Кариес зубов — самое распространенное стоматологическое заболевание. В различных регионах России он встречается у 60—98% населения [1]. Профилактика и комплексное лечение кариеса нацелены на устранение причин, условий возникновения и развития патологического процесса. Известно, что данное заболевание по этиологии является многофакторным [2], но полагают, что одна из причин его развития — изменения в микробиоценозе полости рта [2]. Особая роль в современной концепции кариеса отводится нарушениям функционирования защитных антимикробных механизмов [3]. В то же время в ряде научных работ отмечено, что данная патология развивается на фоне недостатка витамина D (25(OH)D3) [4], хотя некоторые исследователи отрицают взаимосвязь содержания 25(OH)D3 в крови и кариеса [5].
Активная форма витамина D (кальцитриол) — один из основных регуляторов фосфорно-кальциевого гомеостаза, необходимого для всасывания кальция и фосфатов в кишечнике и их реабсорбции в почках. Во время нормального или положительного баланса кальция в организме 1,25-дигидрокси-холекальциферол (1,25(OH)2D3) обеспечивает минерализацию костей и твердых тканей зубов [6]. Имеются данные о собственно антикариозной активности витамина D [7, 8]. Экспериментально доказано, что дефицит 25(OH)D3 не только затрудняет депонирование кальция твердыми тканями зуба, но и вызывает увеличение объема органического матрикса дентина вследствие нарушения его минерализации, задержку развития и формирования эмали с последующими гипопластическими изменениям в ней [9]. Опубликованы результаты исследований, установивших связь между плотностью альвеолярной костной ткани, остеопорозом и потерей зубов. Отчеты демонстрируют клинически значимую связь между состоянием пародонта и поступлением в организм витамина D [10].
Установлено, что существует около 900 генов, непосредственно или косвенно реагирующих на воздействие кальцитриола [11]. В связи с этим 25(OH)D3 помимо принадлежащей ему ключевой роли в минеральном обмене осуществляет широкий ряд биологических функций, касающихся в том числе иммуномодуляции, в частности, способности стимулировать выработку антимикробных пептидов [10—12].
Представляется, что использование препаратов витамина D может опосредованно как снижать агрессивность микробов-резидентов, в частности, кариесогенных бактерий, так и способствовать укреплению эмали зуба [9].
Цель исследования — оценка содержания метаболита витамина D (25(OH)D3) в сыворотке крови, уровня некоторых показателей иммунного и перекисного статуса в ротовой жидкости у лиц с кариозным процессом разной интенсивности на фоне приема нативного раствора витамина D (международное непатентованное название Cholecalciferol).
Материал и методы
На основании полученных данных предварительного осмотра полости рта и расчета индекса КПУ (индекс КПУ = кариозные зубы + пломбированные + удаленные) в исследование были отобраны 60 относительно здоровых человек в возрасте от 20 до 22 лет, не принимавших ранее препараты витамина D: 20 — с низким индексом КПУ, 20 — со средним уровнем интенсивности кариозного процесса; 20 — с высокой интенсивностью кариеса. Группы были сопоставимы по полу, социальному статусу, уровню гигиены полости рта. От всех пациентов было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании. В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2013 — поправки).
На первом этапе работы в сыворотке крови определили содержание метаболита витамина D — 25(OH)D3 методом хемилюминесцентного иммунного анализа. Затем, учитывая клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике, лечению и профилактике дефицита витамина D у взрослых [13], выделили лиц с нормальным содержанием витамина D (30—100 нг/мл), недостатком витамина D — уровень 25(OH)D3 20—29 нг/мл и дефицитом витамина D — количество 25(OH)D3 <20 нг/мл.
На втором этапе работы из обследованных были сформированы следующие группы: контрольная — лица с индексом КПУ 0,00 [0,00; 0,00] и нормальным содержанием 25(OH)D3 в крови (13 человек); 1-я группа — испытуемые с низкой интенсивностью кариозного процесса — индекс КПУ 1,5 [0,00; 3,00] и уровнем витамина D <30 нг/мл (n=7); 2-я группа — лица со средней активностью кариеса — индекс КПУ 5,00 [4,00; 6,00] и количеством витамина D <30 нг/мл (n=15); 3-я группа — с высоким индексом КПУ 10,5 [9,5; 11,5] и концентрацией 25(OH)D3 <30 нг/мл (n=17).
У всех обследованных лиц брали образцы ротовой жидкости с помощью специальных контейнеров, представляющих собой пластиковые пробирки, внутри которых находится синтетический мягкий тампон, закрепленный в специальной вставке в их верхней части. Для того чтобы получить ротовую жидкость, пациент помещает тампон в ротовую полость и пережевывает в течение 3 мин. Затем тампон возвращают обратно в контейнер, который при необходимости хранят в холодильнике. В дальнейшем пробирку центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, ротовая жидкость при этом оказывается в нижней части контейнера. После центрифугирования образуется чистый образец слюны для анализа в объеме около 1,5 мл. Следует отметить, что замораживание, которое необходимо проводить перед исследованием слюны, собранной другими методами, в данном случае не требуется. После этого обследуемым с уровнем 25(OH)D в сыворотке крови <30 нг/мл назначали нативный раствор витамина D по 14 капель (7000 МЕ/сут) в течение 4 нед с последующим переходом на поддерживающую дозу — 4 капли/сут. Общая продолжительность курса составила 8 нед. Указанную схему назначали в соответствии с клиническими рекомендациями «Дефицит витамина D у взрослых: диагностика, лечение и профилактика» [13]. Образцы ротовой жидкости повторно брали через 8 нед после начала приема препарата.
В ротовой жидкости обследуемых изучали следующие показатели иммунного и перекисного статуса. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли количество антимикробного пептида — кателицидина LL-37, секреторного иммуноглобулина A (IgA), липополисахаридсвязывающего белка (LBP) с использованием наборов реактивов для ИФА Hycult Byotechnology (Дания), ИФА-БЕСТ (Россия) и Cloud-Clone Corp. (США) соответственно, а также оценивали содержание промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), таких как малоновый диальдегид (ТБК-активные продукты) [14], уровень общей антиоксидантной активности (ОАА) [15].
Описательная статистика представлена медианой и межквартильным интервалом [25-й перцентиль; 75-й перцентиль]; для сравнения двух независимых выборочных совокупностей применяли критерий Манна—Уитни, а для сравнения зависимых совокупностей — W-критерий Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ 25(OH) витамина D на первом этапе показал, что у обследуемых со средней и высокой интенсивностью кариеса его содержание в сыворотке крови ниже, чем у лиц с низкой интенсивностью процесса, на 47,96% (p=0,025) и 55,04% (p=0,010) соответственно (табл. 1). При этом у 65% обследуемых с индексом КПУ уровень витамина был в пределах нормы, и лишь у 35% его менее 30 нг/мл. В группах со средними и высокими индексами КПУ доля лиц с низким уровнем 25(OH)D3 составляла 75 и 85% соответственно. Это, по нашему мнению, подтверждает данные литературы о том, что недостаток кальцитриола является значимым фактором развития кариеса [4].
Таблица 1. Уровень 25(OH)D3 в сыворотке крови у лиц с различной интенсивностью кариозного процесса
| Показатель | Группа с низким индексом КПУ (n=20) | Группа со средним уровнем КПУ (n=20) | Группа с высоким уровнем КПУ (n=20) |
| 25(OH)D3 | 51,40 [43,50; 55,90] | 26,75 [24,50; 36,45]* | 23,11 [19,94; 31,21]* |
| Абс. число лиц с различным содержанием 25(OH)D3 | |||
| Норма | 13 | 5 | 3 |
| Недостаток | 6 | 13 | 14 |
| Дефицит | 1 | 2 | 3 |
Примечание. * — достоверные различия по сравнению с группой лиц низкой интенсивности процесса.
На следующем этапе определение показателей местного иммунитета до приема препарата витамина D выявило, что в ротовой жидкости при недостатке 25(OH)D3 с усилением интенсивности кариозного процесса снижаются уровни секреторного IgA и LPB (табл. 2). Так, количество LPB по сравнению с контролем было низким во всех исследуемых группах: с низкой интенсивностью кариеса — в 1,88 раза (p=0,012), со средней интенсивностью процесса — в 3,20 раза (p=0,001), с высокой — в 6,37 раза (p<0,001). При этом уровень LPB в группе лиц с высокой интенсивностью кариеса уменьшался по сравнению с таковым у испытуемых со средней интенсивностью процесса в 1,99 раза и низкой интенсивностью — в 3,39 раза. Концентрация секреторного IgA снижалась во 2-й и 3-й группах как по сравнению с контролем (в 2,53 раза; p<0,001 и в 4,47 раза; p<0,001 соответственно), так и лицами 1-й группы с легкой интенсивностью процесса (в 2,32 раза; p<0,001 и 4,09 раза; p<0,001).
Таблица 2. Показатели иммунного и перекисного статуса в ротовой жидкости у лиц с низким уровнем 25(OH)D и разной интенсивностью кариозного процесса на фоне приема нативного раствора витамина D
| Показатель | Контроль (n=13) | 1-я группа (низкая интенсивность кариозного процесса; n=7) | 2-я группа (средняя интенсивность кариозного процесса; n=15) | 3-я группа (высокая интенсивность кариозного процесса; n=17) |
| исходный уровень 25OH витамина D <30 нг/мл | ||||
| LBP, нг/мл | ||||
| до приема | 88,00 [71,01; 97,46] | 46,85 [34,65; 48,65]* | 27,54 [25,00; 34,00]* p1=0,030 | 13,82 [11,86; 17,81]* p1<0,001 p2<0,001 |
| после приема | 236,40 [131,15; 302,12]*, ** | 128,54 [122,08; 222,16]*, ** | 124,10 [110,20; 128,30]*, ** p1<0,001 | |
| Секреторный IgA, г/л | ||||
| до приема | 55,00 [50,00; 61,46] | 50,29 [49,87; 64,99] | 21,72* [15,72; 32,42] p1=0,001 | 12,31* [9,11; 15,53] p1<0,001 p2=0,030 |
| после приема | 59,34 [53,68; 68,02] | 66,77 [47,81; 80,57]** | 57,13 [42,18; 73,96]** | |
| Кателицидин LL-37, нг/мл | ||||
| до приема | 0,56 [0,37; 0,72] | 0,51 [0,36; 0,68] | 0,46 [0,21; 0,53] | 0,21* [0,13; 0,36] p1=0,045 |
| после приема | 0,68 [0,46; 0,82] | 0,62 [0,53; 0,96]** | 0,67 [0,34; 0,94]** | |
| ОАА,% | ||||
| до приема | 53,02 [50,11; 55,00] | 25,39 [23,39; 29,18]* | 21,25 [19,45; 23,45]* | 17,48 [14,68; 18,66]* p1=0,001 p2=0,019 |
| после приема | 50,44 [49,42; 54,68]** | 56,09 [45,88; 64,35]** | 45,24 [44,20; 51,16]** | |
| ТБК, мкмоль/л | ||||
| до приема | 0,44 [0,33; 0,45] | 0,52 [0,36; 0,64] | 0,99 [0,78; 1,09]* p1=0,001 | 0,98 [0,88; 1,16]* p1<0,001 |
| после приема | 0,46 [0,36; 0,52] | 0,46 [0,42; 0,54]** | 0,48 [0,44; 0,58]** | |
Примечание. Различия достоверны по сравнению: * — с контролем; ** — с результатами, полученными до приема витамина D; p1 — с 1-й группой; p2 — со 2-й группой.
Уровни кателицидина LL-37 в группе с высокой интенсивностью кариозного процесса были ниже, чем в контрольной группе, в 2,67 раза (p=0,018) и ниже, чем в группе с индексом КПУ 1,5, в 2,43 раза (p=0,002). Полученные данные согласуются с результатами работ по изучению противомикробных пептидов при развитии кариеса [3].
Сдвиги в системе ПОЛ-антиоксидантная защита характеризовались значительным снижением общей антиоксидантной активности не только у испытуемых со средней и высокой активностью кариозного процесса (в 2,5 раза; p<0,001 и в 3,03 раза; p<0,001 соответственно), но и у лиц с низким индексом КПУ (в 2,09 раза; p<0,001) по сравнению с контролем, при этом данный показатель при индексе КПУ 10,5 достоверно уменьшался по сравнению с таковым в 1-й и 2-й группах. Вероятно, угнетение антиоксидантных факторов в ротовой полости у лиц с дефицитом витамина D 2-й и 3-й групп отразилось и на изменении уровня ТБК-активных продуктов. Так, их количество превышало значения контроля в 2,25 раза (p<0,001) и в 2,23 раза (p<0,001) соответственно. По нашему мнению, объяснением этому может быть недостаток 25(OH)D3, с одной стороны, и воздействие на ткани полости рта токсинов микроорганизмов — с другой. Вместе с тем доказано то, что активация свободнорадикальных процессов в клетках усугубляет течение различных патологических процессов [16].
После курсового приема нативного раствора витамина D уровень 25(OH)D3 в сыворотке крови испытуемых достиг такового в группе контроля (среднее содержание 53,00±12,11 нг/мл).
Биохимическое исследование ротовой жидкости выявило нормализацию изучаемых показателей иммунитета у всех обследуемых. Относительно исходного уровень LBP в большей степени увеличился у лиц 1-й и 3-й групп — в 5,05 (p<0,001) и 8 раз (p<0,001) соответственно, превышая даже контрольные цифры. Количество секреторного IgA максимально увеличилось у лиц с высокой активностью кариеса — в 4,64 раза (p<0,001). Аналогичные изменения были характерны и для концентрации кателицидина LL-37: наибольший рост наблюдался в 3-й группе.
Курсовой прием витамина D также привел к увеличению ОАА во всех группах примерно в 2 раза (p<0,001), что достигло контрольных величин. Концентрация ТБК-активных продуктов аналогично приобрела уровень, соответствующий контрольным значениям, снижаясь практически 2 раза (p<0,001) во 2-й и 3-й группах относительно исходной.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что дефицит витамина D сопровождается снижением активности защитных антимикробных механизмов полости рта и, как следствие, может приводить к увеличению числа микроорганизмов, зубного налета и дисбалансом в системе ПОЛ-антиоксидантная защита.
Известно, что LBP является обязательным участником врожденного иммунного ответа, так как данное соединение с высоким сродством связывается с липополисахаридом бактерий, облегчая его дальнейшее соединение с CD14 мононуклеарных макрофагов, с последующим TLR4/MD2-опосредованным эндоцитозом образованного протеинового комплекса [17]. LBP секретируется нейтрофилами и эпителиальными клетками слизистой оболочки, в том числе ротовой полости. IgA синтезируется в плазматических клетках собственной пластинки слизистой оболочки и слюнных железах. Решающую роль в реализации резистентности к инфекции играет секреторный IgA, проявляя выраженную бактерицидность, активируя фагоцитоз, комплемент, обладая антивирусными и антитоксическими свойствами [17]. В секретах организма slgA связывается с углеводными структурами бактериальных клеток, с вирусами, блокируя тем самым их адсорбцию и адгезию к эпителию слизистой оболочки и препятствуя проникновению патогенов (микроорганизмов, их токсинов, пищевых и бактериальных антигенов) во внутреннюю среду организма [17, 18]. Кателицидин LL-37 — это катионный антимикробный белок, который расщепляется на фрагменты (RK-31, KS-30), обладающие еще большей протективной активностью [3, 18]. Источниками слюнных LL-37, вероятно, являются нейтрофилы [18]. Данные протеины агрегируют на мембране бактерии и вызывают ее деструкцию путем образования ионных каналов, трансмембранных пор. Кроме того, описаны реэпитализирующие, иммуномодулирующие, иммуноактивирующие свойства кателицидинов [19].
В свою очередь ряд иммунных клеток, таких как моноциты, макрофаги, B-клетки, T-клетки, N-киллеры являются «мишенями» для активной формы витамина D — 1,25(OH)2D3, на которых он оказывает свое иммуномодулирующее действие [20]. Кальцитриол инициирует процесс дифференцировки моноцитов в макрофаги, активирует секрецию множества цитокинов, в том числе и интерлейкинов (ИЛ) 1b, ИЛ-8. Последний проявляет мощные хемоатрактантные свойства для нейтрофилов, продуцирующих LBP [19]. ИЛ-1b стимулирует синтез кателицидина и b-дефензина (DEFB4) [20], которые обладают выраженными антимикробными свойствами против пародонтопатогенных штаммов, таких как Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Candida и папилломавирус. Таким образом, витамин D поддерживает активность врожденных иммунных реакций организма против инфекций слизистых оболочек. Его активная форма также влияет на гуморальный Th2-иммунный ответ, угнетая экспрессию цитокинов Th1 и увеличивая экспрессию Th2-цитокинов, в том числе ИЛ-4 [20]. Возможно, это сказывается на секреции иммуноглобулинов, в частности, на продукции IgA.
Кроме того, в научной литературе описаны антиоксидантные свойства 1,25(OH)2D3 — способность ингибировать экспрессию циклооксигеназы-2 и индуцировать синтез ферментов антиоксидантной защиты: каталазы и супероксиддисмутазы [20].
В нашей работе прием витамина D вызвал положительные эффекты: улучшилось состояние врожденного и адаптивного иммунитета, увеличилась ОАА в полости рта, уменьшилась активность ПОЛ. Полученные результаты указывают на необходимость определения уровня 25(OH)D3 в организме как предиктора развития патологических процессов в ротовой полости, с одной стороны, и на целесообразность использования препаратов данного биологически активного вещества в профилактике и комплексной терапии кариозного процесса, с другой.
Выводы
1. У лиц с индексом КПУ более 9,0 чаще всего наблюдаются пониженные концентрации 25(OH)D3 в сыворотке крови.
2. У страдающих кариесом при концентрации 25(OH)D3 в сыворотке крови менее 30 нг/мл наблюдается угнетение протекторной активности в полости рта: снижение уровня секреторного иммуноглобулина А, липополисахарид-связывающего белка, кателицидина, а также общей антиоксидантной активности, что сопровождается ростом количества промежуточных продуктов липопероксидации в ротовой жидкости.
3. Курсовой прием нативного раствора витамина D приводит к нормализации некоторых иммунных и биохимических показателей (кателицидина LL-37, секреторного иммуноглобулина A, липополисахаридсвязывающего белка) ротовой жидкости и восстановлению баланса в системе перекисное окисление липидов — антиоксиданты.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.