В патогенезе воспаления при язвенном колите (ЯК) и болезни Крона (БК) большое внимание уделяется молекулам адгезии [1-3]. Они вызывают миграцию клеток из сосудистого русла в очаг воспаления, т.е. способствуют усилению воспалительной инфильтрации слизистой оболочки и миграции лимфоцитов в лимфатические узлы. Активность эндотелиальных клеток и их участие в развитии воспаления не менее важны, чем влияние клеток воспалительного инфильтрата, и зависит как от их основных функций, так и взаимодействия между лейкоцитарными и эндотелиальными молекулами адгезии и цитокинами в разные фазы воспаления.

Известны 3 семейства молекул адгезии: интегрины (гетеродимерные молекулы, функционирующие как клеточно-субстратные, так и межклеточные адгезивные рецепторы); селектины, лектинподобный домен которых обеспечивает адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам; адгезивные рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов, участвующие в межклеточной адгезии, в том числе эндотелиальных клеток мелких сосудов.

Семейство интегринов. Наиболее важным для миграции клеток считается интегрин sVCAM-1, который связывается с ICAM-1 и ICAM-2 с помощью цепей LFA-1 (αLβ2). Экспрессия ICAM-1 индуцируется с помощью sVCAM-1. Интегрин (sVCAM-1) экспрессируется на лимфоцитах, лейкоцитах, эозинофилах. Он играет первостепенную роль в миграции нейтрофилов в очаге воспаления. Провоспалительные цитокины, особенно α-фактор некроза опухоли (α-ФНО), интерлейкины (ИЛ) 1, 4, 13 стимулируют выработку интегрина sVCAM-1 из лейкоцитов, вызывая его миграцию в очаг воспаления [4-7].

Селектины. Описаны 3 семейства селектинов: L, P и Е [8-11].

L-селектин экспрессируется на лимфоцитах и имеет прямое отношение к их миграции. Данный белок также представлен на лейкоцитах, нейтрофилах, моноцитах и других миелоидных клетках. L-селектин опосредует эффект «катящихся» нейтрофилов вдоль сосудистой стенки микроциркуляторного русла - феномен, который многие исследователи рассматривают как первый «шаг» адгезии лейкоцитов к эндотелию, что в свою очередь приводит к их накоплению в зоне воспаления.

Р-селектин экспрессируется на эндотелиальных клетках. Появление P-селектина на поверхности происходит очень быстро и также быстро снижается его уровень до базального в короткое время после стимуляции. Выработку Р-селектина стимулируют тромбин, гистамин, Н2О2. Он может действовать совместно с E-селектином, осуществляя на местах в ранний период воспаления специфическую адгезию нейтрофилов и моноцитов в участках острого процесса.

E-селектин экспрессируется эндотелиальными клетками после стимуляции цитокинами ИЛ-1α, α-ФНО.

С использованием молекул адгезии происходит миграция лейкоцитов к месту повреждения (воспаления) тканей. Она осуществляется в три этапа: 1 - адгезия к активированным эндотелиальным клеткам, к поверхности лейкоцитов; 2 - проникновение через эпителий; 3 - перемещение в направлении очага инфекции или воспаления под влиянием хемотаксиса [12, 13]. В процессе адгезии лейкоцитов в настоящее время выделяют 3 фазы. Первая фаза характеризуется тем, что движение лейкоцитов по венуле замедляется. Они как бы катятся по эндотелию, постепенно замедляя свое движение. Этот процесс обычно связан с взаимодействием селектинов, тормозящих движение лейкоцитов. Вторая фаза - активация, при которой лейкоциты подвергаются воздействию цитокинов, хемокинов и других агентов. Третья фаза - прикрепление. Она характеризуется полной остановкой движения, прикреплением лейкоцитов к клеткам эндотелия сосудов и подготовкой к проникновению в межэндотелиальное пространство. Этот эффект возникает благодаря взаимодействию многочисленных молекул адгезии. Сигналы, поступающие в лейкоцит при таком взаимодействии, оказывают дополнительное активирующее действие. Фазность экспрессии молекул адгезии на поверхности эпителиальных клеток определяет и фазность миграции клеток различного типа в очаг поражения. Так, считается, что именно ранняя экспрессия Е-селектина на поверхности эндотелиальных клеток обеспечивает адгезию к ним нейтрофилов. В дальнейшем именно нейтрофилы первыми мигрируют в очаг воспаления. Для моноцитов и некоторых лимфоцитов, мигрирующих после нейтрофилов, важную роль играет экспрессия на их поверхности молекул р2-интегринов (LFA-1 и CR-3). Они связываются с эндотелиальными адгезинами ICAM-1 и ICAM-2, которые в свою очередь экспрессируют sVCAM-1. Таким образом, нейтрофилы появляются в очаге острого воспаления на его ранней стадии; отчасти это обусловлено индукцией цитокинами экспрессии Е-селектина на поверхности эндотелия в этой области. Стимуляция клеток эндотелия in vitro такими цитокинами, как α-ФНО или ИЛ-1, индуцирует экспрессию Е-селектина спустя 4-12 ч, а через 24 ч она прекращается. Экспрессия Р-селектина происходит в течение очень короткого времени, при воздействии на эндотелий тромбина, гистамина, фактора активации тромбоцитов, компонентов системы комплемента и некоторых других стимулов.

В условиях in vitro индуцированная экспрессия ICAM-1 наблюдается в период от 8 до 96 ч после стимуляции, что соответствует более позднему поступлению в очаг воспаления лимфоцитов и моноцитов. Экспрессия sVCAM-1, как и ICAM-1, индуцируется в области воспаления, причем индукция этих двух молекул происходит синхронно.

В большинстве случаев острого воспаления внутрисосудистые перемещения лейкоцитов и их эмиграция занимают несколько часов. Как правило, первыми в очаг воспаления выходят нейтрофилы, они обнаруживаются в воспаленной ткани уже через 6-24 ч. Несколько позднее эмигрируют моноциты и лимфоциты (24-48 ч). Такая асинхронность эмиграции клеток обусловлена неодновременным появлением молекул адгезии и хемотаксических факторов, специфичных для разных лейкоцитов.

Исследования роли молекул адгезии в воспалении проводились главным образом у больных с системной красной волчанкой [14], различными формами ишемической болезни сердца [15]. Значительно меньше работ посвящено этой проблеме у больных с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК). Так, В.В. Павленко и соавт. [16] оценили значение растворимых изоформ молекул адгезии клеток (ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин) в период рецидива ЯК. Авторы установили, что концентрация ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в сыворотке крови имеет существенное значение для оценки активности иммунопатологического процесса при этом заболевании.

Цель исследования заключалась в определении значения молекул адгезии интегрина sVCAM-1 и селектинов P, E и L для оценки прогноза и эффективности терапии язвенного колита (ЯК) и болезни Крона (БК).

В отделении патологии кишечника ЦНИИГ обследовали 40 больных с ВЗК: 26 с ЯК и 14 с БК. Средний возраст больных составил 39,3±2,3 года (М±σ) - от 19 до 65 лет. У 13 больных ЯК был левосторонним, у 3 - субтотальным и у 10 - тотальным. В соответствии с Венской классификацией у 6 больных БК воспалительный процесс локализовался в терминальном отделе подвздошной кишки (L1), у 3 - в толстой кишке (L2) и у 5 - в тонкой и толстой кишках (L3). Фенотип БК у всех больных соответствовал воспалительной (люминальной) форме (В1).

У всех больных наблюдалось хроническое рецидивирующее гормонозависимое течение ВЗК длительностью от 5 до 8 лет (5,5±3,4 года). Индекс активности ЯК по Rachmilewitz в среднем составлял 9±1 балл. Индекс активности болезни Крона (CDAI) находился в пределах от 150 до 280 баллов.

В зависимости от особенностей терапии больные разделены на 3 группы. В 1-ю группу вошли 10 больных (ЯК у 7, БК у 3), которые длительно получали азатиоприн (АЗА) в дозе 2 мг/кг и глюкокортикостероиды (ГКС), во 2-ю группу - 16 больных (ЯК у 7 и БК у 9), получавшие инфликсимаб (ИНФ) в дозе 5 мг/кг по стандартной схеме (0, 2, 6 и далее каждые 8 нед), в 3-ю группу - 14 больных (ЯК у 11 и БК у 3), которым вводили мезенхимальные стромальные стволовые клетки (МССК) в количестве 150·10⁸. МССК вводили капельно внутривенно в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида с добавлением гепарина (10 ед/мл).

У всех больных при поступлении в клинику до и после лечения исследовали уровень лейкоцитов, палочкоядерный сдвиг, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивный белок (СРБ), определяли концентрацию молекул адгезии (L-селектин, Е-селектин, Р-селектин, а также интегрин sVCAM-1).

Исследования крови выполняли на полуавтоматическом гематологическом анализаторе ADVIA 60 («Bayer Health Care») и биохимическом анализаторе Olympus AU 400 c использованием специальных реактивов («Olympus», Германия). Уровень интегрина sVCAM-1, селектинов (ELAM) L, P, Е в сыворотке крови исследовали иммуноферментным методом с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (С.-Петербург), Orgentec (Германия), Евроиммун, Ведалаб (Франция). Всем больным выполняли колонофиброскопию (КФС) с илеоскопией и гистологическим исследованием слизистой оболочки пораженных отделов кишечника. Эндоскопическое исследование осуществляли на видеосистеме Фуджинон EC-450WI5. Гистологическое исследование проводили с помощью световой микроскопии (система автоматического анализа видеоизображений «Cito-W», Dia-Morph).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Статистика 6,0 с применением методов малых выборок: для анализа количественных признаков использовали критерий Стьюдента и парный критерий Стьюдента.

У больных 1-й группы, получавших АЗА и ГКС, полная клиническая и эндоскопическая ремиссия не наступила: сохранялась диарея - стул до 2-3 раз в сутки с примесью крови, боли в животе в проекции ободочной кишки, лихорадка в вечернее время до 37,1-37,3 °С, масса тела увеличилась не более чем на 2-3 кг. В клинических анализах крови сохранялись увеличенная СОЭ (13±6,13 мм/ч), лейкоцитоз (8,93±1,21 тыс.), СРБ (15,02±7,87 мг/л) (табл. 1).

При эндоскопическом исследовании у всех больных сохранялись признаки активного воспаления слизистой оболочки кишки (СОК). CDAI составил 280±80 баллов. При морфологическом исследовании сохранялась воспалительная инфильтрация собственной пластинки, лейкоцитарная инфильтрация в подслизистом слое.

На рис. 1 показано влияние лечения на уровень молекул адгезии у больных 1-й группы.

Исходный уровень селектинов у всех больных был повышенным: концентрация Е-селектина составляла в среднем 12,4±3,0 нг/мл , L-селектина -10,6±0,6 нг/мл, интегрина sVCAM-1 - 27,2±7,3 нг/мл, Р-селектина - 9,7±1,4 нг/мл. Через 2 мес лечения уровень Р-селектина снизился до 6,6±1,4 нг/мл (р<0,01). Уровень остальных молекул адгезии существенно не изменился. Так, концентрация Е-селектина составляла 11,4±2,5 нг/мл (р=0,35), L-селектина - 9,2±1,8 нг/мл (р=0,01), sVCAM-1 - 28,2±5,3 нг/мл (р=0,7).

У больных, получавших ИНФ, через 2 мес наступила клиническая и эндоскопическая ремиссия: стул стал оформленный 2-3 раза в сутки, исчезла примесь крови, стихли боли в животе, снизилась до нормы температура тела, масса тела увеличилась на 2-3 кг. У всех больных удалось снизить постепенно дозу преднизолона до 15-20 мг/сут вплоть до полной отмены при условии сохранения ремиссии ВЗК. В клинических анализах крови число лейкоцитов уменьшилось с 10±1,03 до 6,68±0,71 тыс., СОЭ снизилась с 35,43±7,30 до 17,86±3,16 мм/ч, исчез палочкоядерный сдвиг с 5,30±0,78 до 1,73±0,29%, уровень СРБ снизился до нормы с 13,89±2,58 до 4,33±0,86 мг/л. CDAI составил 200±40 баллов.

У всех больных уменьшились воспалительные изменения по данным как эндоскопии, так и гистологического исследования CОК (рис. 2).

На рис. 3 отражено влияние лечения ИНФ на уровень молекул адгезии у больных 2-й группы.

У больных 2-й группы при эндоскопическом исследовании через 2 мес после введения МССК отмечалось уменьшение воспалительных изменений СОК (табл. 2).

У 14 больных 3-й группы, получивших МССК, также достигнута клиническая и эндоскопическая ремиссия (табл. 3).

Уровень молекул адгезии у больных с ВЗК до и после введения МССК представлен на рис. 5.

В табл. 4 отражена концентрация молекул адгезии в сыворотке крови у больных 3 групп до и после лечения.

При стандартной терапии у больных с ВЗК наряду с сохраняющимися клинико-лабораторными и эндоскопическими признаками активности воспаления остается повышенным уровень молекул адгезии, что подтверждает недостаточный противовоспалительный эффект ГКС и АЗА. Применение ИНФ способствовало как наступлению клинико-эндоскопической ремиссии ВЗК, так и достоверному снижению уровней P-селектина, E-селекти­на и интегрина sVCAM-1, участвующих в формировании и подавлении воспалительной реакции в СОК. Введение МССК вызывает достоверное снижение уровней Р-селектина, Е-селектина и тенденцию к снижению интегрина sVCAM-1, так как последний обеспечивает более позднее поступление в очаг воспаления лимфоцитов и моноцитов, что требует длительного применения МССК с целью достижения более глубокой ремиссии заболевания.

Уровни P-селектина, E-селектина, интегрина sVCAM-1, отражающие острую фазу воспаления, снижались после индукционной терапии ИНФ. Уровень L-селектина, являясь отражением хронического аутоиммунного воспаления, после введения МССК и индукционной терапии ИНФ практически не снижался. Поэтому концентрация L-селектина может служить маркером хронического воспаления и показателем продолжительности противовоспалительной терапии, что имеет прогностическое значение.

Таким образом, P-селектин, E-селектин, L-селектин, интегрин sVCAM-1 являются современными маркерами воспаления и могут использоваться для оценки качества клинико-эндоскопической ремиссии и прогноза течения ВЗК.