Одной из важных и нерешенных проблем терапевтической стоматологии остается задача эффективной персонализированной диагностики кариозного поражения дентина на ранних стадиях, наличие воспалительных процессов в котором может привести не только к потере части или всего зуба, но и к более серьезным последствиям и угрозе здоровья человека в целом [1].

С точки зрения онтогенеза, эмаль и дентин являются одними из самых ранних продуктов биоминерализации, происходящих в организме человека, и представляют собой эластичную твердую кальцифицированную ткань [2]. Являясь органоминеральным композитом, дентин в отличие от эмали выполняет несущие, амортизационные, трофические, обменные и сигнальные функции, тогда как эмаль, являясь самой прочной тканью человеческого организма, выполняет функцию защиты дентина и пульпы зуба от внешних раздражителей [2]. Следует отметить, что функционирование дентина сопровождается множеством процессов и переносом большого количества органических молекул, осуществляемом через дентинную жидкость [3]. Относительное богатство дентина органическими веществами (по сравнению с эмалью) играет весьма важную роль в развитии в нем кариозного процесса [3, 4].

Несмотря на то что кариес дентина зачастую является дальнейшим развитием патологического процесса, начавшегося в эмали зуба, успешное выявление и мониторинг изменений в дентине на ранних стадиях представляет собой сложную задачу [5]. Естественная реакция дентина на инвазию микроорганизмов, особенно на ранних стадиях развития патологии, составляет предмет современных исследований [1, 6]. В настоящее время контроль таких изменений может быть осуществлен в основном с помощью группы экспресс-методов на основе анализа слюны [7] и жидкости из десневой борозды [8], а контроль факторов воспаления — по анализу сыворотки крови [9]. Однако эти биологические жидкости не контактируют непосредственно с дентином, а изменения в их составе может происходить при наличии системных заболеваний человека, а также различного рода стимуляций [10, 11]. Поэтому проблема ранней эффективной персонализированной диагностики заболеваний дентина, а также скрининг индивидуальной предрасположенности к появлению патологий, требует расширения объектов анализа, идентификации и сопоставления изменений, происходящих в молекулярном составе биологических жидкостей ротовой полости и связи данных изменений с конкретным типом патологии [12].

Идеальным кандидатом на роль нового объекта скрининга могла бы быть дентинная жидкость, которая играет весомую роль в развитии кариеса дентина [13]. Дентинная жидкость представляет собой производную плазмы крови, содержащую сывороточные белки и иммуноглобулины, с растворенными минеральными веществами [3]. Дентинная жидкость движется из пульпы, заполняет разветвленную сеть дентинных канальцев со скоростью 4 мм/ч, по мнению некоторых авторов, при гидростатическом давлении около 30 мм рт.ст., или даже от 6,9 кПа, что соответствует 51,8 мм рт.ст, затем проникает в межпризменные пространства эмали со скоростью 0,1 мм/ч, циркулирует по ним, активно взаимодействуя с твердыми тканями зуба, а также зачастую служит питательной средой для микроорганизмов [4]. Учитывая, что гидростатическое давление в интерстициальном пространстве соединительной ткани пульпы составляет около 8 мм рт.ст., а коллоидноосмолярное давление — около 10 мм рт.ст., давление в дентинных канальцах со стороны пульповой камеры будет достигать 8—10 мм рт.ст., так как в противном случае не будет функционировать транскапилярный обмен при давлении 30—50 мм рт.ст., как указывает ряд авторов [4].

К сожалению, использование дентинной жидкости для диагностики патологии в глубоких тканях зуба человека — непростая задача. Основная сложность такого диагностического подхода заключается в сложном алгоритме извлечения дентинной жидкости, в случае, например, фиссурного кариеса, когда речь идет о выявлении воспалительных процессов в дентине. Кроме того, нецелесообразность и неэтичность этой процедуры очевидны при наличии начального кариеса и в отсутствие фактов, подтверждающих воспаление в дентине зубов.

Десневая жидкость в отличае от дентинной значительно доступнее для забора и исследования [8]. Она заполняет десневую борозду между свободным краем десны и зубом и представляет собой продукт транссудации плазмы крови из капиллярного русла десневого сосочка. Основными компонентами десневой жидкости являются белки, ферменты, гексозамины, молочная кислота, фосфолипиды, нейтральные липиды, мочевина, ионы аммония и электролиты.

Хотя десневая жидкость представляет собой транссудат крови, ее pH имеет более щелочную реакцию — 7,9—8,3 при pH плазмы крови 7,4. Отличие pH десневой жидкости от pH крови обусловлено высоким содержанием в ней мочевины, ионов аммония и катионных протеинов. Кроме того, ионный состав десневой жидкости также отличается о плазмы крови, так как количество ионов натрия и калия в десневой жидкости выше, чем в тканях десны, и значительно ниже, чем в плазме крови [14].

Следует отметить, что в литературе нет информации о сопоставлении молекулярного состава дентинной и десневой жидкостей, а также данных об изменениях в конформационном окружении белков при развитии патологических изменений в дентине с целью выявления спектроскопических сигнатур — маркеров патологий.

Цель исследования — изучение молекулярного состава дентинной и десневой жидкостей, а также их диагностического потенциала для превентивного скрининга кариозных процессов в дентине.

Материал и методы

Дизайн исследования. В исследовании приняли участие 10 человек (5 мужчин и 5 женщин) в возрасте от 22 до 28 лет. Все участники исследования были соматически здоровыми, не принимали антибиотики, лекарственные препараты, не курили и не употребляли алкоголь. Все участники до экспериментов не имели записей в их истории болезней в течение года. Пациенты воздерживались от еды за 12 ч и употребления жидкости, по крайней мере, в течение 2 ч до сбора у них образов биологических жидкостей. Эти образцы брали у пациентов после предварительной очистки ротовой полости в период с 10 до 12 ч дня для минимизации влияния циркадного ритма. От каждого пациента были взяты три образца биологических жидкостей: дентинная жидкость, жидкость из десневой борозды и кровь.

Методика взятия образцов. С учетом микрообъемов десневой жидкости, получаемых из десневой борозды, в данном исследовании были подготовлены специализированные наконечники для забора биологических жидкостей (рис. 1). Использованный нами наконечник представлял собой микрокапилляр с внешним диаметром 800 микрометров, заполненный гомогенизированным порошком KBr, который уплотнялся нетканым фильтром (см. рис. 1, а). KBr выступил в роли инертного носителя исследуемой жидкости, а его выбор в роли наполнителя основан на отсутствии у этого материала полос поглощения в широком диапазоне инфракрасного спектра.

Рис. 1. Микрокапилляр для забора биологических жидкостей.

а — капилляр с зонами: 1 — чистый KBr, 2 — нетканый фильтр, 3 — переходник на микробюретку; б — диаметр наконечника микрокапилляра 0,5 мм; в — пример забора десневой жидкости; г — экспериментальная установка для исследования образцов биологических жидкостей, полученных с использованием микрокапилляра (Hyperion_2000).

Микрокапилляр присоединяли к стерилизованному шприцу. Разность давления в микрокапилляре при заборе жидкости создавалась либо за счет поршневого механизма подсоединяемого шприца, либо с использованием вакуумирующей установки. При достижении необходимой разности давлений в капилляре на бромид калия поступала биологическая жидкость.

Получение образцов. Дентинная жидкость. На момент обследования у каждого участника эксперимента имелись зубы с подозрением на поверхностный кариес эмали. Явных признаков развития парадонтита или гингивита у пациентов не выявлено.

Выявление кариозного процесса в зубах было выполнено на основе развитого нами ранее подхода, когда микроучастки твердых тканей зуба вследствие начинающейся дезориентации кристаллов апатита, имели более высокий выход флюоресценции, чем области интактной эмали [15].

Пациентам с кариесом после изолирования зуба при помощи коффердама препарировали эмаль и дентин с помощью микромоторного воздушного наконечника при скорости вращения стального шаровидного бура из легированной вольфрамованнадиевой стали 4000 оборотов в минуту.

После препарирования фиссуры эмали жевательной поверхности зуба до обнажения дентина наблюдался инфицированный деминерализованный слой дентина желтоватого оттенка. После того как в результате осмотра было подтверждено развитие кариеса дентина, брали образцы дентинной жидкости из препарированной полости с использованием микрокапилярного наконечника и вакуумной установки АЛП-02. Для этого с помощью резиновой манжеты создавали герметичное уплотнение на жевательной поверхности отпрепарированного зуба с последующим подключением к вакуум-аппарату АЛП-02, что позволяло создавать под резиновой манжетой разряжение около 0,9 кгс/см² и получить в течение 1 мин образец дентинной жидкости.

Взятие жидкости из десневой борозды. Образец десневой жидкости был взят у каждого пациента из десневой борозды того же зуба, из которого предварительно был выполнен забор дентинной жидкости. В случае забора образцов десневой жидкости пациент предварительно тщательно ополаскивал ротовую полость. После этого для изоляции участка забора десневой жидкости зубы пациента с вестибулярной и оральной стороны обкладывали стерильными ватными валиками. Участок забора жидкости просушивали воздухом из безмасляного компрессора и с помощью микрокапилляра забирали жидкость из десневой борозды зуба.

Взятие образцов крови. Образец крови у каждого пациента брали из той же самой десневой борозды, из которой был взят предварительно образец десневой жидкости. С помощью стерильного зонда проводили зондирование десневой борозды с забором капли крови. Эту кровь забирали с использованием микрокапилляра.

Методика исследования. После забора образцов порошок KBr из микрокапиляров, содержащих биологические жидкости, высушивали при комнатной температуре и исследовали методом инфракрасной спектромикроскопии.

Исследования молекулярного состава образцов дентинной жидкости, десневой жидкости и крови человека были выполнены с использованием методики инфракрасной спектроскопии с привлечением оборудования канала Infrared Microspectroscopy (IRM) австралийского синхротрона.

При использовании методики инфракрасной спектроскопии изучаемая система подвергается слабым внешним воздействиям, поэтому информация о молекулярном составе может быть получена от образца без изменений в результате этого воздействия [16].

Разрешение этического комитета

Все участники исследования дали свое письменное согласие на участие в нем. Комитет по этике Воронежского государственного университета утвердил проведенное исследование (номер разрешения 001.0047−2017). Исследование проводилось в соответствии с утвержденными принципами.

Результаты и обсуждение

Анализ экспериментальных данных, полученных методом инфракрасной спектромикроскопии, показал, что спектры однотипных образцов внутри группы участников эксперимента содержат абсолютно один и тот же набор колебательных мод, что свидетельствует о сопоставимости молекулярного состава изучаемых биологических жидкостей ростовой полости. Кроме того, эти спектры незначительно отличаются друг от друга лишь в изменении интенсивности колебательных полос. Поэтому в работе на рисунках приведены усредненные по группам участников эксперимента спектры образцов, а все дальнейшие расчеты выполнены на основе анализа усредненных спектров. Следует отметить, что процедура усреднения спектров по экспериментальной группе позволяет в итоге избавиться от случайных ошибок эксперимента и индивидуальных особенностей лиц в конкретной группе [7].

На рис. 2 представлены инфракрасные спектры пропускания образцов крови, дентинной и десневой жидкости пациентов. Анализ полученных данных и расшифровка инфракрасных спектров были выполнены на основе ряда источников литературы, в которых методом FTIR исследовались образцы биологических жидкостей ротовой полости, белки и аминокислоты [11, 17, 18].

Из полученных нами экспериментальных данных (см. рис. 2) следует, что основные интенсивные колебательные полосы в инфракрасных спектрах образцов крови, дентинной и десневой жидкостей принадлежат следующим группам и комплексам.

Рис. 2. Инфракрасные спектры в области 3700—2750 см^–1 (а) и сопоставление инфракрасных спектров в области 2200—850 см^–1, усредненных по группам образцов крови, десневой и дентинной жидкости человека.

1 — дентинная жидкость; 2 — десневая жидкость; 3 — кровь; 4 — мочевина.

Первая и наиболее интенсивная группа колебаний, расположенная в области 1725—1190 см^–1, принадлежит протеинам. Среди этой группы могут быть выделены полосы вторичных амидов: Амид I (в области 1725—1590 см^–1), Амид II (в области 1590—1500 см^–1) и Амид III (в области 1350—1190 см^–1), а также колебания групп CH₂/CH₃, расположенные в области 1480—1350 см^–1 [11, 17, 18].

Следующая большая группа колебательных полос, локализованных в пределах 3600—2800 см^–1 относится к наличию в образцах молекулярных групп от производных протеинов (α-амилаза, альбумин и т.д.), липидов и жирных кислот.

Третья группа колебаний в спектрах, расположенная в пределах 1130—900 см^–1, принадлежит молекулярным связям, относимым к фосфатам, глицерофосфатам и фосфолипидам [19], а также карбогидратам и производным ДНК структур. Следует отметить, что если для образцов дентинной и десневой жидкостей эта группа колебательных полос содержит широкий набор колебаний, соотносимых с минеральной составляющей (производными фосфора), то у образца крови в этой области расположены низкоинтенсивные моды, принадлежащие молекулярным группам карбогидратов и производным ДНК.

Наряду с описанными основными высокоинтенсивными группами мод в спектрах образцов обнаруживаются полосы, интенсивность которых значительно меньше, чем у первых трех групп. Однако их появление в спектрах является сигнатурой как протеомики конкретной биологической жидкости, так и развития патологического процесса в ротовой полости.

При детальном рассмотрении представленной на рис. 2, а области спектра 3700—2750 см^–1 обращает внимание перераспределение интенсивностей отдельных максимумов в этой группе колебаний в образцах крови, десневой и дентинной жидкостей человека. Как и следовало ожидать, в образцах сыворотки крови заметно значительное влияние белковой составляющей, что проявляется в увеличении интенсивности колебаний, локализованных около 3500—3409 см^–1 и относимых к ОН-группам, содержащихся в белках [11, 18]. В то же время в спектре дентинной (в большей мере) и десневой (в меньшей мере) жидкости в области около 3450 см^–1 и около 3350 см^–1 появляются особенности в виде плечей (обозначены на рис. 2 линиями), которые не наблюдаются в спектре образца крови. Это может свидетельствовать о наличии связей (NH)(NH₂) вторичных структур. Хорошо известно, что в отличие от крови в составе десневой жидкости содержится в большом количестве мочевина, имеющая в своем молекулярном составе связи (NH)(NH₂). Инфракрасный спектр мочевины представлен на рис. 2, а, б. Хорошо видно, что характеристические особенности в спектре мочевины (моды колебаний), расположенные в области около 3450 см^–1 и около 3350 см^–1, а также около 1680 см^–1 и 1470 см^–1, могут быть идентифицированы в спектре дентинной и десневой жидкостей. При этом в дентинной жидкости содержание этих молекулярных групп значительно выше, чем в десневой. Это может указывать на существование молекулярного обмена между дентинной и десневой жидкостями.

Анализируя экспериментальные данные инфракрасной спектроскопии, следует отметить отсутствие в инфракрасном спектре дентинной жидкости низкоинтенсивных полос в области 2875—2855 см^–1, относимых с молекулярными группами CH₃ и CH₂ фосфолипидов и жирных кислот, а также наличие в спектре низкоинтенсивных мод колебаний около 2930 см^–1 и 1735 см^–1, соотносимых с липидами. Анализ аналогичных групп колебаний и соотношений интенсивностей между ними в спектре десневой жидкости показал хорошее соответствие с данными литературы [20]. В то же время в спектре сыворотки крови наблюдается отличающееся от известного в литературе соотношение интенсивностей максимумов для группы колебаний, лежащей в области 3000—2855 см^–1, что связано с иным соотношением фракций липидов в экспериментальных образцах [21].

Особое внимание в инфракрасных спектрах всех трех типов биологических жидкостей привлекли следующие области: 2200—1800 см^–1, 1765—1725 см^–1, 1171—1160 см^–1 и расположенные в них колебания.

Первая группа колебаний, расположенных в диапазоне 2200—1800 см^–1, имеется только в спектрах дентинной и десневой жидкостей. Эти полосы могут соответствовать тиоцианатам [7, 22], которые являются индикаторами патологических процессов в ротовой полости и содержание которых увеличивается в случае заболеваний кариеса и пародонта [7]. Обратим внимание, что несмотря на высочайшее качество пробоподготовки, в этой области спектра также наблюдаются низкоинтенсивные колебания абсорбированного на образцах сыворотки крови, десневой и дентинной жидкости углекислого газа CO_2. Однако в спектрах дентинной и десневой жидкостей наличие в области 2098—2065 см^–1 колебаний, относимых к тиоцианатам, значительно выше, чем интенсивность моды CO₂. Вторая группа — инфракрасные колебания в области 1765—1725 см^–1. В соответствии с данными работ [23, 24] эта полоса в спектре представляет собой колебание >C=O, соотносится с карбоновой группой сложного эфира и наблюдается при кариесе зубов [24].

Третья полоса колебаний, расположенная в области 1171—1160 см^–1, относится к карбогидратам, повышение уровня которых в ротовой жидкости, как было показано в нашей предыдущей работе [7], свидетельствовало о развитии кариозного процесса. И если в образце крови карбогидраты практически не фиксируются, то в образцах дентинной и десневой жидкостей их уровень достаточно высок.

Анализ и обсуждение полученных результатов. На основе данных, полученных методом инфракрасной спектроскопии и подхода, апробированного в ряде наших предыдущих работ [7, 19], мы смогли сопоставить молекулярный состав крови, дентинной и десневой жидкостей, взятых у пациентов с кариесогенной патологией в дентине. В этих работах [7, 19] нами показано, что математическая оценка молекулярного состава биологической жидкости человека может быть дана на основе расчета и анализа различных соотношений (коэффициентов) между органическими и минеральными составляющими образца жидкости. При использовании предложенных подходов весьма удобно будет применять следующие коэффициенты.

Первый коэффициент: K1 (Амид II/ Амид I) может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы Амид II к интегральной интенсивности полосы Амид I.

Второй коэффициент K2 — тиоцианат/белок, предложенный в работе [22], может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы колебаний −N=C=S, расположенной в области 2100—2050 см^–1 и соотносимой с тиоцианатом, к интегральной интенсивности амидных полос (Амид I и Амид II).

Соотношение K3 — Эфир/Амид I определяется соотношением интегральной интенсивности карбоновой группой сложного эфира в области 2100—2050 см^–1 к интегральной интенсивности полосы Амид I.

Расчет этих отношений был произведен нами с использованием программного обеспечения OPUS 7.2 к инфракрасному спектрометру. Результаты расчетов соотношений K1—K3 приведены в таблице.

Расчетные коэффициенты для различных соотношений интегральных площадей выбранных полос инфракрасных спектров крови, десневой и дентинной жидкостей

Образец	K1 Амид I/ Амид II	K2 Тиоцианат/ Амиды I+II	K3 Эфир/ Амид I
Дентинная жидкость	1,3	0,12	0,09
Десневая жидкость	1,4	0,03	0,07
Кровь	1,3	0,004	0,004

Напомним, что соотношения K1—K3 рассчитаны на основе спектров, усредненных по группе участвовавших в исследовании пациентов.

Анализируя полученные результаты, следует отметить, что при развитии кариеса дентина в органической компоненте взятых образцов крови, десневой и дентинной жидкостях доля связей CN и NH по отношению к доле связей C=O (коэффициент K1) практически не изменяется.

Однако наиболее очевидные изменения в молекулярном составе биологических жидкостей — спектроскопические сигнатуры, связанные с развитием кариеса дентина, — могут быть обнаружены на основе анализа коэффициентов K2 и K3. Минимальные и едва различимые значения этих коэффициентов могут быть обнаружены при анализе крови, в то же время рост уровня тиоционатов (K2) и сложных эфиров (K3), сопровождающий развитие кариеса [7], фиксируется в образцах дентинной и десневой жидкостей (см. рис. 2, б). Надо полагать, что больший уровень этих маркеров развития кариеса дентина определяется в дентинной жидкости, но при этом и в десневой жидкости они могут быть достоверно обнаружены и указывать на то, что происходящие изменения в ее составе связаны с развитием патологических процессов в дентине.

Хорошо известно, что вторжение бактерий в дентинные канальцы происходит из-за нарушения целостности эмали или цемента зуба [25]. В этом случае метаболиты бактерий диффундируют через эмалевые канальцы (рис. 3), затем в дентинные трубочки и приводят к развитию патологических процессов в глубоких тканях зуба [13].

Рис. 3. Устья эмалевых канальцев и ямки (а, ×700) и устье эмалевого канальца (б; ×2000) на поверхности эмали в области эмалево-цементной границы зуба человека: электронное изображение поверхности эмали зуба в режиме вторичной электронной эмиссии.

При этом весьма вероятно, что дентинная жидкость и содержащиеся в ней маркеры патологических процессов в твердой ткани зуба могут попасть по дентинным трубочкам в десневую борозду и смешаться с жидкостью из десневой борозды, которая является транссудатом сыворотки крови [13]. Поэтому, как показывают последние исследования, в дентинной жидкости может содержаться характерный набор белков и других молекул, сигнализирующих о развитии патологии, инфекции или развитии воспалительного процесса в тканях [3, 4].

Таким образом, полученные в нашей работе результаты свидетельствуют о том, что развитие кариозных процессов в дентине находит отражение в составе биологических жидкостей. Определенные нами изменения как в составе дентинной жидкости, так и во вторичной структуре ее белка являются достоверными спектроскопическими сигнатурами патологий и могут быть легко выявлены без трудоемкого и нецелесообразного извлечения дентинной жидкости, поскольку одновременно содержатся и в десневой жидкости, забор которой для скрининга не представляет собой столь сложной задачи.

Заключение

Из сказанного следует, что дентинная и десневая жидкости обладают не менее сложным составом, чем сыворотка крови. При этом, несмотря на то что первые две жидкости являются производными сыворотки крови и большинство молекулярных групп во всех трех жидкостях обнаруживаются в их инфракрасных спектрах, полученные результаты свидетельствуют, что существует ряд сигнатурных мод, которые фактически имеются лишь в инфракрасных спектрах дентинной и десневой жидкостей, взятых у пациентов с развивающимся кариесом дентина. Это означает, что при определенных условиях может осуществляться молекулярный обмен между дентинной и десневой жидкостями. Это обусловливает их высокий диагностический потенциал для исследований патологических процессов, происходящих в ротовой полости человека.

Нами зафиксирован рост уровня тиоционатов и сложных эфиров в образцах как дентинной, так и десневой жидкости при развитии кариозного процесса в дентине.

Применение для скрининга десневой жидкости, забор которой для анализа не представляет собой столь сложной задачи, как взятие дентинной жидкости, будет способствовать переходу к персонализированной медицине, развитию высокотехнологичного здравоохранения и технологий здоровьесбережения в целом.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-00003).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interests.