Зависимость плоидного статуса эмбрионов от состояния веретена деления ооцитов, оцениваемого с использованием поляризационной микроскопии в программах ЭКО у женщин с эндометриозом яичников

Среди факторов, снижающих эффективность программ ЭКО, большую роль играет изменение плоидного статуса эмбрионов (количества хромосом в клетках), проявляемое чаще всего в виде анеуплоидии (уменьшение или увеличение стандартного набора хромосом в клетках). Распространенность этой патологии в общей когорте эмбрионов, полученных у женщин моложе 35 лет, составляет около 30%, причем в последующем доля эмбрионов с нарушениями плоидности продолжает прогрессивно увеличиваться, и у женщин старше 42 лет может достигать 80% и более [1]. Полагают, что хромосомные аномалии не только снижают вероятность успешной имплантации, уменьшая частоту наступления беременности на перенос эмбрионов (ЧНБпэ), но и становятся причиной 30—50% случаев ранних репродуктивных потерь и примерно 10% случаев мертворождений [2]. Предымплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) с использованием таких современных платформ, как сравнительная геномная гибридизация (array CGH) и секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS) позволяет выбраковывать неподходящие для переноса эмбрионы, что служит улучшению эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Существует мнение, что ПГТ-А наиболее целесообразно использовать при отборе эмбрионов, полученных у женщин позднего репродуктивного возраста (старше 40 лет) и при наличии тяжелого мужского фактора бесплодия [3, 4]. Аналогичное тестирование рекомендуют проводить женщинам с повторными (>3 попыток) неудачами имплантации или с привычным невынашиванием после исключения возможного наличия у них маточных факторов инфертильности [5, 6]. У пациенток, не относимых к перечисленным категориям высокого риска эмбриональной анеуплоидии, использование ПГТ-А не сопровождается заметным улучшением эффективности программ ЭКО, что, по мнению многих специалистов, означает нецелесообразность назначения этого достаточно дорогого диагностического метода для скрининга [7, 8]. По этой причине оценка генетических аномалий эмбрионов проводится относительно редко, что можно видеть из последних отчетных данных Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ), согласно которым в 2020 г. в России доля циклов ВРТ с применением всех существующих технических вариантов ПГТ составила всего 8,5% (в 2019 г. — 8,8%) [9]. Тем не менее представляет интерес поиск дополнительных критериев, которые могли бы уточнить ситуации, при которых назначение ПГТ-А могло бы оказаться полезным. Заслуживает внимания то, что в зрелых MII ооцитах при их визуальной оценке с использованием поляризационного микроскопа не всегда обнаруживается веретено деления — ахроматиновое сложное морфологическое образование, возникающее в клетке при ее митотическом или мейотическом делении и принимающее участие в расхождении хромосом. Такие ооциты могут успешно оплодотворяться и трансформироваться в эмбрионы с достаточно хорошими морфологическими характеристиками. Однако еще никто не задавался вопросом о том, какова может быть частота анеуплоидии среди таких эмбрионов. Очевидно, что ответ на этот вопрос мог бы обосновать целесообразность назначения ПГТ-А для оценки пригодности использования эмбрионов, генерированных из ооцитов с визуально не определявшимся веретеном деления. Это особенно актуально для пациенток с эндометриозом яичников, для которых типично резкое сокращение получаемых in vitro эмбрионов из-за часто наблюдаемого бедного ответа яичников на гонадотропиновую стимуляцию, что заставляет крайне бережно выполнять отбраковку получаемого генетического материала.

Цель исследования — у инфертильных женщин с наличием эндометриоза яичников и без него уточнить по данным ПГТ-А плоидный статус эмбрионов, генерированных из MII ооцитов с наличием и без визуально определяемого веретена деления.

Исследование выполнено в отделении репродуктологии Московского областного НИИ акушерства и гинекологии имени академика В.И. Краснопольского в 2020—2023 гг. В соответствии с поставленной целью объектом исследования явились ооциты (n), полученные после стимуляции суперовуляции в программе ЭКО—ИКСИ от инфертильных женщин без генитального эндометриоза (n=345), которые составили контрольную группу, и от пациенток с эндометриозом яичников (n=219) — основная группа. Причины инфертильности у взятых под наблюдение женщин с нормальным состоянием гонад ассоциировались с трубно-перитонеальным и/или мужским факторами бесплодия. Среди 80% больных эндометриозом яичников, помимо поражения гонад (в виде одно- или двусторонних одиночных или множественных эндометриоидных кист яичников), выявлялись и другие возможные причины инфертильности, чаще всего также связанные с трубно-перитонеальным и/или мужским факторами. Лишь у 20% пациенток с яичниковой формой эндометриоза это заболевание было единственной вероятной причиной подтвержденной инфертильности.

Для предупреждения искажающего влияния возрастного фактора на определявшиеся эмбриологические параметры в сравниваемые группы с эндометриозом яичников и в отсутствие его не включали женщин старше 36 лет.

Для стимуляции суперовуляции применяли различные препараты гонадотропинов в рамках либо стандартного длинного протокола с агонистом ГнРГ, либо короткого протокола с антагонистом ГнРГ. Агонисты ГнРГ назначали с 19—21-го дня предшествующего лечебному цикла, антагонисты ГнРГ — со дня достижения лидирующим фолликулом диаметра 14 мм при гонадотропиновой стимуляции. Длинный протокол преимущественно был использован при стимуляции суперовуляции у пациенток с эндометриозом яичников, тогда как короткий протокол — у пациенток с нормальным состоянием гонад.

Через 35—36 ч после введения триггера овуляции выполняли пункцию яичников с забором всех яйцеклеток диаметром >14 мм и уточняли наличие веретена деления в ооцитах, находящихся на стадии MII. Визуализацию веретена деления в MII ооцитах осуществляли при увеличении ×20 под инвертированным микроскопом, оснащенным поляризующей оптической системой OCTAX PolarAID. Наличие и положение веретена деления определяли при 37° непосредственно перед интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида (ИКСИ) через 39—41 ч после укола триггера.

Оплодотворенные ооциты культивировали в каплях среды под минеральным маслом при температуре 37° в атмосфере 6% CO₂, 5% O₂, 89% N₂. Через 16—18 ч после выполнения ИКСИ оценивали оплодотворение. Оценку развития бластоцист на 5—6-й день культивирования эмбрионов проводили по классификации Д. Гарднера [10], согласно которой хорошее качество констатировали у бластоцист с параметрами 3—6 AA, AB, BA, BB. Именно такие качественные бластоцисты отбирали для последующего выполнения ПГТ-А.

Иссечение блестящей оболочки эмбрионов выполняли на 4-е сутки культивирования при помощи лазерной системы OCTAX NaviLase. На 5—6-е сутки развития осуществляли биопсию клеток трофэктодермы эмбрионов, достигших стадии экспандированной бластоцисты хорошего качества (3—6 AA, AB, BA, BB). При выполнении биопсии отбирали 4—10 клеток трофэктодермы. Биоптат помещали в индивидуальные пробирки типа «Эппендорф», содержащие 2,5 мкл лизирующего буфера. Пробирки замораживали и транспортировали в генетическую лабораторию для предымплантационного генетического тестирования методом секвенирования нового поколения (NGS). Бластоцисты замораживали методом витрификации через 2—4 ч после биопсии трофэктодермы.

Полученные результаты обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, применяя компьютерную программу SPSS Statistics 22 (США). При парных сравнениях различия частот анализируемых показателей считали достоверными при уровне значимости p<0,05.

При оценке состояния веретена деления в MII ооцитах (в 345 ооцитах от женщин с нормальным состоянием гонад и в 219 ооцитах от пациенток с эндометриозом яичников) установлено, что доля зрелых яйцеклеток с визуализируемым веретеном деления, полученных от пациенток в отсутствие и с наличием эндометриоза яичников, статистически значимо не различалась, составив соответственно 20,5 и 17,7% (p=0,397; рис. 1). Эти результаты указывают на то, что эндометриодное поражение яичников не приводит к достоверному увеличению доли MII ооцитов с визуально не определяемым веретеном деления среди всех получаемых зрелых ооцитов.

Рис. 1. Частота выявления веретена деления в зрелых ооцитах, полученных от женщин с наличием эндометриоза яичников и без него.

Частота правильного оплодотворения MII ооцитов была достоверно выше в когорте зрелых яйцеклеток с визуализируемым веретеном деления как у пациенток с нормальным состоянием гонад (78,9 против 65,6%; p=0,02), так и у пациенток с эндометриозом яичников (79,7 против 63,4%; p=0,03; рис. 2). Из этих данных следует, что отсутствие визуально определяемого веретена деления в одинаковой степени достоверно снижает (примерно на 15%) частоту нормального оплодотворения ооцитов у больных как с наличием, так и без эндометриозного поражения яичников.

Рис. 2. Частота правильного оплодотворения зрелых ооцитов с визуально определяемым и неопределяемым веретеном деления у женщин с наличием и без эндометриоза яичников.

Частота бластуляции (образования бластоцист хорошего качества из правильно оплодотворенных MII ооцитов) имела тенденцию к повышению в когорте зрелых яйцеклеток с визуализируемым веретеном деления как у женщин с нормальным состоянием гонад (43,3 против 30%; p=0,111), так и у пациенток с эндометриозом яичников (43,7 против 30,8%; p=0,215; таблица). При суммировании этих результатов различие между частотой бластуляции в когортах MII ооцитов с исходным наличием и отсутствием визуализируемого веретена деления становилось достоверным (43,4 против 30,3%; p=0,043). Данное наблюдение свидетельствует, что правильно оплодотворенные ооциты, у которых исходно отсутствует визуализируемое веретено деления, примерно на 13% реже трансформируются в подходящие для переноса эмбрионы по морфологическим критериям, причем эта закономерность в одинаковой степени распространяется на ооциты, получаемые от женщин как без эндометриоза яичников, так и с эндометриозом.

Частота образования бластоцист хорошего качества из правильно оплодотворенных зрелых ооцитов с визуально определяемым и неопределяемым веретеном деления у женщин с наличием эндометриоза яичников и без него.

Примечание. BL+ — бластоцисты хорошего качества (2—4 AA, AB, BA, BB по Д. Гарднеру).

В сравниваемых группах частота анеуплоидии была заметно выше в когорте бластоцист, выращенных из оплодотворенных ооцитов с исходно не визуализируемым веретеном деления — 58,3 против 20,6% (p=0,006) у женщин с нормальным состоянием гонад и 75 против 22,6% (p=0,03) у больных с эндометриозом яичников. По этой причине доля эуплоидных эмбрионов оказалась гораздо более высокой среди бластоцист, полученных из MII ооцитов с наличием визуализируемого веретена деления — 71,1 против 41,7% у женщин с нормальным состоянием гонад (p=0,044), и 69,4 против 25% (p=0,014) у больных с эндометриозом яичников. Частота мозаичных эмбрионов в когортах бластоцист, выращенных из оплодотворенных ооцитов с исходным наличием и в отсутствие визуально определяемого веретена деления, была крайне незначительной и статистически значимо не различалась. Эти наблюдения позволяют констатировать, что бластоцисты, полученные из оплодотворенных ооцитов с исходно не определяемым веретеном деления, значительно чаще оказываются непригодными для переноса из-за их анеуплоидного статуса, подтверждаемого по результатам ПГТ-А. Следует подчеркнуть, что такая закономерность в одинаковой степени проявляла себя в когортах эмбрионов, полученных у женщин как с наличием, так и при отсутствии эндометриозного поражения яичников.

Эндометриоз с учетом его широкой распространенности в женской популяции традиционно привлекает пристальное внимание исследователей, специализирующихся в репродуктологии. Вопрос об истинных механизмах бесплодия у женщин с эндометриозом еще далек от своего окончательного разрешения, поскольку все существующие объяснения инфертильности при эндометриозе носят лишь предположительный характер [11—13]. Ряд специалистов полагают, что у женщин с любыми формами эндометриоза может страдать качество ооцитов и генерируемых из них эмбрионов из-за нарушений метаболизма в созревающих яйцеклетках [14, 15]. Спровоцированные эндометриозом изменения в гомеостазе женских гамет потенциально могут нести угрозу формированию веретена деления, которое представляет собой сложную морфологическую структуру из микротрубочек, обеспечивающих сегрегацию (отделение) хромосом при мейотическом созревании ооцита [16]. В свою очередь, изменения в веретене деления ооцита, вероятно, могут становиться причиной аномального расхождения хромосом, что может проявиться в изменениях плоидного статуса развивающихся эмбрионов [17, 18]. Для проверки правомерности этих предположений нами выполнено соответствующее исследование, для которого в основную группу мы отобрали пациенток только с яичниковой формой эндометриоза и не старше 36 лет. Взятие под наблюдение больных с яичниковой формой эндометриоза мы аргументировали тем, что из всех существующих проявлений эндометриоза именно его локализация в самих гонадах создает наибольшую угрозу для женских гамет из-за близости расположения патологических очагов. Отбор для исследования женщин не старше 36 лет ставил целью исключение влияния на получаемые результаты фактора старения репродуктивной системы, который, как известно из соответствующих публикаций [19—21], увеличивает риск развития эмбриональной анеуплоидии. Контрольную группу составили сопоставимые по возрасту инфертильные женщины с нормальным состоянием гонад.

Собранный материал о влиянии эндометриоза яичников на уточнявшиеся эмбриологические параметры позволяет констатировать, что наличие этого заболевания при заборе ооцитов после выполненной стимуляции суперовуляции не приводит к статистически значимому увеличению среди зрелых яйцеклеток доли MII ооцитов с визуально не определяемым веретеном деления. При этом у пациенток с пораженными эндометриозом гонадами, как и у пациенток со здоровыми яичниками, в когортах зрелых ооцитов, различающихся по критерию наличия/отсутствия визуализируемого веретена деления, при динамическом наблюдении отмечаются одни и те же закономерности, характеризующие эффективность оплодотворения и последующей бластуляции. Суть этих закономерностей состоит в том, что отсутствие визуально определяемого веретена деления в MII ооцитах достоверно снижает частоту как их нормального оплодотворения, так и бластуляции.

Как показало наше исследование, отсутствие визуально определяемого веретена деления в MII ооците можно рассматривать как важный прогностический маркер, указывающий на высокий риск формирования анеуплоидного эмбриона из такого ооцита. Об этом свидетельствуют полученные результаты, из которых следует, что частота эмбриональной анеуплоидии оказалась значительно более высокой в когорте бластоцист, которые были получены именно из MII ооцитов с невизуализируемым веретеном деления. При этом важно отметить, что выявленные отклонения плоидного статуса выращенных бластоцист не сопровождались ухудшением их морфологических характеристик. Из этого наблюдения следует, что при отборе подходящих для переноса эмбрионов, генерированных из ооцитов с исходно визуально не определявшимся веретеном деления, использование только морфологических (гарднеровских) критериев является явно недостаточным и требует дополнения за счет применения технологии ПГТ-А. Заслуживает внимания, что указанные закономерности проявляли себя абсолютно одинаково в когортах ооцитов, полученных у пациенток как с наличием, так и без эндометриоидного поражения яичников. Поэтому можно утверждать, что яичниковая форма эндометриоза не ассоциируется с возрастанием риска развития эмбриональной анеуплодии. Однако необходимо подчеркнуть, что если выращиваемые эмбрионы «происходят» из ооцитов с визуально не определявшимся веретеном деления, то среди них резко увеличивается частота анеуплоидии. Несомненно, что эта закономерность носит универсальный характер, поскольку проявляет себя в одинаковой степени в когортах ооцитов, полученных от пациенток с эндометриозом яичников и пациенток с нормальным состоянием гонад.

При выполнении эмбриологического этапа программ ЭКО у женщин с эндометриозом яичников и нормальным состоянием гонад целесообразно уточнять с помощью поляризационной микроскопии наличие веретена деления у всех выделенных зрелых ооцитов и в последующем проверять на наличие анеуплоидии с применением ПГТ-А все бластоцисты, генерированные из яйцеклеток с визуально не определявшимся веретеном деления.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ершова И.Ю., Краснопольская К.В.

Сбор и обработка материала — Самойлова А.А., Ершова И.Ю.

Статистическая обработка — Ершова И.Ю., Бочарова Т.В.

Написание текста — Ершова И.Ю., Бочарова Т.В.

Редактирование — Краснопольская К.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Ershova I.Yu., Krasnopol’skaya K.V.

Data collection and processing — Samoilova A.A., Ershova I.Yu.

Statistical processing of the data — Ershova I.Yu., Bocharova T.V.

Text writing — Ershova I.Yu., Bocharova T.V.

Editing — Krasnopol’skaya K.V.

Authors declare lack of the conflicts of interests.