Введение

Кишечная микробиота играет ключевую роль в поддержании гомеостаза организма человека [1, 2]. Одним из механизмов, с помощью которого симбиотическая микрофлора кишечника влияет на физиологические процессы хозяина, является выработка биологически активных метаболитов, среди которых короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) рассматриваются как наиболее важные. Они представляют собой органические кислоты с 2—6 атомами углерода и служат важными пищевыми ингредиентами, которые в изобилии встречаются в природе, в основном в виде триглицеридов в растительных маслах и молоке. Тем не менее основным источником КЦЖК у человека является микробная ферментация в дистальных отделах тонкой кишки и в толстой кишке непереваренных пищевых углеводов и эндогенных пептидов. Уксусная (С2), пропионовая (С3) и масляная (С4) кислоты составляют более 95% КЦЖК с предполагаемым соотношении в кишечнике и кале примерно 3:1:1. Их пропорции могут варьировать в зависимости от рациона питания, состава микробиоты, генотипа хозяина и места ферментации [3]. В просвете кишечника КЦЖК служат основным источником энергии для колоноцитов, увеличивают выработку муцина и антимикробных пептидов, модулируют транскрипцию белков плотных контактов, количество и функции регуляторных Т-клеток, снижают уровни цитокинов, индуцируют апоптоз, поддерживая функциональность эпителиального кишечного барьера и препятствуя возникновению воспалительных реакций. Более того, попадая в системный кровоток, КЦЖК играют важную роль в регуляции аппетита, энергетического обмена, артериального давления, реакций адаптивного иммунитета, а также секреции некоторых гормонов [4].

Результаты многочисленных исследований убедительно свидетельствуют о том, что снижение содержания КЦЖК тесно связано с развитием широкого круга заболеваний, включая энтеропатии, ожирение, сахарный диабет, аутизм, тяжелую депрессию, рак толстой кишки и хроническую болезнь почек (ХБП) [3, 5, 6]. По этой причине КЦЖК представляют собой новую терапевтическую мишень, а кроме того, могут обеспечить более быстрый, надежный и дешевый метод диагностики дисбактериоза кишечника [7]. Между тем в связи со значительным влиянием индивидуальных и средовых факторов на состав кишечной микробиоты особый научный интерес представляет изучение содержания КЦЖК у наиболее тяжелой категории больных ХБП, а именно у лиц с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН), получающих лечение гемодиализом.

Цель исследования — изучить профиль КЦЖК в кале и содержание некоторых продуцирующих их кишечных бактерий у пациентов, получающих программный гемодиализ.

Материал и методы

В исследование включены 30 пациентов, получающих лечение программным гемодиализом не менее 6 мес, и 20 сопоставимых по полу, возрасту, индексу массы тела (ИМТ) и статусу курения добровольцев без нарушения функции почек.

Лабораторные тесты включали клинический и биохимический анализы крови, оценку уровня C-реактивного белка (СРБ) и фибриногена. Спектр КЦЖК в образцах кала исследовался методом газожидкостной хроматографии. Содержание основных бактерий, продуцирующих КЦЖК, оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с помощью коммерческого набора «Колонофлор 16 Премиум» (ООО «Компания Альфа-Лаб», Россия).

Критерии исключения: острые воспалительные и некомпенсированные хронические заболевания; активная онкологическая патология; энтеропатии (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, целиакия и др.); вирусные гепатиты; операции на органах желудочно-кишечного тракта, а также прием антибактериальных препаратов, пребиотиков и пробиотиков в предшествующие исследованию 6 мес.

Статистическая обработка данных проведена с помощью программы SPSS Statistics 26. Ввиду небольшого количества наблюдений численные величины всех параметров представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q₂₅—Q₇₅). Качественные признаки представлены как абсолютное количество и процент от общего числа. Сравнение групп по количественным показателям выполнено с помощью критерия Манна—Уитни. Для сравнения качественных переменных использовали критерий хи-квадрат Пирсона. Взаимосвязь между изученными показателями оценивали с применением коэффициента корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 во всех тестах.

Проведение данной работы одобрено локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны России (протокол №262 от 26.04.2022). Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Результаты

В табл. 1 представлена подробная клиническая и демографическая информация о пациентах, включенных в исследование. Между группами наблюдались статистически значимые различия по уровню гемоглобина, альбумина, креатинина, мочевой кислоты и биомаркеров воспаления (скорости оседания эритроцитов (СОЭ), СРБ, фибриногена), что является типичным для ТПН. При этом все субъекты контрольной группы имели контролируемую артериальную гипертензию, оптимальные или субоптимальные показатели липидного обмена, компенсированный сахарный диабет при его наличии.

Таблица 1. Основная клинико-демографическая характеристика участников исследования

Примечание. ТПН — терминальная почечная недостаточность; ИМТ — индекс массы тела; ХБП — хроническая болезнь почек; СД — сахарный диабет; СОЭ — скорость оседания эритроцитов.

Общее содержание КЦЖК в кале, включая уровни уксусной (С2), пропионовой (С3), масляной (С4) кислот, а также суммарная концентрация изокислот — изомасляной (С4), изовалериановой (С5) и изокапроновой (С6) — у пациентов, получающих программный гемодиализ, были значительно снижены по сравнению с показателями у лиц контрольной группы (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение показателей короткоцепочечных жирных кислот в образцах кала у лиц исследуемых групп

Изменения профиля КЦЖК оценивали по процентному содержанию каждой из кислот С2—С4, приняв их сумму за 100%. У больных ТПН наблюдалось значительное снижение доли пропионовой кислоты (p=0,021), в то время как относительное содержание уксусной (p=0,599) и масляной (p=0,669) кислот статистически значимо не различалось между группами (рисунок). Данные изменения косвенно свидетельствуют о преобладании активности анаэробной флоры над аэробной флорой, а также об активизации условно-патогенных микроорганизмов.

Профиль короткоцепочечных жирных кислот у пациентов с терминальной почечной недостаточностью и лиц контрольной группы.

Относительное содержание изокислот (изоC4+ изоC5+изоC6), так же как и соотношение суммарного содержания кислот с разветвленной цепью (изомеров) к кислотам с неразветвленной цепью (изоCn/Cn), было сопоставимым у пациентов, получающих программный гемодиализ, и здоровых добровольцев. Как известно, более высокие значения этих показателей характеризуют повышенную протеолитическую активность кишечной микробиоты. Окислительно-восстановительный потенциал внутрипросветной микрофлоры изучали по значению анаэробного индекса (АИ), который рассчитывается как отношение суммы абсолютного содержания пропионовой и масляной кислот к уровню уксусной кислоты. Статистически значимых различий АИ между группами не было (см. табл. 2). Между тем дополнительный анализ позволил установить, что у 15 (50%) больных с ТПН анаэробный АИ снижен [–0,72 (–0,82— –0,64)] по сравнению с контролем (p<0,001), что свидетельствует о преобладании у них анаэробных популяций микроорганизмов. Еще у 15 (50%) больных этой группы АИ смещен в сторону слабоотрицательных значений [–0,27 (–0,36— –0,22)] и также статистически значимо отличался от контроля (p<0,001). Такой тип изменений можно охарактеризовать как аэробный.

Из изученных факторов системного воспаления дисбаланс КЦЖК наиболее убедительно отразился только на уровне СРБ, который коррелировал с общим содержанием КЦЖК (r= –0,477; p=0,008), абсолютным содержанием пропионовой кислоты (r= –0,472; p=0,008), масляной кислоты (r= –0,547; p=0,002), изокислот (r= –0,565; p=0,001) и АИ (r=0,749; p<0,001).

У всех обследованных пациентов с ТПН также имелись признаки кишечного дисбактериоза за счет уменьшения количества бактерий, участвующих в синтезе КЦЖК. Так, клинически значимое снижение титра Bifidobacterium spp. выявлено у 11 (36,7%), Lactobacillus spp. — у 19 (63,3%), Faecalibacterium prausnitzii — у 8 (26,7%), Eubacterium rectale — у 13 (43,3%), Roseburia inulinivorans — у 7 (23,3%), Blautia spp. — у 21 (70%), Ruminococcus spp. — у 8 (26,7%) больных, чего практически не наблюдалось у лиц с нормальной функцией почек (табл. 3). Кроме того, по сравнению с контролем больные, получающие программный гемодиализ, характеризовались значительным снижением в фекальных образцах общей численности Prevotella spp. и Akkermansia muciniphila. В то же время статистически значимых различий в содержании Bacteroides spp. не было.

Таблица 3. Частота выявления клинически значимого снижения количества некоторых бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты, у пациентов, получающих программный гемодиализ, и у лиц с нормальной функцией почек

Обсуждение

Насколько нам известно, это первое исследование, в котором в российской популяции пациентов, получающих программный гемодиализ, одновременно изучалось содержание фекальных КЦЖК и продуцирующих их бактерий. Результаты показали выраженное снижение концентрации уксусной, пропионовой, масляной кислот и изокислот у больных группы ТПН по сравнению с лицами контрольной группы. При этом профиль КЦЖК с неразветвленной цепью у пациентов с ТПН характеризовался статистически значимо более низким относительным содержанием пропионовой кислоты. Полученные нами данные согласуются с результатами ранее проведенных исследований, которые показали, что уровни масляной кислоты у здоровых добровольцев были в 3 раза выше, чем у лиц с ХБП [8]. I.W. Wu и соавт. также обнаружили значительно более низкие уровни пропионовой кислоты в сыворотке крови у пациентов с ХБП IV—V стадий по сравнению с группой без нарушения функции почек [9].

Различия в концентрациях КЦЖК соответствовали снижению содержания продуцирующих их бактерий. Относительно небольшой размер и сильная гетерогенность обследованной когорты не позволили нам изучить причинно-следственную связь между этими явлениями. Вместе с тем хорошо известно, что дисбактериоз кишечника является основным фактором, способствующим снижению выработки КЦЖК при ХБП [10]. Большинство проведенных к настоящему времени исследований убедительно свидетельствуют об уменьшении у больных с этой патологией относительного обилия бактерий, синтезирующих КЦЖК (Prevotellaceae, Lactobacillaceae, Roseburia, Faecalibacterium, Bifidobacterium, Prevotella, Ruminococcaceae и др.). Колонизация протеолитических видов бактерий (преимущественно энтеробактерий и анаэробных энтерококков), продуцирующих уремические токсины, напротив, увеличивается [11, 12]. Этому в значительной степени способствуют компенсаторная секреция в просвет кишечника продуктов азотистого обмена, а также необходимость соблюдения диеты с ограниченным потреблением резистентного крахмала и клетчатки [10]. В настоящей работе показаны статистически значимые различия для всех исследованных микроорганизмов, за исключением Bacteroides spp., R. inulinivorans и Ruminococcus spp., частота снижения их содержания сопоставима между группами. Вероятнее всего, это также связано с небольшим количеством наблюдений и ограниченными возможностями использованного нами метода изучения состава кишечной микрофлоры.

Статистически значимое снижение абсолютного уровня изокислот у больных, получающих программный гемодиализ, указывало на увеличение содержания бактерий, ферментирующих пептиды. Однако этому противоречило отсутствие статистически значимых различий в показателях относительного содержания изоCn и коэффициента изоCn/Cn, что означает необходимость более точного профилирования кишечной микробиоты с использованием современных молекулярно-биологических методов.

Широкая вариабельность АИ, по нашему мнению, могла быть связана с влиянием исходной патологии, приведшей к ТПН, на преобладание аэробной или анаэробной флоры у отдельных пациентов. Межу тем профиль КЦЖК у больных этой группе в целом свидетельствовал об угнетении строгих анаэробов при сопутствующем увеличении численности факультативных анаэробов и условно-патогенной микрофлоры, что согласуется с результатами ранее проведенных исследований [13].

Согласно полученным авторами данным, снижение содержания КЦЖК и нарушение их профиля статистически значимо коррелировало с повышенным уровнем СРБ. КЦЖК модулируют воспаление как в кишечнике, так и во внекишечной среде посредством рекрутирования лейкоцитов и выработки хемокинов. Они также влияют на функцию Т-лимфоцитов путем ингибирования гистондеацетилаз и активации сигнальных путей через рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), в том числе GPR109A, GPR41 и GPR43. Экспрессия GPR43 выявлена во всем желудочно-кишечном тракте, включая нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки, что указывает на роль КЦЖК в иммунных реакциях [14]. Более того, КЦЖК напрямую воздействуют на Т-лимфоциты, способствуя их дифференцировке в различные субпопуляции, включая Th1, Th17 и Tregs. КЦЖК также ингибируют синтез провоспалительных цитокинов кишечными макрофагами и стимулируют выработку противовоспалительного цитокина ИЛ-10 и секреторного IgA [15]. Эти данные могут служить доказательством того, что продуцируемые кишечной микробиотой КЦЖК, по крайней мере частично, участвуют в противовоспалительных реакциях у лиц с ХБП.

Следует отметить, что клиническое значение снижения содержания КЦЖК у больных с патологией почек являлось предметом особого интереса исследователей в последние годы. Модификация состава микробиоты кишечника и стимулирование синтеза КЦЖК неоднократно изучались в качестве средств профилактики и лечения ХБП. Учитывая многофакторную природу биосинтеза КЦЖК, для повышения их уровня можно использовать несколько стратегий, такие как прямое энтеральное или парентаральное введение, различные диетические вмешательства, применение пребиотиков и/или пробиотиков, трансплантация фекальной микробиоты [16]. В работах на экспериментальных животных продемонстрировано, что лечение ацетатом или КЦЖК-продуцирующими бактериями замедляет прогрессирование острого повреждения почек и ХБП благодаря их антифибротифибротическим эффектам, ингибирующему действию на Th17-клетки, провоспалительные цитокины и активные формы кислорода [8, 17, 18]. В клинических исследованиях у больных, получавших лечение гемодиализом и принимавших добавки с пропионатом натрия, выявлено значительное снижение уровней СРБ, ИЛ-2, ИЛ-17, ИЛ-6 и гамма-интерферона при выраженном повышении уровня ИЛ-10. Через 4 нед после окончания лечения все параметры снова ухудшились [19].

Повышать уровень КЦЖК и замедлять развитие ХБП также может потребление продуктов с пищевыми волокнами и резистентным крахмалом [20]. Как показало исследование V.M. Krishnamurthy и соавт., применение пищевых волокон связано с более низким риском воспаления и смертности, причем данная ассоциация была сильнее выражена у пациентов с патологией почек, чем без нее [21]. В работе J.A. Kemp и соавт. дополнительный прием в течение 4 нед резистентного крахмала приводил у больных на гемодиализе к увеличению количества бактерий, продуцирующих КЦЖК, Roseburia и Ruminococcus gauvreauii, и снижению провоспалительных показателей [22]. Преимущества ежедневного потребления продуктов с высоким содержанием клетчатки для выработки большего количества КЦЖК продемонстрированы и у пациентов с диабетической нефропатией [23]. Диетотерапия, основанная на низком потреблении белка, по данным I.W. Wu и соавт., также улучшает у лиц с ХБП функцию почек, снижает уровни уремических токсинов индоксил сульфата и п-крезил сульфата и увеличивает популяцию бактерий, продуцирующих масляную кислоту (семейства Lachnospiraceae и Bacteroidaceae) [24].

Согласно результатам недавнего систематического обзора и метаанализа 21 рандомизированного контролируемого исследования, добавки с пробиотиками/синбиотиками, по-видимому, эффективны в улучшении показателей функции почек и воспаления у лиц с ХБП. Анализы в подгруппах имели высокую степень неоднородности, но показали, что благоприятные эффекты от приема этих средств в большей степени связаны с длительностью их приема [25]. В небольшом числе клинических отчетов продемонстрированы оптимистические результаты трансплантации фекальной микробиоты у пациентов с заболеваниями почек, включая снижение уровня протеинурии и улучшение ряда лабораторных показателей. Данная методика находится на ранних стадиях изучения эффективности и безопасности, но является многообещающим способом коррекции тяжелого дисбактериоза у лиц с ХБП [26].

Таким образом, терапевтические стратегии, направленные на повышение уровня КЦЖК, в будущем могут стать эффективным инструментом замедления прогрессирования ХБП, а также связанных с ней кардиоваскулярных и других осложнений.

Заключение

Предварительные данные настоящего исследования представляют дополнительные доказательства значительного снижения уровня короткоцепочечных жирных кислот и продуцирующих их бактерий у больных, получающих программный гемодиализ, что связано с повышением активности системного воспаления. В нашей стране выполняется небольшое количество клинических исследований, посвященных изучению особенностей кишечного дисбактериоза у лиц с терминальной почечной недостаточностью, поскольку доступность современных высокоинформативных метагеномных и матаболомных методов изучения кишечной микробиоты крайне ограниченна. В этом отношении полученные авторами результаты, даже несмотря на отдельные методологические ограничения, являются уникальными и оправдывают последующие работы в более крупных популяциях, которые должны определить истинное клиническое значение снижения содержания короткоцепочечных жирных кислот у пациентов с хронической болезнью почек, а также клиническую эффективность терапевтических вмешательств, направленных на коррекцию их содержания. Кроме того, определение содержания и профиля короткоцепочечных жирных кислот в образцах кала в будущем может быть использовано в качестве быстрого и недорогого метода диагностики дисбактериоза кишечника.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Пятченков М.О.

Сбор и обработка материала — Пятченков М.О., Щербаков Е.В., Трандина А.Е.

Статистический анализ данных — Щербаков Е.В.

Написание текста — Пятченков М.О., Глушаков Р.И.

Редактирование — Бельских А.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution:

Study design and concept — Pyatchenkov M.O.

Data collection and processing — Pyatchenkov M.O., Shcherbakov E.V., Trandina A.E.

Statistical analysis — Shcherbakov E.V.

Text writing — Pyatchenkov M.O., Glushakov R.I.

Editing — Belskykh A.N.