АГ — артериальная гипертония

АСБ — атеросклеротическая бляшка

ГМК — гладкие мышечные клетки

ГХС — гиперхолестеринемия

ДИ — доверительный интервал

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИМ — инфаркт миокарда

ОШ — отношение шансов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания

Cx37 — коннексин-37

eNOS — эндотелиальная NO-синтаза

Инфаркт миокарда (ИМ) представляет важную медицинскую и социальную проблему, поскольку стал одной из ведущих причин инвалидности и вносит значительный вклад в структуру смертности во всем мире. Доказано, что причиной большинства ИМ служит внутрисосудистый тромбоз, возникающий, как правило, на месте атеросклеротической бляшки (АСБ) с поврежденной поверхностью [1]. При этом бляшки, вызывающие ИМ, чаще всего являются неокклюзирующими и сужают просвет артерии в среднем на 48% [2]. Такие поражения, как правило, гемодинамически не значимы и не приводят к возникновению типичных симптомов стенокардии. Соответственно лица с подобными АСБ в большинстве случаев считаются практически здоровыми, поэтому возникновение у них ИМ представляется внезапным событием. Ситуация усугубляется тем, что не разработано надежных методов доклинической диагностики ИМ.

В развитии ИМ существенную роль играют генетически обусловленные вариации активности белков, вовлеченных в патогенез атеросклероза и его осложнений [3—5]. Поскольку для многих генетических факторов не существует биохимических или иных коррелятов, поддающихся измерению у пациентов, наиболее перспективным направлением в доклинической диагностике и прогнозировании развития ИМ у лиц без клинических проявлений ишемической болезни сердца (ИБС) представляется метод прямого генотипирования.

Ранее нами выявлена связь полиморфизма ряда генов с развитием ИБС и ИМ у мужчин моложе 55 лет [6, 7]. Эта связь, в частности, подтверждена для генов эндотелиальной NO-синтазы (eNOS, полиморфизм G894T) и коннексина-37 (Cx37, полиморфизм C1019T) [7].

Коннексины — политопные интегральные мембранные белки; 6 коннексинов образуют коннексон, а 2 коннексона в плазматических мембранах контактирующих клеток, располагаясь друг напротив друга, формируют непрерывный канал, соединяющий внутреннее содержимое двух клеток. Сх37 в организме человека экспрессируется, в частности, в эндотелии и моноцитах. По мере прогрессирования атеросклероза Сх37 начинает экспрессироваться также в гладких мышечных клетках (ГМК), находящихся под АСБ [8]. Cx37 участвует в адгезии моноцитов, опосредуя взаимодействие между эндотелием и ГМК сосудов и в настоящее время обсуждается как важный молекулярный фактор, вовлеченный в развитие атеросклероза [9]. В то же время функциональное значение указанного полиморфизма гена Cx37 остается не изученным.

eNOS постоянно экспрессируется в эндотелии сосудов, катализируя образование оксида азота (NO) из L-аргинина. Замена гуанина тимином в 894-й позиции гена NO-синтазы 3-го типа приводит к замене глутамина аспарагином в 298-й позиции самого фермента (Glu298Asp). Молекулярные исследования продемонстрировали отсутствие различий по ферментативной активности между аллельными вариантами eNOS [10], однако при исследовании нативных сосудов показано снижение каталитической активности у носителей аллеля Т eNOS [11].

В последнее время появились сведения об экспериментах in vitro, показывающих возможное взаимодействие Сх37 с eNOS [12]. Согласно полученным данным интенсивность взаимодействия не связана с генетическим полиморфизмом, однако в связи с большой значимостью NO в развитии сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) представляется важным совместное изучение этих двух белков.

Целью работы являлось определение роли полиморфизма генов Cx37 и eNOS в развитии ИМ у лиц без коронарного анамнеза.

В исследование включили 183 мужчин в возрасте от 26 до 55 лет с клинически и инструментально подтвержденным диагнозом ИМ; возраст развития ИМ моложе 55 лет. Критериями исключения были нарушение толерантности к глюкозе и сахарный диабет. Перенесенный ИМ подтвержден отклонением от нормы биохимических маркеров (фракция МВ креатинфосфокиназы, кардиоспецифичных тропонинов Т и I) и типичными изменениями на электрокардиограмме. Артериальную гипертонию (АГ) диагностировали на основании следующих критериев: систолическое артериальное давление >140 мм рт.ст. или диастолическое артериальное давление >90 мм рт.ст. в отсутствие антигипертензивной терапии и длительностью анамнеза АГ >1 года. Ожирение констатировали на основании индекса массы тела ≥30 кг/м². Гиперхолестеринемию (ГХС) диагностировали на основании повышения уровня общего холестерина ≥5,3 ммоль/л. Из числа включенных в исследование у 56 (30,6%) ИМ развился на фоне клинически и инструментально подтвержденной ИБС (кроме ИМ), а у 127 (69,4%) — без предшествующих клинических признаков ИБС.

Идентификация полиморфизма генов. ДНК выделяли из венозной крови методом фенолхлороформной экстракции. Полиморфизм генов идентифицировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. ПЦР проводили на термоциклере SpeedCycler («Analytik Jena», Германия) с применением соответствующих праймеров и готовой реакционной смеси DreamTaq Green PCR Master Mix («Fermentas», Латвия). Визуализацию результатов осуществляли путем электрофореза в 2% агарозном геле с бромистым этидием при 4 В/см. Условия проведения генотипирования для каждого гена представлены в табл. 1.

Статистический анализ. Нормальность распределения количественных признаков оценивали при помощи критерия Шапиро—Уилка. В случае нормального распределения значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, для значений, не распределенных нормально, использовали U-критерий Манна—Уитни. Данные представлены в виде медианы (интерквартильный размах). Статистическую значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивали при помощи критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность для таблиц 2×2. В случае неприменимости данного критерия использовался двусторонний точный критерий Фишера. Уровень значимости был принят как p<0,05. Отношение шансов (ОШ) определяли как отношение вероятности того, что событие произойдет, к вероятности того, что событие не произойдет, с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для статистической обработки использовали пакет программы Statistica 6.0.

Медиана возраста обследованных составила 47 (44; 52) лет. Курили 103 (56,3%) пациента, 118 (64,5%) страдали АГ, 46 (25,2%) — ожирением, у 58 (31,7%) выявлена ГХС. Сравнительная характеристика пациентов с ИМ на фоне предшествующей ИБС и ИМ без коронарного анамнеза по основным факторам риска развития ССЗ представлена в табл. 2.

В группах пациентов проанализировано распределение генотипов eNOS и Cx37, а также их сочетание (табл. 3).

Для гена Cx37 распространенность мутантного аллеля Т в группе больных ИМ на фоне ИБС составила 29,5%, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — 59,8% (р<0,01). Генотип СС у пациентов с ИМ на фоне ИБС встречался в 48,2% случаев, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза – в 22,8%. Генотип GT встречался в 44,6 и 34,6% случаев, а генотип TT – в 7,1 и 42,5% случаев (p<0,01; ОШ=9,6 при 95% ДИ от 3,3 до 28,4) соответственно (рис. 2).

Сочетание носительства аллели G (генотипы GG и GT) гена eNOS и аллели Т (генотипы СТ и ТТ) гена Cx37 обнаружено у 26 (46,4%) пациентов с ИМ на фоне ИБС и у 95 (74,8%) с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза (р<0,01; ОШ 3,4 при 95% ДИ от 1,8 до 6,6). Учитывая приведенные выше результаты, можно предположить, что прогностически наиболее значимым является сочетание генотипов GG и ТТ. Среди пациентов с ИМ на фоне предшествующей ИБС не обнаружено ни одного с таким генотипом, тогда как у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза указанное сочетание выявлено в 30 (23,6%; р<0,01) случаях.

Данные о связи полиморфизма генов eNOS и Cx37 с развитием ИМ у лиц без коронарного анамнеза или их влиянии на стабильность АСБ в литературе отсутствуют. Тем не менее на основании информации о физиологических эффектах NO можно сделать предположение о возможном механизме такого влияния. В настоящее время установлены многие антиатерогенные эффекты NO. Помимо влияния на сосудистый тонус, NO оказывает ингибирующее действие на адгезию лейкоцитов, активацию, адгезию и агрегацию тромбоцитов, подавляет экспрессию провоспалительных генов и т.д. Однако NO ингибирует миграцию и пролиферацию ГМК [13, 14], что может приводить к снижению синтеза этими клетками компонентов межклеточного матрикса и дестабилизации АСБ (в том числе гемодинамически незначимой). Это хорошо согласуется с тем фактом, что по результатам настоящей работы генотип GG, соответствующий максимальной каталитической активности eNOS, связан с развитием ИМ в отсутствие стенокардии и других проявлений ИБС. Полученные данные могут свидетельствовать о наличии у NO не только протективных, но и негативных эффектов, проявляющихся при определенных условиях, что обусловливает необходимость дополнительных исследований, особенно с учетом широкого применения нитратов при ИБС.

Патофизиологическая роль Cx37 и полиморфизма его гена в развития атеросклероза и дестабилизации АСБ также нуждается в дальнейшем изучении. Учитывая данные литературы о взаимодействии Cx37 и eNOS, а также выявленный в настоящей работе синергизм их влияния на развитие ИМ, можно предположить, что eNOS может модулировать работу коннексонов, влияя через них на процесс атерогенеза.

В настоящее время диагностика нестабильной АСБ и выявление пациентов с нестабильной гемодинамикой базируется в основном на инвазивных методиках, не подходящих для скрининга, так как существующие неинвазивные методы не обладают достаточной разрешающей способностью. Для создания методов массового обследования важную роль могут играть генетические маркеры, позволяющие выявлять пациентов из группы высокого риска. Определение полиморфизмов C1019T гена Сх37 и G894T гена eNOS может быть использовано для выявления генетической предрасположенности к развитию ИМ у пациентов с гемодинамически незначимым атеросклерозом и у практически здоровых лиц.

Работа выполнена в рамках государственного контракта №16.512.11.2262 по федеральной целевой программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 гг.».