Значение морфогенетических белков FGF-23 и Klotho как предикторов прогноза хронической болезни почек

Хроническая болезнь почек (ХБП) - общепопуляционная проблема, имеющая не только медицинское, но и большое социально-экономическое значение. По данным эпидемиологических исследований (NHANES и др.), в настоящее время повсеместно наблюдается неуклонное увеличение числа больных ХБП, в том числе с терминальной стадией (V стадия ХБП), при которой требуется терапия, замещающая функцию почек [1, 2].

На обеспечение диализа в странах европейского сообщества расходуется 2%, в США - 5% бюджета здравоохранения [1]. В России терапию, замещающую функцию почек, получают более 24 тыс. человек, ежегодный прирост числа больных в среднем составляет 10,5%, при этом на лечение одного больного расходуется около 1,5 млн рублей [2]. В связи с этим очевидна необходимость поиска новых подходов к предупреждению или максимальной отсрочке терминальной стадии ХБП, а также к повышению качества жизни больных на додиализных стадиях ХБП.

Скорость прогрессирования почечной недостаточности у больных ХБП зависит от ряда факторов, среди которых большое значение имеют сердечно-сосудистые осложнения (ССО), воспаление, белково-энергетическая недостаточность (БЭН), нарушения минерального и костного обмена, анемия, оказывающие значительное влияние на выживаемость и уровень реабилитации больных [3].

Результаты исследований механизмов прогрессирования ХБП в последние годы дополнились вновь полученными данными. Так, пристальное внимание исследователей привлечено к новым маркерам хронического поражения почек и формирования ССО, синдрома хронического воспаления - морфогенетическим белкам - 23-му фактору роста фибробластов (FGF-23) и Klotho [1, 2, 4].

В ряде исследований показано, что повышение продукции остеоцитами FGF-23 при прогрессировании ХБП прямо связано с дисфункцией эндотелия (ДЭ), выраженностью атеросклероза, гипертрофией миокарда, кальцификацией сосудистой стенки, а также с уровнем протеинурии. Увеличение концентрации в сыворотке крови FGF-23 у пациентов со скоростью клубочковой фильтрации (СКФ) менее 60 мл/мин почти в 6 раз увеличивало риск развития атеросклероза [5, 6].

Установлено, что внеклеточная (циркулирующая) часть белка Klotho, секретируемая в кровоток, функционирует как эндокринный фактор и кодирует многие факторы роста, в том числе инсулиноподобный фактор роста 1-го типа и Wnt, обладает способностью снижать активность окислительных процессов путем активации FoxO и увеличения экспрессии супероксиддисмутазы, а также влиять на процессы эндотелиальной интеграции и функцию клеток [7]. В исследовании J. Mirza и соавт. [8] установлена связь между снижением экспрессии белка Klotho в почечной ткани с дисфункцией синоатриального узла и преждевременной гибелью экспериментальных животных от ССО.

Уточнение роли морфогенетических белков FGF-23 и Klotho в прогрессировании ХБП, формировании СОО, воспаления, БЭН и других осложнений позволит оптимизировать методы лечения и профилактики у больных ХБП.

Исследовали 70 больных ХБП I-VD стадии, из них 41 с хроническим гломерулонефритом - ГН (в том числе 10 с нефритом при диффузных заболеваниях соединительной ткани - ДЗСТ), 22 с тубулоинтерстициальным нефритом (ТИН) и 7 с гипертензивным нефросклерозом (табл. 1).

Стадии ХБП определяли согласно критериям KDIGO (2009), при этом СКФ рассчитывали по уравнению CKD-EPI (2011).

Среди 70 больных, включенных в исследование, на момент взятия проб крови у 21 (30%) уровень артериального давления - АД (110/70-140/80) был в пределах нормы, у 49 (70%) отмечалась артериальная гипертония (АГ) разной степени выраженности. Для контроля АГ пациентам назначали антигипертензивные препараты: ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), блокаторы кальциевых каналов, β-адреноблокаторы, диуретики, изолированно или в сочетании в зависимости от тяжести АГ.

Среди 49 больных с АГ у 27 (55,1%) удавалось поддерживать уровень АД в пределах целевого - 130/80-140/80 мм рт.ст., остальные 22 (44,9%) пациента принимали антигипертензивные препараты нерегулярно. На момент начала скринингового обследования у них сохранялась АГ (АД 150/90-165/100 мм рт.ст.).

Среди 24 больных ХБП IV-V стадии с анемией у 19 (79,2%) проводили коррекцию анемии эритропоэтином-β (рекормон) и венофером. У 13 (68,4%) пациентов терапия позволила достичь целевого уровня гемоглобина 110-120 г/л и поддерживать его при продолжении лечения, у остальных 6, несмотря введение рекормона и венофера, сохранялась анемия (Hb <110 г/л).

У 19 (12,9%) больных с повышенным уровнем интактного паратиреоидного гормона (иПТГ) для контроля его продукции применяли парикальцитол, у 20 (13,6%) - альфакальцидол.

У 7 (10%) больных ГН, в том числе при ДЗСТ в связи с сохраняющейся активностью основного заболевания на додиализном этапе ХБП, применяли глюкокортикостероиды и/или цитостатики в умеренных дозах.

У всех 70 больных ХБП I-VD стадии изучен уровень FGF-23 в сыворотке крови (Human FGF-23 ELISA kit с использованием моноклональных антител к полной молекуле FGF-23) и Klotho (Human alpha-Kl ELISA с использованием анти-Klotho-антител). Исследование морфогенетических белков проводили по стандартному протоколу специалисты диагностической лаборатории ЛиТЕХ. Для исследования у пациентов брали кровь в вакуумные пробирки, затем ее центрифугировали, а полученную сыворотку замораживали и хранили при температуре –28 °С до накопления необходимого количества проб. У 10 практически здоровых добровольцев уровень FGF-23 в сыворотке крови составлял 9-100 пг/мл, уровень белка Klotho - 200-1000 пг/мл. Эти показатели морфогенетических белков в сыворотке крови были приняты нами в качестве нормы для здоровых лиц.

У всех больных собирали подробный анамнез и анализировали симптомы с целью уточнения этиологии ХБП, сопутствующей патологии сердечно-сосудистой системы, длительности АГ, скорости прогрессирования ХБП, наличия или отсутствия остаточной функции почек на момент начала лечения гемодиализом. Оценивали также выраженность синдрома БЭН (БЭН-malnu­trition).

Всем пациентам выполняли общеклинические анализы крови и мочи. Исследование биохимических параметров крови проводили на биохимическом анализаторе Technicon (США) и биохимическом лабораторном аппарате Spectrum («Abbot», США).

О нарушении фосфорно-кальциевого обмена судили по концентрации в сыворотке крови фосфора, кальция и иПТГ, определяемого методом иммунохимического анализа (у здоровых лиц 8-65 пг/мл, при ХПН 150-300 пг/мл).

Всем пациентам измеряли АД (по методу Короткова) и выполняли электрокардиографию. У 49 больных АГ проведена эхокардиография с определением основных параметров деятельности сердца. У 57 больных изучали состояние кровотока в магистральных сосудах, включая артерии почек с помощью ультразвуковой допплерографии. У всех больных определяли общее содержание железа в сыворотке, общую железосвязывающую способность сыворотки, уровень ферритина в сыворотке и насыщение железом трансферрина.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета программ SPSS 10 for Windows. При статистической обработке данных использовали следующие методы и показатели: при анализе распределения переменной рассчитывали частоту отдельных значений (среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и медиану, строили частотные гистограммы); при поиске связей между переменными использовали коэффициент корреляции Пирсона r и ранговый коэффициент корреляции Спирмена p.

Среди обследованных нами 70 больных ХБП от I к VD стадии увеличивался уровень FGF-23 и снижался уровень белка Klotho в сыворотке крови. Наиболее высокий уровень FGF-23 и низкий уровень белка Klotho отмечен в группе больных, получавших лечение регулярным гемодиализом (ГД) (рис. 2).

При сравнении уровня FGF-23 в сыворотке крови у больных с разными стадиями ХБП установлено, что его увеличение по мере снижения СКФ опережает повышение уровня фосфора и иПТГ (рис. 3), начиная с ХБП IIIА стадии, тогда как гиперфосфатемия и повышение уровня иПТГ - с ХБП IV-V стадии (см. рис. 3).

Корреляции между морфогенетическими белками FGF-23, Klotho и показателями фосфорно-кальциевого обмена (фосфор, кальций и иПТГ) у больных ХБП суммированы в табл. 2.

У больных ХБП III-IV стадии с повышением уровня иПТГ в сыворотке, которым проводили лечение парикальцитолом (n=19), снижение уровня белка Klotho в соответствии со степенью почечной недостаточности оказалось менее значимым, чем у больных с ХБП III-IV стадии, леченных альфакальцидолом (n=20); различий между группами по степени снижения в сыворотке концентраций FGF-23 и иПТГ не отмечено (рис. 4).

Кроме того, мы оценили изменения уровня морфогенетических белков в сыворотке в зависимости от величины АД. У обследованных нами 49 больных ХБП с выявленной АГ степень повышения АД прямо коррелировала с уровнем FGF-23 (r=0,452; p<0,01) и обратно - с уровнем белка Klotho (r=–0,687; p<0,01) в сыворотке крови (рис. 5).

У больных АГ также выявлена сильная обратная корреляция между степенью снижения уровня белка Klotho и выраженностью гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), периферического сосудистого сопротивления и частотой выявления кальцификатов в сердце и магистральных артериях (табл. 3).

В то же время у больных, у которых удалось достичь и поддерживать целевой уровень АД, отмечены более высокие уровни белка Klotho и менее выраженная степень ремоделирования миокарда, чем у больных с некорригированной АГ, причем преимущественно среди больных, у которых для коррекции АГ использовались ингибиторы АПФ и блокаторы ангиотензиновых рецепторов.

Мы изучили связь изменений концентрации белка Klotho в сыворотке крови с наличием у больных анемии и показателями обмена железа как важных клинических детерминант прогрессирования ХБП. Нами выявлено, что уровень белка Klotho у больных с анемией ниже, чем у больных без анемии, причем степень снижения уровня белка Klotho прямо коррелировала со степенью снижения концентрации гемоглобина (рис. 6).

Отмечена также сильная корреляция между уровнем белка Klotho в сыворотке и показателями обмена железа - уровнем ферритина в сыворотке крови и процентом насыщения железом трансферрина (табл. 4).

На основании полученных данных правомочен вывод о том, что концентрация белка Klotho в сыворотке крови может служить предиктором выраженности анемии у больных ХБП.

Среди 29 пациентов с ХБП на додиализных стадиях с анемией у 19, получавших лечение эпоэтинами и железа сахаратом, концентрация белка Klotho в сыворотке крови в среднем была выше, чем у 10 пациентов с анемией, не получавших лечение стимулирующими эритропоэз препаратами и железом (рис. 7).

Учитывая обсуждаемые в литературе плейотропные эффекты морфогенетических белков FGF-23 и Klotho, не связанные с их влиянием на показатели фосфорно-кальциевого обмена, мы также проанализировали изменение уровня этих белков в сыворотке крови в зависимости от факторов воспаления (С-реактивный белок - СРБ, протеинурия), а также БЭН (табл. 5).

Выявлена сильная корреляция между уровнем морфогенетических белков в сыворотке крови и протеинурией (особенно белка Klotho), СРБ, БЭН, что свидетельствует о неслучайной связи между этими показателями.

В настоящее время идентифицированы ранее неизвестные факторы, участвующие в регуляции гомеостаза фосфора, витамина D и минерализации костной ткани, а также активно влияющие на механизмы сосудистого и тубулоинтерстициального ремоделирования при ХБП: морфогенетические белки - FGF-23 и Klotho [5, 6, 9-12].

Концентрация FGF-23 в сыворотке крови регулируется почками с помощью клубочковой фильтрации, при снижении которой концентрация FGF-23 в крови повышается. Уровень белка Klotho регулируется проксимальной тубулярной экспрессией, при прогрессировании тубулоинтерстициального фиброза продукция белка Klotho снижается.

Установлено, что повышение уровня FGF-23 в сыворотке крови является компенсаторной реакцией на задержку фосфата, наблюдаемую при снижении СКФ [5, 13-20]. По данным литературы [14-15] и результатам нашего исследования, уровень FGF-23 в сыворотке крови повышается при ХБП по мере снижения СКФ, значительно опережая увеличение концентрации фосфора в сыворотке. Одновременно уровень белка Klotho в сыворотке крови снижается.

На основании полученных нами результатов и данных литературы [5, 16-19] уровень FGF-23 в сыворотке крови повышается у больных ХБП раньше, чем увеличивается концентрация фосфора и ПТГ в сыворотке крови, являясь чувствительным маркером прогноза. К тому времени, когда пациенты достигают терминальной стадии ХПН, уровень FGF-23 в сыворотке крови часто в 100-1000 раз превышает нормальное его содержание, в то время как концентрация фосфора может быть только умеренно повышенной [5, 13, 18-20].

В условиях уменьшения массы действующих нефронов и редукции рецепторов FGF-23 (FGF-R1) в почках влияние FGF-23 при увеличение его уровня в сыворотке может распространяться на любые другие ткани, экспрессирующие FGFR, в частности сосуды и сердце [21-25].

В ряде крупных обсервационных исследований показано, что повышение уровня FGF-23 прямо связано с выраженностью атеросклероза, ГЛЖ и кальцификацией сосудов [18, 26-38].

В исследовании ARMORR с помощью множественного линейного регрессионного анализа установлено, что высокий уровень FGF-23 в сыворотке крови у больных ХБП является предиктором смерти в течение 1-го года диализной терапии независимо от уровня фосфора и ПТГ, в том числе в результате повышения частоты развития ССО [39].

Допускают, что увеличение уровня FGF-23 в сыворотке происходит преимущественно вторично в результате снижения уровня белка Klotho, трансмембранная форма которого служит ко-рецептором для FGF-23 [6, 11, 21].

В недавних экспериментальных исследованиях подтверждено, что внеклеточная часть белка Klotho, секретируемая в кровоток путем протеолитического отщепления внеклеточного домена трансмембранной формы, с помощью мембраносвязанных протеаз ADAM-10 и ADAM-17, может функционировать как гуморальный фактор, который препятствует ДЭ, обеспечивает антиоксидантный, антиапоптотический эффекты и препятствует преждевременному старению [6, 9, 11]. Усиленная экспрессия белка Klotho обеспечивает защиту как почек, так и сердечно-сосудистой системы.

Нефропротективные эффекты белка Klotho изучены на моделях ГН у животных [22]. Трансгенная усиленная экспрессия белка Klotho у экспериментальных животных способствовала регрессу повреждений клубочков и интерстициальной ткани почек, вызывая снижение протеинурии и азотемии [20-24]. Повышение экспрессии белка Klotho у гипертензивных мышей препятствовало прогрессированию АГ, поражению почек и приводило к снижению протеинурии [24, 25]. Считают, что белок Klotho вызывает уменьшение продукции почечного супероксида и супрессию активности NADPH-оксидазы, которая является основным источником активных форм кислорода, вовлекаемых в прогрессирование повреждения тубулоинтерстициальной ткани. Напротив, уменьшение циркулирующей формы белка Klotho в сыворотке крови сопровождается гиперфосфатемией, усилением оксидантного стресса, ДЭ и диффузной кальцификацией сосудов.

В проведенном нами исследовании отмечена корреляция степени повышения в сыворотке крови уровня FGF-23 (прямая) и белка Klotho (обратная) со степенью повышения АД, снижение уровня белка Klotho - с величиной ТЗСЛЖ, индексом периферического сосудистого сопротивления, частотой выявления кальцификатов.

Следовательно, уровень белка Klotho в сыворотке крови является ранним диагностическим маркером формирования хронического кардиоренального синдрома 4-го типа. Этот показатель может быть использован в мониторировании больных ХБП с ССО, в том числе при лечении ингибиторами АПФ, активными метаболитами витамина D, для оценки кардионефропротективного эффекта этого лечения.

В проведенном нами исследовании выявлена прямая ассоциация повышенной концентрации в сыворотке крови FGF-23 и низкой концентрации белка Klotho с наличием воспаления - уровнем СРБ (r=0,370; p<0,01 и r=–0,453; p<0,01) и выраженностью нутритивных нарушений - БЭН (r=0,559; p<0,01 и r=–0,581; p<0,01), уровнем протеинурии (r=0,305; p<0,05 и r=–0,502; p<0,01). Эти данные согласуются с результатами других авторов [11, 14, 27], которые на основании выявления у больных ХБП III-V стадии повышенного уровня СРБ - неспецифического маркера воспаления и ДЭ, рассматривают ХБП как состояние хронического воспаления. Группа ученых из Uppsala University Hospital под руководством M. Mirza [8] показала, что при повышенной экспрессии FGF-23 может нарушаться зависимая от эндотелия вазодилатация у пациентов с СКФ <60 мл/мин/1,73 м². Напротив, в экспериментальной работе

Y. Maekawa и соавт. [29] растворимый рекомбинантный белок Klotho при добавлении к эндотелиальным клеткам пупочной вены HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) человека подавлял экспрессию ими молекул адгезии - ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) и VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule 1), участвующих в патогенезе воспалительных заболеваний сосудов.

У наблюдаемых нами больных активным хроническим ГН (ХБП II-IV стадии) с дефицитом белка Klotho отмечались высокий уровень протеинурии, повышение индексов сопротивления периферических сосудов и стойкое повышение уровня АД. В то же время в экспериментальных исследованиях показано, что повышение экспрессии белка Klotho ведет к уменьшению протеинурии и существенному снижению активности ангиотензина II у гипертензивных мышей с хроническим ГН [11, 28-31]. При этом увеличение экспрессии белка Klotho сочеталось с адекватной фосфатурией и лучшей функциональной способностью почек, т.е. с торможением прогрессирования ХБП.

У трансгенных мышей с ХБП и высокой продукцией белка Klotho выявлена существенно меньшая степень кальцификации сосудов по сравнению с диким типом мышей с ХБП и сниженной продукцией белка Klotho [32]. Благоприятный эффект белка Klotho, выражающийся в предупреждении кальцификации сосудов, был выражен в большей степени, чем его влияние на функцию почек и фосфатурию, что связывают с прямым влиянием циркулирующей формы белка Klotho на сосуды. В исследованиях in vitro показано, что белок Klotho подавляет зависимый от натрия захват эндотелием и гладкими мышечными клетками (ГМК) фосфора, предупреждает дифференциацию ГМК сосудов и минерализацию, индуцируемую гиперфосфатемией [11, 33-35], предотвращая неблагоприятное ремоделирование сосудистой стенки [11, 32].

Наряду с экспериментальными исследованиями в литературе появляются указания на клинические работы о роли белка Klotho как модифицируемого фактора, вовлеченного в патогенез кардиоренальных взаимодействий при ХБП [11, 33].

Возможно, что часть эффектов белка Klotho, благоприятно влияющих на функцию сосудистого эндотелия при ХБП, является результатом уменьшения трансдукции FGF-23 [11, 21].

Эти данные подтверждают, что кальцификацию сосудов следует рассматривать как показатель (свидетельство) в первую очередь нарушения отношения FGF-23/Klotho, а это важно учитывать при индивидуализации подхода к лечению больных ХБП [40-44]. По результатам проведенного нами исследования, изменение отношения FGF-23/Klotho может быть ранним биомаркером степени хронического повреждения почек при ХБП, предшествуя изменениям других устоявшихся маркеров прогрессирования ХБП.

Нами установлено, что с нарушением отношения FGF-23/Klotho коррелируют частота развития анемии и ее выраженность: по мере снижения уровня Hb при прогрессировании ХБП достоверно увеличивалась концентрация в сыворотке крови FGF-23 и снижалась концентрация белка Klotho. У больных с наиболее низким уровнем Hb (68-80 г/л) концентрация FGF-23 превышала таковую у больных с нормальным уровнем Hb почти в 1000 раз. Различия между больными с низким и высоким уровнями Hb по концентрации белка Klotho в сыворотке крови составили 80%. Преимущественно с концентрацией белка Klotho в сыворотке крови прямо коррелировали и основные показатели обмена железа (уровень ферритина в сыворотке крови и насыщение трансферрина железом), причем корреляция была сильная (r=0,539; p<0,01 и r=0,491; p<0,01 соответственно). Корреляция между этими показателями железа и FGF-23 (обратная) была также достоверной, хотя и менее значимой (r=–0,411; p<0,05 и r=–0,454; p<0,05 соответственно). Публикаций о связи концентрации в сыворотке крови FGF-23 и белка Klotho с уровнем Hb мы не обнаружили, имеются лишь единичные сообщения о наличии корреляции между ними и параметрами обмена железа [43, 44]. Можно допустить, что оба этих фактора или один из них принимает участие в регуляции метаболизма железа, но такое предположение нуждается в дальнейших исследованиях.

Полученные нами результаты подтверждают установленный в эксперименте и клинических условиях данные о том, что уровни морфогенетических белков FGF-23 и Klotho в сыворотке крови являются ранними маркерами прогрессирования ХБП, их изменения начинаются уже с IIIА стадии ХБП и прогрессируют по мере нарастания почечной недостаточности. При этом повышение уровня FGF-23 и снижение уровня белка Klotho опережают повышение концентрации фосфора и иПТГ в сыворотке крови по мере снижения СКФ у больных ХБП и коррелирует со степенью повышения АД у больных АГ, с выраженностью ГЛЖ сердца, периферического сосудистого сопротивления, частотой выявления кальцификации магистральных артерий и сердца. Кроме того, выявлены прямая корреляция между степенью снижения концентрации белка Klotho и выраженностью анемии и нарушением обмена железа, корреляция между степенью изменения отношения FGF-23/Klotho и наличием воспаления - уровнем СРБ, БЭН, протеинурией.

Совокупность этих данных обосновывает практическое использование концентрации белка Klotho и FGF-23 в сыворотке крови в качестве ранних диагностических маркеров дисфункции почек, оценки прогноза и совершенствования нефропротективной тактики при ХБП.

Необходимы дальнейшие исследования изменений метаболизма FGF-23 и Klotho в условиях применения ингибиторов АПФ, эпоэтинов, внутривенного железа (сахарозный комплекс железа (III) гидроксида), парикальцитола у больных ХБП для уточнения роли в механизмах нефропротективного эффекта этих средств, увеличения продукции белка Klotho и подавления FGF-23.

В последнее время обсуждается перспектива разработки анти-FGF-23-нейтрализующих антител для лечения больных ХБП, однако их клиническая польза будет ясна в будущем.