Введение

Гиалуроновая кислота (ГК) является ключевым компонентом внеклеточного матрикса различных тканей и обладает уникальными биофизическими и биохимическими свойствами, такими как вязкоупругость и барьерная функция. Биологическая функциональность ГК отличают ее от других природных полимеров, что делает ее крайне востребованной для создания комбинированных гидрогелей, применяемых в области тканевой инженерии [1—3].

В отличие от хитозана, альгината и целлюлозы ГК естественным образом содержится в организме человека и способна влиять на ряд клеточных процессов, таких как адгезия, пролиферация, миграция, дифференцировка, связывание со специфическими клеточными рецепторами и активация сигнальных путей [4, 5].

К наиболее существенным недостаткам ГК относят ее низкую устойчивость к гидролитической и ферментной деградации, что препятствует ее использованию в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии в качестве долговременной основы для биорезорбируемых костно-пластических материалов, способных к своевременному замещению собственными тканями организма без существенного изменения изначально заданного объема [6, 7]. Химическая модификация ГК с последующей межмолекулярной сшивкой за счет добавления олигомерных и полимерных добавок позволяет увеличить сроки ее деградации, а также улучшить физико-механические характеристики [8, 9].

Получение матрицы на основе ГК позволит создать биосовместимые и отверждаемые in situ материалы, способные к биорезорбции. Речь идет, прежде всего, о костно-пластических материалах, широко используемых в стоматологии. Некоторые разработки обладают способностью к хемо- и термоотвреждению, но еще не наделены способностью к фотоотвреждению, хотя задел в этом направлении существует [10—12].

Цель исследования: разработка и изучение свойств биосовместимых фотополимеризуемых композиций на основе ГК и диакрилата полиэтиленгликоля с использованием фотоинициаторов I типа, дифенил(2,4,6-триметилбензоат)фосфиноксид и фенил(2,4,6-триметилбензоилфосфинат) лития, а также оценка влияния химической модификации ГК на физико-механические свойства и скорость деградации получаемых композиций.

Материал и методы

Для проведения реакции модификации использовали низкомолекулярную ГК 5000—10000 г/моль («LEAPChem», Китай), глицидилметакрилат — ГМА («Macklin», Китай), диметилсульфоксид —ДМСО («Concord Technology», Китай), соляную кислоту (осч.; «Сигма Тек», Россия), ацетон (осч. для ВЭЖХ; «Альдоса», Россия), этилацетат (осч.; «Компонент-Реактив», Россия).

В качестве компонентов фотополимеризуемых композиций использовали ГК, полиэтиленгликоль диакрилат (PEG-DA) 700 г/моль («Sigma-Aldrich», США), полученную в ходе работы метакрилированную гиалуроновую кислоту (М-ГК), дифенил(2,4,6-триметилбензоил) фосфиноксид — ТРО («Macklin», Китай) и фенил (2,4,6-триметилбензоилфосфинат) лития — LAP («Macklin», Китай).

Получение метакрилированной ГК. Модификацию ГК проводили по данной методике с некоторыми изменениями [13]. Для проведения реакции 1 г ГК растворяли в 100 мл дистиллированной воды. После полного растворения ГК добавляли 50 мл ДМСО, 20 мл ГМА и оставляли реакционную смесь при постоянном перемешивании при температуре 25 °C на 48 ч. Для осаждения М-ГК реакционную смесь доводили до pH 3 раствором 1 М соляной кислоты и добавляли 200 мл ацетона и 100 мл этилацетата. Для очистки продукта осадок отделяли центрифугированием, растворяли в дистиллированной воде и диализовали против 10-кратного избытка дистиллированной воды в течение 3 сут с ежедневной сменой воды. После очистки продукт замораживали и лиофильно высушивали в течение 48 ч до полного удаления воды.

Определение молекулярной массы ГК и М-ГК методом ВЭЖХ. Молекулярную массу и индекс полидисперсности определяли с помощью установки GPC/SEC («АКВИЛОН», Россия) с колонками PolySep-SEC GFC-P 4000 и PolySep-SEC GFC-P 5000 («Phenomenex Inc.», США) длиной 300 мм и диаметром 7,8 мм, с рефрактометрическим детектором и петлей инжектора объемом 20 мкл. В качестве подвижной фазы был подготовлен раствор 0,1 М NaN₃ («Sigma-Aldrich», США) и 0,01 M NaH₂PO₄ («Sigma-Aldrich», США) в дистиллированной воде, дополнительно очищенной системой Milli-Q («Millipore», США). Температура термостата установки поддерживалась на уровне 40 °C, а скорость потока элюента составляла 1 мл/мин. Регистрируемые данные автоматически обрабатывались программой «МультиХром 1.6» («Амперсенд», Россия). Градуировочная зависимость строилась на основе полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид стандартов («Sigma-Aldrich», Швейцария), растворенных в подвижной фазе при концентрации 3 г/л.

Определение степени метакрилирования М-ГК методом перманганатометрии. Определение степени метакрилирования М-ГК с использованием перманганата калия — KMnO₄ («Sigma-Aldrich», США) проводили согласно методике из данной работы с небольшими изменениями [14]. Суть метода заключается в титровании стандартного раствора KMnO₄ (1 мл, 0,00625%) раствором М-ГК (0,5%) до полного изменения окраски раствора от фиолетовой до охристой со спектрофотометрическим подтверждением по исчезновению пиков KMnO₄ (450—600 нм) на УФ-ВИД-спектрофотометре Evolution 201 («Thermo Fisher Scientific», США; рис. 1). Степень метакрилирования определяется как отношение количества привитых групп ГМА, содержащих двойную связь, реагирующую с KMnO₄, к общему количеству дисахаридных звеньев М-ГК. Количество двойных связей, которое необходимо для полного восстановления стандартного раствора KMnO₄, является константой и определено титрованием с помощью водного раствора свободного ГМА как 0,593 мкмоль. При этом общее количество дисахаридных звеньев будет переменной величиной, которая определяется из объема раствора М-ГК, потраченного на полное восстановление стандартного раствора KMnO₄.

Рис. 1. Изменение спектра поглощения стандартного раствора KMnO₄ (1 мл, 0,00625%) при добавлении различных объемов анализируемого раствора 0,5% М-ГК.

Зеленый спектр соответствует исходному раствору KMnO₄, синий спектр — MnO₂, который образуется при восстановлении KMnO₄.

Получение фотополимеризуемых композиций и образцов для испытаний. Приготовление фотополимеризуемых композиций проводили в виалах из темного стекла объемом 5 мл. Фотополимеризуемые композиции представляли собой водные растворы PEG-DA, ГК, М-ГК и фотоинициаторов. В виалу вносили 25%масс. PEG-DA, 0,5%масс. ТРО или LAP и расчетные количества ГК или М-ГК, после чего перемешивали в течение 1 мин на амальгамном смесителе Shofu Amalgam Mixer «Deluxe» («Shofu Dental MFG. CO., Ltd.», Япония) и погружали на 15 мин в ультразвуковую баню Laborette 17 («Fritsch», Германия) при мощности ультразвука 35 кГц, 240 Вт и температуре 25 °C. Составы использованных в работе фотополимеризуемых композиций приведены в табл. 1.

Таблица 1. Состав фотополимеризуемых композиций, %масс.

Примечание. ГК — гиалуроновая кислота; PEG-DA — полиэтиленгликоль диакрилат; ТРО — дифенил(2,4,6-триметилбензоил) фосфиноксид; LAP — фенил (2,4,6-триметилбензоилфос финат) лития; М-ГК — метакрилированная гиалуроновая кислота.

Образцы для испытаний готовили с использованием фторопластовой формы высотой 4 мм и отверстием с внутренним диаметром 3 мм. Форму помещали на полиэфирную пленку, заполняли испытуемой фотополимеризуемой композицией, накрывали сверху пленкой и экспонировали светополимеризационной лампой Megalux LED («Megadenta Dentalprodukte GmbH», Германия) при длине волны 440—480 нм и интенсивности светового потока 1200 мВт/см² в течение 40 с.

Определение физико-механических свойств. Измерение прочности при сжатии отвержденных образцов проводили по методике ГОСТ 31578-2012 на универсальной испытательной машине Z010 («Zwick GmbH & Co. KG», Германия) со скоростью движения траверсы 1 мм/мин с использованием программного обеспечения testXpert V 10.11 («ZwickRoell», Германия).

Определение степени набухания и гидролитической устойчивости. Для определения степени набухания образцы, высушенные до постоянной массы, погружали в дистиллированную воду и выдерживали при температуре 37 °C в течение 7 дней. По истечении указанного срока образцы вынимали из воды, промокали поверхность образцов фильтровальной бумагой и взвешивали на аналитических весах. Затем образцы повторно высушивали до постоянной массы. Степень набухания определяли по отношению разницы масс образца после выдержки в воде в течение 7 сут и после повторного высушивания к массе образца после повторного высушивания.

Деградацию отвержденных образцов фотополимеризуемых композиций измеряли гравиметрически. Испытания in vitro проводили в гидролитической и ферментативной среде в течение 7 дней. Образцы, высушенные до постоянной массы, помещали в избыток фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко (DPBS) с pH 7,4 («ПанЭко», Россия) или в DPBS, содержащий 25 мг/л трипсина («ПанЭко», Россия), и выдерживали при температуре 37 °C. По истечению 7 дней образцы вынимали из раствора, промывали дистиллированной водой, промокали поверхность образцов фильтровальной бумагой и высушивали до постоянной массы. Фиксировали массу образцов после испытания. Коэффициент деградации рассчитывали по отношению разницы масс образца до и после испытания к массе образца после испытания.

Результаты и обсуждение

Характеристика фотополимеризуемых композиций

Молекулярная масса ГК и М-ГК. В процессе метакрилирования как среднечисленная Mn, так и среднемассовая молекулярная масса Mw ГК существенно понизились вследствие деструкции макромолекул. Увеличение индекса полидисперсности PDI, отражающего ширину молекулярного массового распределения, указывает на нерегулярную локализацию мест обрывов полимерной цепи и образование значительного числа резко различающихся по длине макромолекул. Результаты измерения молекулярной массы исходных и метакрилированных образцов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Изменение молекулярно-массовых характеристик гиалуроновой кислоты в процессе метакрилирования

Примечание. ГК — гиалуроновая кислота; М-ГК — метакрилированная гиалуроновая кислота; Mw — среднемассовая молекулярная масса; Mn — среднечисленная молекулярная масса; PDI — индекс полидисперсности.

Степень метакрилирования М-ГК. По мере реакции с двойными связями М-ГК KMnO₄ восстанавливался до MnO₂ (реакция Вагнера), что отражалось в виде изменения окраски и уменьшения пиков поглощения. Полное исчезновение пиков свидетельствовало об окончании реакции (рис. 1). Измерение объема 0,5% раствора М-ГК, необходимого для полного титрования KMnO₄, позволило рассчитать степень метакрилирования М-ГК, которая составила 22%.

Физико-механические испытания. В процессе оценки физико-механических свойств установлено, что увеличение содержания исходной ГК в качестве неактивного компонента в составе фотополимеризуемой композиции, независимо от используемого фотоинициатора, закономерно приводило к снижению прочности при сжатии отвержденных образцов (рис. 2). Обратная ситуация наблюдалась для фотополимеризуемых композиций, содержащих в своем составе М-ГК. В случае увеличения концентрации М-ГК прочность при сжатии отвержденных образцов увеличивалась, что прямо указывает на участие молекул М-ГК в формировании пространственной ковалентно-сшитой макромолекулярной сети в процессе фотополимеризации (рис. 3).

Рис. 2. Прочность при сжатии образцов фотополимеризуемых композиций PEG-DA 25%масс. и TPO 0,5%масс. (а), а также PEG-DA 25%масс. и LAP 0,5%масс. (б) в зависимости от содержания гиалуроновой кислоты.

Рис. 3. Прочность при сжатии образцов фотополимеризуемых композиций PEG-DA 25%масс. и TPO 0,5%масс. (а), а также PEG-DA 25%масс. и LAP 0,5%масс. (б) в зависимости от содержания метакрилированной гиалуроновой кислоты.

При одинаковой дозе инициирующего облучения для фотополмеризуемых композиций М-ГК фотоинициатор LAP показал большую эффективность по сравнению с ТРО. Так, для фотополимеризуемой композиции PEG-DA, содержащей 15%масс. М-ГК и 0,5%масс. LAP прочность при сжатии достигала 2000 кПа.

Оценка гидролитической устойчивости. Образцы фотополимеризуемых композиций, содержащих в своем составе ГК, демонстрировали относительно большую способность удерживать воду по сравнению с М-ГК. Так, после выдерживания в воде при температуре 37 °C наблюдалось увеличение массы немодифицированных образцов от 2 до 5 г/г в зависимости от концентрации ГК, при этом степень набухания композиции с М-ГК сохранялась неизменной во всем диапазоне концентраций М-ГК и не превышала 2,2 г/г (рис. 4).

Рис. 4. Степень набухания образцов фотополимеризуемых композиций PEG-DA 25%масс. и ТРО 0,5%масс. (а), а также PEG-DA 25%масс. и LAP 0,5%масс. (б) в зависимости от содержания гиалуроновой кислоты (ГК) и метакрилированной гиалуроновой кислоты (М-ГК).

Деградация in vitro отвержденных образцов в модельной ферментативной среде протекала ожидаемо быстрее, чем в гидролитической. В качестве фермента использовали трипсин. Предположительно он способен разрывать сложноэфирную связь между ГК и ГМА. Большую устойчивость к гидратации проявляли образцы фотополимеризуемых композиций, содержащие фотоинициатор LAP.

Наличие в структуре фотополимеризуемой композиции ковалентно несвязанной ГК приводит к более быстрой деградации образцов как в DPBS, так и в среде трипсина. Потеря массы для композиций, содержащих 15%масс. ГК, по истечению 7 дней составляла более 50%. Большую устойчивость к гидратации проявили композиции PEG-DA с М-ГК и LAP, потеря массы которых не превышала 30% как в гидролитической, так и в ферментативной среде (рис. 5).

Рис. 5. Деградация in vitro образцов фотополимеризуемых композиций PEG-DA 25%масс. и ТРО 0,5%масс. (а), а также PEG-DA 25%масс. и LAP 0,5%масс. (б) в зависимости от содержания гиалуроновой кислоты (ГК) и метакрилированной гиалуроновой кислоты (М-ГК).

Увеличение содержания М-ГК в составе фотополимеризуемой композиции приводит к образованию большего числа ковалентных связей в процессе полимеризации. Более того, при одинаковом массовом содержании PEG-DA и М-ГК в фотополимеризуемой композиции, обладающий меньшей молекулярной массой, а следовательно, большим мольным содержанием, LAP способен активировать большее количество элементарных связей, что приводит к увеличению количества межмолекулярных соединений, уплотнению объемной структуры и, как следствие, упрочнению образцов [15].

Для полимерных гелей степень набухания прямо зависит от гидрофильности макромолекул и плотности сшивки [16]. Увеличение содержания в составе геля ГК, не участвующей в формировании полимерной сети, приводит к увеличению предельной степени набухания. Напротив, М-ГК, участвующая в процессе сшивки, увеличивает упругость структуры образца, снижая количество сорбированной воды.

Таким образом, увеличение плотности сшивки полимерной сети способствует увеличению механической прочности и гидролитической устойчивости получаемых композиций. Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами, приведенными в работах, посвященных фотополимеризуемым композициям на основе химически модифицированной ГК [3, 17].

Заключение

Использование немодифицированной гиалуроновой кислоты приводит к снижению механической прочности композиций, ее устойчивости к гидролизу и значительно увеличивает водопоглощение, что обусловлено низкой плотностью сшивки в сочетании с гидрофильностью макромолекул гиалуроновой кислоты. В свою очередь использование модифицированной акрилатными группами гиалуроновой кислоты способствует упрочнению пространственной структуры полимерных композиций, что увеличивает прочность получаемого материала и снижает степень его набухания.

Результаты настоящего исследования помогут оптимизировать состав и условия получения фотополмеризуемых материалов на основе гиалуроновой кислоты, обладающих необходимыми функциональными характеристиками для создания фотоотверждаемых костно-пластических материалов.

Работа выполнена в рамках темы государственного задания № 1023021300027-9-3.2.14 (WLGC-2024-0001) Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.