3-я группа) отмечалось повышение отношений Th17/Тreg, и (Th1⁺Th17)/Тreg по сравнению с таковым у больных без коронарного атеросклероза и признаков прогрессии заболевания (1-я и 2-я группы).

Концентрации IL-10, IL-17 и вч-СРБ в крови у пациентов разных групп статистически значимо не различались. Концентрация sCD25 в крови у больных с многососудистым коронарным атеросклерозом выше, чем у больных без атеросклеротического поражения КА, что, вероятно, свидетельствует об активации лимфоцитов. При анализе концентрации вч-СРБ выявлена ожидаемая тенденция к более высокому его уровню у больных с выраженным атеросклерозом коронарного русла (3-я и 4-я группы) по сравнению с таковым у пациентов без значимого атеросклероза КА (1-я группа); отсутствие статистически значимых различий, вероятно, связано с малочисленностью групп.

В нашем исследовании показано, что у женщин содержание Treg CD4⁺FoxP3⁺ выше, чем у мужчин, количество nTreg CD4⁺CD25highCD127low не зависело от пола пациентов. В недавно опубликованном исследовании G. Afshan и соавт. [40], включившем 50 практически здоровых мужчин и 47 женщин молодого возраста (16-25 лет), выявлено, что у женщин содержание nTreg CD4⁺CD25high ниже, чем у мужчин. В наше исследование включены пациенты пожилого возраста, в том числе женщины в постменопаузе, с атеросклерозом КА. Известно, что с увеличением возраста уменьшается созревание лимфоцитов в тимусе и изменяется содержание Treg за счет уменьшения количества nTreg и увеличения количества индуцированных на периферии iTreg [41]. Вероятно, этот процесс протекает по-разному у женщин и мужчин. Вопрос о роли Treg как дополнительного защитного фактора в отношении атеросклероза у женщин нуждается в дальнейшем изучении.

Показанные нами закономерности изменения иммунного баланса - увеличение содержания Th17 и уменьшение содержания Treg и их отношения Treg/Th17 у пациентов, перенесших ИМ, подтверждают результаты выполненного ранее исследования J. George и соавт. [42], в котором установлено, что у пациентов с перенесенным ИМ (т.е. нестабильными проявлениями атеросклероза) различной давности содержание Treg и IL-10 в крови ниже, чем у пациентов без обострений атеросклероза в анамнезе. Прогностическая значимость содержания популяции регуляторных Т-клеток в отношении прогрессирования ИБС и развития ее обострений рассмотрена в работе M. Wigren и соавт. [43]. В проспективном исследовании проанализированы данные 700 пациентов пожилого возраста, за которыми проводилось наблюдение с 1991-1994 по 2008 г. Показано, что содержание Treg CD4⁺FoxP3⁺ на момент включения в исследование у пациентов, перенесших ИМ за период наблюдения, было ниже, чем у пациентов без осложнений.

Таким образом, на основании данных литературы и собственных результатов мы предполагаем, что изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов крови играют определенную роль в прогрессии коронарного атеросклероза, однако требуются дальнейшие исследования, чтобы определить место данных параметров в диагностическом и прогностическом поиске у больных ИБС.

Модуляция параметров клеточного и гуморального иммунитета является перспективным направлением разработки потенциальных терапевтических подходов к лечению больных с атеросклерозом, включающих разработку вакцин, стимулирующих опосредованную Тreg иммунологическую толерантность к аутоантигенам в АСБ, низкодозовую терапию иммуносупрессорными средствами, введение нейтрализующих антител к цитокинам или окисленным липопротеидам низкой плотности, клеточную терапию с применением толерогенных дендритных клеток. Первая подкожная вакцина, направленная на формирование специфичных к пептидному фрагменту АроВ-100 Treg с целью создания иммунологической толерантности готовится к первой фазе клинических исследований в 2014-2015 гг. при поддержке компании Cardiovax. Доклинические исследования показали высокую (70%) эффективность препарата в снижении прогрессирования атеросклероза при интраназальном введении у мышей АроЕ–/. В настоящее время проводятся исследования нейтрализующих антител к интерлейкину-1 (канакинумаб, «Новартис») и антител к пептидному фрагменту окисленной формы АроВ-100 (MLDL1278a, спонсировано BioInvent International AB/Genentech) при атеросклерозе КА и сонных артерий, результаты ожидаются в 2016 г. Изучение иммунологических основ атерогенеза позволит подобрать наиболее эффективную иммунологическую терапию для пациентов с различными нарушениями иммунологического баланса. Все эти данные свидетельствуют о перспективности исследования параметров клеточного иммунитета при атеросклерозе.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №12-04-00945-а.