Плоский лишай (ПЛ) — хроническое полиэтиологичное воспалительное заболевание кожи и слизистых оболочек. ПЛ — наиболее часто встречающееся дерматологическое заболевание, при котором в патологический процесс вовлекается и слизистая оболочка рта (СОР) [1].

Клинически выделяют 6 форм ПЛ СОР: типичную, экссудативно-гиперемическую, эрозивно-язвенную, буллезную, гиперкератотическую и атипическую. Особый интерес представляют типичная и эрозивно-язвенная формы как наиболее часто встречающиеся [2].

Этиология ПЛ все еще остается неизвестной, но его возникновение связывают со стрессом, генетической предрасположенностью, патологией кишечника, приемом лекарственных средств, гипертензией, инфекциями, химическими веществами, использующимися в стоматологии при протезировании, и аутоиммунными заболеваниями [3].

Изучение данного заболевания актуально, так как патогенез ПЛ до конца не изучен. В 0,4—6,5% случаев [4, 5] возможна его трансформация в плоскоклеточный рак СОР. Значительный рост заболеваемости ПЛ делает необходимым не только выявление этиологических, клинических и гистологических признаков, связанных с предраковой природой ПЛ, но и изучение молекулярных механизмов возникновения ПЛ, которые могут лежать в основе канцерогенеза [6].

Цель данного исследования — изучение иммуногистохимических (ИГХ) критериев развития ПЛ.

В работе использовали операционный материал отделения заболеваний СОР (зав. — д.м.н. О.Ф. Рабинович) и архивный материал лаборатории патологической анатомии (зав. — д.м.н., проф. И.И. Бабиченко) ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава Р.Ф. за период с января 2007 г. по декабрь 2014 г. Были исследованы биоптаты СОР 44 пациентов (36 женщин и 8 мужчин; средний возраст — 52,5 года) с диагнозом ПЛ. В качестве контрольной группы было отобрано 10 случаев неизмененной слизистой с диагнозом фибромы СОР (8 женщин и 2 мужчин; средний возраст — 50 лет).

По формам заболевания пациенты распределились так: 1-я группа — с типичной формой ПЛ (n=10, женщин — 7, мужчин — 3); 2-я группа — с эрозивно-язвенной формой (n=34, женщин — 29, мужчин — 5); 3-я группа (контроль): фиброма СОР.

Изучение биопсийного материала СОР при ПЛ проводилось при подозрении на малигнизацию процесса. Кусочки ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4) в течение 24 ч после проводки на гистопроцессоре карусельного типа STP 120 и станции заливки EC-350 заливали в парафин с температурой плавления 54 °C. Затем изготовляли серийные срезы толщиной 5 мкм, которые впоследствии окрашивали в автоматическом режиме гематоксилином и эозином на аппарате Microm HMS 740 Thermo scientific и заливали в канадский бальзам.

ИГХ-исследование биопсийного материала проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Из блоков, приготовленных для гистологического исследования на микротоме, нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинизацию и высокотемпературную демаскировку антител осуществляли при помощи PT-модуля в течение 20 мин при 98 °C, затем срезы промывали буфером Трис-HCl (pH 7). ИГХ-реакция осуществлялась с помощью Autostainer 360 Thermo scientific.

Тканевые антигены определяли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 (ММ1 «Diagnostic Biosystems»), кроличьих поликлональных антител к C3d («Cell Marque»), мышиных моноклональных антител кCD1а (МТВ1, «Cell Marque»), кроличьих поликлональных антител к CD4 (SP35, «Cell Marque»), мышиных моноклональных антител к CD8 (С8/144 В, «Cell Marque»), мышиных моноклональных антител к CD16 (2Н7, «EPITOMICS»), мышиных моноклональных антител к CD25 (4С9, «Cell Marque»), кроличьих поликлональных антител к фактору некроза опухолей-α (ФНО-α) («ABBIOTEC»), кроличьих поликлональных антител к IgG («Cell Marque») и мышиных моноклональных антител к Е-кадгерину (SPM471, «Thermo Scientific»). Иммунные комплексы выявляли с помощью системы детекции «UltraVision Quanto Detection System HRP DAB». Срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Индекс пролиферации (ИП) по Ki-67 (ИП Ki-67; %) определяли как отношение клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 10.0 стандартными методами. Учитывая ненормальное распределение полученных статистических показателей, сравнение 2 независимых групп осуществляли непараметрическим методом с помощью U-критерия Манна—Уитни.

Нами проведено гистологическое исследование СОР при типичной и эрозивно-язвенной формах П.Л. Группу контроля представлял операционный материал после хирургических вмешательств по поводу фибромы СОР. В подобных препаратах отсутствуют морфологические изменения поверхностного эпителиального слоя и нет лимфоцитарной инфильтрации собственной пластинки СОР.

При типичной форме ПЛ в СОР отмечаются эозинофильные коллоидные тельца, которые представляют собой разрушенные кератиноциты базального слоя (тельца Сиватта), заостренной формы эпителиальные выросты в дерму; выраженная лимфоцитарная инфильтрация в собственной пластинке СОР и эпителиальном слое.

Изменения СОР при эрозивно-язвенной форме характеризуются наличием глубокого дефекта, по периферии которого наблюдаются некроз и десквамация эпителия. Дно дефекта составляет собственная пластинка СОР с бесструктурными некротическими массами, фибринозным воспалением на поверхности и развитием грануляционной ткани в нижележащих слоях. В сохранной собственной пластинке СОР определяется плотный воспалительный лейкоцитарный инфильтрат с многочисленными капиллярами, фибробластами и коллагеновой стромой.

Повышение пролиферативной активности клеток является основным звеном патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67 считается универсальным маркером пролиферирующих клеток, так как выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме G0 [7]. В связи с этим были изучены особенности экспрессии белка Ki-67 в неизмененном эпителии и при ПЛ.

При ИГХ-исследовании экспрессия белка Ki-67 наблюдалась в ядрах эпителиальных клеток. На рисунке, а (см.) представлено распределение иммунопозитивных клеток в неизмененном эпителии СОР. Видно, что большинство эпителиоцитов с окрашенными ядрами располагаются в базальном и парабазальном клеточных слоях. На рисунке, б (см.) показано распределение иммунопозитивных клеток в эпителии СОР при типичной форме ПЛ, при этом видна положительная окраска только в отдельных клеточных ядрах базального слоя.

Количественный анализ показал, что в базальном и парабазальном слоях неизмененного эпителия СОР индекс пролиферативной активности составляет 33,6±7,0%. При П.Л. количество пролиферирующих клеток в этих слоях было достоверно снижено (р=0,0045) и составляло в среднем 21,7±10,2%.

Для типичной формы ПЛ в отличие от эрозивно-язвенной характерно наличие эпителиального слоя. С целью выявления начальных изменений в эпителии мы изучили экспрессию клетками белка межклеточных контактов Е-кадгерина. При начальных клинических проявлениях ПЛ в базальном слое СОР выявляется потеря межклеточных связей. По мере увеличения внутриэпителиального клеточного инфильтрата, начиная с базального слоя, в структуре эпителия появляются неокрашенные пространства, скорее всего соответствующие апоптозу базальных эпителиоцитов и описанные ранее как формирование телец Сиватта (см. рисунок, в). Потеря межклеточных связей в базальном и шиповатом клеточных слоях СОР при выраженных клинических проявлениях ПЛ приводит к формированию эрозивно-язвенной формы ПЛ.

Для изучения патологических механизмов, лежащих в основе разрушения СОР при типичной форме ПЛ, было проведено ИГХ-исследование антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (с антителами CD1a), тучных клеток (CD25), Т-клеточных элементов (CD4, CD8 и CD16), экспрессии ФНО-α.

При начальных клинических проявлениях типичной формы ПЛ в СОР выявляется повышенная по сравнению с контролем концентрация антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (см. рисунок, г), что является триггерным механизмом иммунного клеточного ответа на появление экзогенных антигенов в СОР.

При начальных клинических проявлениях ПЛ в эпителии СОР выявляется повышенная по сравнению с контролем концентрация тучных клеток (см. рисунок, д); в большом количестве эти клетки присутствуют и в воспалительном инфильтрате собственной пластинки СОР.

Ввиду наличия большого количества лимфоцитов в эпителии при типичной форме ПЛ было проведено ИГХ-исследование с антителами, выявляющими Т-хелперы (CD4), Т-супрессоры (CD8) и Т-киллеры (CD16). Исследование показало, что при типичной форме ПЛ как в эпителиальном слое, так и в клеточном инфильтрате собственной пластинки СОР определяется большое количество иммунопозитивных клеток CD4, CD8 и CD16 (см. рисунок, ж, з).

Известно, что иммунологический клеточный ответ начинается с генерации ФНО-α макрофагами, тучными клетками и Т-лимфоцитами [8]. ФНО-α является основным медиатором воспаления и участвует в инициировании воспалительного процесса, влияя на механизмы эндотелиальной адгезии и оказывая хемотаксическое действие на лимфоциты и макрофаги. Поэтому в настоящем ИГХ-исследовании изучалось распределение ФНО-α при типичной форме ПЛ.

В неизмененном плоском эпителии без воспалительного клеточного инфильтрата ФНО-α не выявляется. При типичной форме ПЛ обнаружена выраженная ИГХ-реакция в цитоплазме интраэпителиальных тучных клеток, лимфоцитов и клетках воспалительного инфильтрата СОР (см. рисунок, е).

Таким образом, при типичной форме ПЛ появление клеток Лангерганса, тучных клеток, CD4-, CD8- и CD16-лимфоцитов сопровождается высокой концентрацией в многослойном плоском эпителии СОР цитокина ФНО-α. Скорее всего, это связано с активацией механизмов апоптоза в кератиноцитах базального клеточного слоя под влиянием цитотоксических факторов тучных клеток и Т-супрессоров. Вероятно, именно активацией процесса апоптоза можно объяснить снижение количества пролиферирующих клеток и низкий процент малигнизации эпителия при ПЛ.

Для выявления механизмов некротических изменений при эрозивно-язвенной форме ПЛ было проведено ИГХ-исследование локализации IgG и фрагмента комплемента C3d в дне язвенного дефекта. В области язвенного дефекта вокруг сосудов отмечено интенсивное иммунохимическое окрашивание на IgG и элементы комплемента C3d, что свидетельствует об их участии в иммунокомплексном разрушении стенки сосудов и окружающих тканей. При эрозивно-язвенной форме ПЛ распределение молекул IgG происходит вокруг сосудов грануляционной ткани на дне язвенного дефекта; распределение молекул элементов комплемента C3d выявлено на дне язвенного дефекта, вокруг и внутри сосудов грануляционной ткани.

Данные исследования свидетельствуют о том, что в составе экссудата дна язвенного дефекта выявляются IgG, способные связываться с комплементом и вызывать иммунокомплексное разрушение стенок сосудов и окружающих тканей.

ИГХ-методом изучено распределение Т-лимфоцитов CD4, CD8 и CD16. Показано, что в области язвенного дефекта вокруг грануляционной ткани выявляются иммунопозитивные клетки CD4, CD8 и CD16.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при эрозивно-язвенной форме ПЛ в зоне дефекта СОР имеет место высокая активность иммунокомплексных и Т-клеточных механизмов иммунного воспаления.

В основе ПЛ лежит Т-клеточная хроническая воспалительная реакция. Гистологически она характеризуется субэпителиальной лимфоцитарной инфильтрацией, апоптозом базальных кератиноцитов, гиперкератозом и акантозом [9]. Базальные клетки эпителия являются основной мишенью этой воспалительной реакции при ПЛ, они разрушаются за счет активации в ходе клеточных иммунных реакций клеток Лангерганса, Т-лимфоцитов и макрофагов [10]. Большинство лимфоцитов представлено цитотоксичными CD8⁺-лимфоцитами, которые вызывают апоптоз кератиноцитов благодаря выделению ФНО-α [11].

В патогенезе ПЛ принимают участие и тучные клетки [12]. В настоящем исследовании показано увеличение количества тучных клеток. При их дегрануляции выделяется большое количество цитокинов и хемокинов, в том числе ФНО-α, который регулирует иммунный ответ и активирует Т-лимфоциты.

ВОЗ рассматривает ПЛ как предраковое заболевание [13]; вопрос о злокачественном потенциале ПЛ обсуждается до настоящего времени [5]. Для определения злокачественного потенциала лучше всего подходит маркер пролиферации Ki-67, экспрессия которого может повышаться при малигнизации ПЛ по сравнению с неизмененным эпителием [14—16]. В наших исследованиях при типичной форме ПЛ выявлено снижение пролиферативной активности клеток базального и парабазального слоев по сравнению с таковой в неизмененном эпителии. Это связано с активацией механизмов апоптоза в кератиноцитах под влиянием цитотоксических факторов тучных клеток и Т-супрессоров. Скорее всего именно активацией процесса апоптоза можно объяснить низкий процент малигнизации эпителия при ПЛ по сравнению с таковым при других формах хронической воспалительной реакции СОР.

Наши исследования подтверждают гипотезу P. Sugerman и соавт. [8], согласно которой в патогенезе ПЛ принимают участие антигенспецифические и антигеннеспецифические механизмы. Неизвестный до настоящего времени антиген, вызывающий развитие ПЛ, экспрессируется совместно с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости на поверхности кератиноцитов. Этот процесс модулируется дендритными клетками Лангерганса. Происходит активирование антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов CD8⁺; за счет CD4⁺ Т-лимфоцитов и запускается апоптоз кератиноцитов посредством секреции ФНО-α, который в свою очередь стимулирует адгезию лимфоцитов к мембранам эндотелия и способствует их выходу из сосудистого русла в ткани, формируя инфильтрат в собственной пластинке СОР.

Таким образом, в патогенезе ПЛ принимают участие специфические и неспецифические иммунные механизмы, формирующие порочный круг: активирование тучных клеток и Т-лимфоцитов, которое в свою очередь приводит к миграции новых Т-лимфоцитов, разрушению базальных эпителиоцитов и активированию тучных клеток.