АТ — антитела

БС — болевой синдром

БЭ — β-эндорфин

ГС — геморрагический синдром

ДИ — доверительный интервал

ИФА — иммуноферментный анализ

ОКП — острая кровопотеря

ПХ — пероксидаза хрена

HIF (hypoxia inductor factors) — фактор, индуцированный гипоксией

Одним из наиболее известных наследственных нарушений плазменного звена гемостаза является гемофилия. Существует два типа гемофилии, что обусловлено различными молекулярными дефектами. У пациентов с гемофилией A отсутствует, снижен или нарушен синтез фактора свертывания VIII, а у пациентов с гемофилией B аналогичные нарушения касаются фактора свертывания крови IX. По данным ВОЗ, распространенность гемофилии A составляет 1:10 000 мужского населения, гемофилии B — от 1:30 000 до 1:50 000. Гемофилия A может быть вызвана следующими повреждениями гена фактора VIII: дупликациями, большими делециями и инсерциями (более 100 нуклеотидов), малыми делециями и инсерциями (менее 100 нуклеотидов), заменами нуклеотидов (nonsense- и missense-мутациями), сплайсинговыми мутациями. Около 50% всех больных гемофилией A не имеют фактора VIII, у 5% имеется нормальное количество нефункционирующего белка, а в остальных случаях активность белка сохранена, но его количество резко снижено [1—3]. Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 1383 п.о. Фактор IX — гликопротеин — синтезируется в виде молекулы-предшественницы клетками печени, состоит из 415 аминокислотных остатков (объединенных в 8 доменов). Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной сериновой протеазы [4, 5].

Поскольку причиной гемофилии может явиться различное по характеру поражение на генетическом уровне, то и проявления болезни протекают различно. Тяжелое течение гемофилии, сопровождающееся прогрессированием геморрагического диатеза, не всегда напрямую связано с недостатком прокоагулянтной активности факторов свертывания VIII и IX в плазме [6]. Различие обусловлено как активностью дефицитного фактора свертывания крови, так и экспрессией иных адаптивных факторов, влияющих на гомеостаз.

Предпосылкой к нашему исследованию явилось предположение о наличии у пациентов, страдающих гемофилией, особой реакции одной из эволюционно древних адаптивных систем — системы эндогенных морфинов, направленной на биологическое выживание.

Эндорфины относятся к тем химическим соединениям, которые обеспечивают организму возможность выживания, поддерживая гормонально-эмоциональный статус. Основная группа пептидных гормонов (адренокортикотропный гормон, β-липотропин, меланоцитстимулирующий гормон, β-эндорфин — БЭ) образуется в результате расщепления большой молекулы — предшественницы проопиомеланокортина. При этом наиболее активным и полифункциональным представителем пептидов группы проопиомеланокортина является БЭ, обладающий способностью уменьшать боль, аналогично опиатам, и влиять на эмоциональное состояние [7—10]. Основной источник БЭ в центральной нервной системе — аркуатное ядро гипоталамуса и промежуточная доля гипофиза. Однако значение БЭ в системе гомеостаза не ограничивается только влиянием на центральную и периферическую нервную систему. БЭ является ключевым фактором, осуществляющим контроль за индуцированными стрессом изменениями иммунитета со стороны эндогенной опиоидной системы, влияет на процессы активации, пролиферации, кооперации и дифференцировки Т-лимфоцитов на Th1 или Th2, стимулирует фагоцитарную активность эффекторов естественного иммунитета и оказывает модулирующее влияние на функцию моноцитов и нейтрофилов, заключающуюся выработке цитокинов [11—14].

Целью данного проспективного исследования явились оценка изменения концентрации БЭ в сыворотке крови больных гемофилией при кровотечениях различного характера и без геморрагического синдрома (ГС), а также определение значения факторов, сопутствующих кровотечению (боль, гипоксия, потеря плазмы и эритроцитов).

В исследование включили пациентов, страдающих гемофилией А и В и обратившихся в Гематологический научный центр с марта по июнь 2012 г. в связи с возникшим у них кровотечением или для планового осмотра. Группу сравнения составили доноры цельной крови и плазмы. Всего в исследование включили 38 человек: больные гемофилией после острой кровопотери — ОКП (n=12), больные гемофилией без ГС (n=11) и доноры эритроцитов и плазмы (n=15). Медиана возраста в группе больных гемофилией с острой кровопотерей равна 33 годам, в группе больных гемофилией без ГС — 39 годам и в группе доноров эритроцитов и плазмы крови — 37 годам.

Для изучения динамики уровня БЭ при остром кровотечении сравнивали концентрация БЭ в группах больных гемофилией после ОКП и без ГС. Хотя эти группы состоят из разных людей (что при статистическом анализе учитывалось применением статистических критериев для несвязанных групп), они вполне сопоставимы по возрасту, тяжести течения основного заболевания и структуре сопутствующих заболеваний. Поскольку специального отбора пациентов не проводилось, уровни БЭ в группе больных гемофилией могут служить удовлетворительной оценкой этой величины в общей популяции больных гемофилией. Забор крови выполняли в острый период кровотечения в момент обращения пациента в ГНЦ МЗ РФ и на 5—7-е сутки после начала кровотечения.

Для изучения связи боли при потере крови с изменением концентрации БЭ сравнивали группы больных гемофилией с болевым синдромом — БС (n=6) и без него (n=6). В 1-ю группу (с болевым синдромом) включили больных с межмышечными и забрюшинными гематомами, а также с гемартрозами. Во 2-ю группу объединили пациентов с кровотечениями из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, почечными кровотечениями без обтурации мочевыводящих путей и с геморроидальными кровотечениями.

Для сравнения концентрации БЭ у больных гемофилией и больных гемофилией без ГС сравнивали с донорами цельной крови и плазмы до донации. Забор крови для исследования выполняли непосредственно до и после донации. Потерянный при заборе плазмы объем восполняли введением кристаллоидных растворов.

Измерение концентрации БЭ проводили иммуноферментным методом в варианте «сэндвич» с использованием антител (АТ) фирмы «Abcam». Вначале планшет сенсибилизировали первыми АТ, затем вносили образцы и стандарты, а после инкубации вносили вторые АТ. В качестве конъюгата (по Nakane) применяли АТ против IgG мыши, соединенные с пероксидазой хрена (ПХ). Визуализацию проводили раствором ТМВ, оптическую плотность определяли при 450 нм, и далее по кривой рассчитывали концентрацию БЭ.

Кроме изучения изменения концентрации БЭ при кровотечении проводили исследование его связи с гипоксией, которую оценивали по концентрации фактора, индуцированного гипоксией (hypoxia inductor factors — HIF). Для определения HIF применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА), для чего использовали коммерческую мышиную антисыворотку и коммерческие моноклональные АТ против молекулы HIF-1α фирмы «DRG Int. Inc». Для получения иммунохимической системы моноклональные АТ были конъюгированы с ПХ по Nakane. Использовали твердофазный метод ИФА (вариант «сэндвич»). Планшеты фирмы «Nunk» сенсибилизировали поликлональными АТ, а в качестве конъюгата применяли моноклональные АТ, соединенные с ПХ. Опытным путем методом перекрестного титрования подобраны концентрации всех используемых реагентов и условия проведения реакции. В качестве стандарта использовали рекомбинантный HIF-1α.

Статистический анализ. При статистическом анализе для проверки нулевой гипотезы о равенстве средних сравниваемых групп использовали парный (при одновыборочной схеме) и непарный (при двухвыборочной схеме) гетероскедастический критерий t Стьюдента. При тестировании с помощью критерия согласия (тест Шапиро—Уилка) гипотеза о нормальности распределений не отклонялась. Для оценки равенства дисперсий в группах (до и после кровопотери) использовали двухвыборочный критерий Фишера; для оценки связи концентрации БЭ с гипоксией (оцениваемой непрерывной переменной HIF) и БС (оцениваемым дихотомической индикаторной переменной) использовали соответственно регрессионный анализ и анализ таблиц сопряженности. С помощью построения коробчатых диаграмм проводили анализ данных на выбросы. Для представления эмпирических распределений использованы медиана (Me) с минимальным и максимальным значением выборки и среднее арифметическое (М) с 95% доверительным интервалом (ДИ). При расчетах использовали пакет статистических программ SAS 9.3.

Сравнение концентрации БЭ в сыворотке крови у больных гемофилией без ГС (5,2 пг/мл при 95% ДИ от 1,4 до 8,9 пг/мл) и при ОКП (9,6 пг/мл при 95% ДИ от 6,1 до 13,0 пг/мл) показало, что при кровопотере концентрация БЭ возрастает примерно в 2 раза (p=0,05; значение 34 пг/мл рассматривалось как выброс) (рис. 1, а).

Повторные измерения (через 7—10 дней после кровотечения) показали, что у большинства больных концентрация БЭ продолжала оставаться устойчиво повышенной. Заметим, что β-эндорфиновый ответ позволяет организму лучше переносить физиологический стресс (каковым является для него кровопотеря) и активирует резорбтивно-репаративные процессы.

В группе доноров при кроводаче также отмечено повышение концентрации БЭ: до донации — 4,7 пг/мл (при 95% ДИ от 3,2 до 6,3), непосредственно после донации — 7,3 пг/мл (при 95% ДИ от 4,9 до 9,7; р=0,05; значение 27,5 пг/мл при измерении до донации рассматривали как выброс) (см. рис. 1, б).

Повышение уровня БЭ сопровождалось увеличением вариабельности его значений как в группе больных гемофилией, так и в группе доноров, однако у больных гемофилией эта вариабельность более выражена. Вариабельность данных в выборке (относительно их среднего арифметического) оценивали величиной среднеквадратического (стандартного) отклонения. В группе больных гемофилией без ГС стандартное отклонение равно 2,4 пг/мл (при 95% ДИ от 1,7 до 4,4 пг/мл), а в группе больных с ОКП примерно в 3 раза выше — 7,7 пг/мл (при 95% ДИ от 5,5 до 13,1 пг/мл; р=0,05). Это наглядно отображают частотные распределения концентрации БЭ в 2 сравниваемых группах: для группы больных гемофилией без ГС значения показателя БЭ группируются около среднего значения (эмпирическое распределение унимодально и близко к нормальному), а для группы больных с ОКП наблюдается значительное рассеяние значений показателя БЭ (эмпирическое распределение близко к равномерному) (рис. 2).

Рассмотрим теперь концентрацию БЭ без связи с кровотечением: в группе больных гемофилией без ГС (репрезентирующей популяцию больных гемофилией в целом) концентрация БЭ равна Me=5 пг/мл, M=8 пг/мл (при 95% ДИ от 4 до 14 пг/мл), а в группе доноров до донации (репрезентирующей популяцию людей не больных гемофилией) — Me=4 пг/мл, M=6 пг/мл (при 95% ДИ от 2 до 9 пг/мл). Это превышение (для средних примерно в 1,3 раза; относительный риск 1,2) величины БЭ у больных гемофилией (по отношению к донорам) статистически значимо (p=0,14). Этот разведочный результат на малых выборках позволяет высказать предположение (требующее дальнейших исследований), что средняя концентрация БЭ в популяции больных гемофилией выше, чем у остального населения.

Рассмотрим факторы, с которыми (помимо собственно ГС) может быть связано увеличение концентрации БЭ при кровопотере: гипоксию и БС. Гипоксию будем оценивать по величине HIF. Кислородчувствительный транскрипционный регулятор HIF, являясь ключевым медиатором клеточного гомеостаза кислорода, активируется при гипоксическом стрессе, обеспечивая целый каскад компенсаторных механизмов. HIF контролирует передачу кислорода тканям и адаптацию к кислородному истощению путем регуляции экспрессии генов эритропоэтина (EPO), фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и гликолитических ферментов, обеспечивающих адаптацию клеток к гипоксии и стимулирующих ангиогенез [15—19]. HIF считается ведущим транскрипционным регулятором генов млекопитающих, ответственным за реакцию на недостаток кислорода [20—23].

Уровень HIF после кроводачи у доноров вырос в 2 раза: с 7,6% (при 95% ДИ от 3,9 до 11,3%) до 14,2% (при 95% ДИ от 7,8 до 20,6%; р=0,05) (рис. 3).

Для исследования связи другого фактора — БС — с показателем БЭ сравнивали группы больных гемофилией с кровотечением, сопровождающимся БС и без него. Как и в случае с показателем HIF статистически значимой связи не выявили.

Увеличение концентрации БЭ у больных гемофилией при кровотечении зафиксировано в 2 из 3 случаев (примерно у ¹/₃ больных подобного увеличения не выявлено), что свидетельствует о гетерогенности группы больных гемофилией по этому признаку. Схожая картина наблюдалась и в группе доноров.

Оценивая результаты, мы обратили внимание в первую очередь на более высокий средний уровень БЭ в группе больных гемофилией по сравнению с группой здоровых людей. Эти данные могут свидетельствовать о существовании некой гуморальной приспособительной системы, имеющей многогранный характер, более высокий порог болевой чувствительности закономерно благоприятен при заболевании, одним из основных проявлений которого является БС. Кроме того, высокий эмоциональный фон нивелирует психологический аспект течения болезни и позволяет адаптироваться в социуме. Отклонение в любую сторону от «адаптивного коридора» в сочетании с другими факторами, определяющими ментальность, вероятно, может приводить к девиации поведения. С другой стороны, повышенный уровень БЭ — это модулирующее влияние на функцию моноцитов и нейтрофилов, заключающуюся в выработке цитокинов, что может положительно влиять на течение резорбтивно-репаративных процессов у пациентов, страдающих гемофилией. В связи с этим закономерно увеличение концентрации БЭ в острый период кровотечения и еще большее повышение на 5—7-е сутки от начала кровотечения.

Данное исследование показало, что у больных гемофилией при кровопотере по сравнению с донорами при кроводаче концентрация БЭ в крови статистически значимо выше. Увеличение концентрации БЭ в ответ на кровопотерю является закономерной реакцией, но у пациентов, страдающих гемофилией, в результате частых кровотечений эта реакция более выражена. Можно предположить, что опиоидная система у больных гемофилией находится в состоянии готовности к эпизоду геморрагии, и при наступлении его отвечает более выраженной реакцией.

Кровопотеря сопровождается статистически значимым повышением концентрации БЭ в крови как у большинства доноров крови, так и у больных гемофилией. У больных гемофилией ОКП сопровождалась увеличением концентрации БЭ примерно в 2 раза (р=0,01).

Повышение концентрации БЭ при кровотечении у больных гемофилией статистически значимо выше, чем у доноров (нормированный прирост 84% против 55%) и характеризуется устойчивостью (длится не менее 10 дней).

У большинства больных гемофилией имеется физиологическая готовность к эпизоду геморрагии, что выражается в изначально высокой концентрации БЭ в крови и существенном и устойчивом увеличении концентрации данного пептида при кровотечении.