Метаболические изменения тромбоцитов у беременных с гипертензивными расстройствами по показателям тромбоцитарных лизатов

Гипертензивные расстройства при беременности служат причиной неблагоприятных материнских и перинатальных исходов во всем мире. Патофизиология этого мультисистемного синдрома включает нарушение процессов плацентации, окислительный стресс, дисфункцию эндотелия, иммунные нарушения, наличие антиангиогенного состояния, внутрисосудистое воспаление, патологию гемостаза [1—4].

Основным компонентом системы гемостаза являются тромбоциты, которые регулируют состояние эндотелия сосудов и способствуют его восстановлению, участвуют также в процессах ангиогенеза, в воспалительных реакциях, антимикробной защите, реакциях иммунитета [5—7]. Функции тромбоцитов, состояние их мембран и рецепторов, синтез биологически активных веществ, которые выделяются тромбоцитами, зависят от внутриклеточных метаболических процессов. Метаболические изменения в тромбоцитах, определяющие клеточную энергетику и синтетические процессы в клетке, как правило, возникают на фоне гипоксии [8].

Необходимо понимание метаболических изменений в тромбоцитах в условиях патологии, поскольку эти изменения определяют их функциональное состояние и активность [9]. Ввиду многообразия функций, выполняемых тромбоцитами, их нарушения гетерогенны при различных клинических ситуациях. Оценка метаболической функции тромбоцитов составляет новую область исследований, направленных на оптимизацию лечения и диагностику заболеваний. Роль изменений метаболизма тромбоцитов во время беременности до сих пор неясна, а метаболические изменения в тромбоцитах при преэклампсии (ПЭ) остаются мало изученными. Имеются единичные публикации, посвященные особенностям метаболизма тромбоцитов при ПЭ. Так, при этой патологии выявлено снижение митохондриального дыхания тромбоцитов, количества аденозинтрифосфата (АТФ), изменения Ca²⁺-обмена [10—12].

В настоящее время остается много вопросов о роли метаболических изменений тромбоцитов в патогенезе гипертензивных расстройств у беременных.

Цель исследования — выявить метаболические особенности тромбоцитов у беременных с гипертензивными расстройствами по показателям тромбоцитарных лизатов¹.

Проведено обследование 176 беременных в сроке гестации 25—40 нед, поступивших в акушерскую клинику ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, соответствует принятым этическим принципам, одобрено локальным этическим комитетом института. До включения в исследование у всех беременных получено письменное информированное согласие.

В исследование было включено 128 беременных с гипертензивными расстройствами (основная группа). Основная группа была разделена на подгруппы по патогенетическому виду артериальной гипертензии (АГ): 1-я подгруппа включала 41 пациентку с хронической артериальной гипертензией — ХАГ (код МКБ-10 О10.0), 2-я — 87 пациенток с ПЭ (код МКБ-10 О11, О14), среди них подгруппа 2А — 48 беременных с ПЭ, возникшей de novo (код МКБ-10 O14) и подгруппа 2Б — 39 пациенток с ПЭ — с существовавшей ранее АГ и присоединившейся протеинурией (код МКБ-10 O11). Контрольную группу составило 48 беременных без гипертензивных расстройств. Критериями невключения в исследование служили вторичная АГ (код МКБ-10 O10.1, O10.2, O10.3, O10.4, O10.9), гестационная АГ (код по МКБ-10 O13), сахарный диабет, почечная недостаточность, острые воспалительные заболевания и обострения хронических.

Исследование гематологических показателей проводили до начала терапии на автоматическом гематологическом анализаторе ADVIA 2120i Siemens Healthcare Diagnostics с определением количества тромбоцитов (PLT, ·10³ кл/мкл), среднего объема тромбоцита (MPV, фл) с использованием пробирок Vacutainer с антикоагулянтом K3-ЭДТА.

Богатую тромбоцитами плазму (БТП) получали центрифугированием венозной крови при 300 g в течение 5 мин. До получения лизата стандартизировали количество тромбоцитов до 400·10³ в мкл. Полученные образцы замораживали при температуре ‒70 °C. После размораживания в лизатах тромбоцитов определяли уровень креатинкиназы. Для получения бесплазменного тромбоцитарного лизата БТП дополнительно центрифугировали при 700 g в течение 5 мин, удаляли надосадок и ресуспендировали тромбоциты в 0,9% растворе хлорида натрия в объеме, равном по объему удаленной плазме. Полученные образцы замораживали при температуре ‒70 °C. После размораживания образцы тромбоцитарных лизатов центрифугировали при 3000 g в течение 20 мин для удаления всех клеточных фрагментов. Условия хранения и исследований лизатов были одинаковыми [13]. В супернатантах оценивали уровни лактатдегидрогеназы (ЛДГ), лактата и магния. Исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе BeckmanCoulter AU 480 с использованием реактивов фирмы BeckmanCoulter. Чувствительность метода определения ЛДГ составляла 3 ед/л, лактата, — 0,001 ммоль/л, магния — 0,01 ммоль/л, креатинкиназы — 2 ед/л.

Возраст обследуемых пациенток колебался от 19 до 46 лет. Средний возраст женщин в контрольной группе составил 30,5 [28,0; 35,0] года, в подгруппе с ХАГ— 33,0 [27,0; 37,0] года, в подгруппе с ПЭ — 32,0 [26,0; 37,0] года, в подгруппе 2А с ПЭ, возникшей de novo, — 28,0 [28,0; 33,0] года, в подгруппе 2Б с ПЭ, развившейся на фоне ХАГ — 33,0 [30,0; 39,0] года. Средний возраст в подгруппе с ХАГ был статистически значимо старше, чем в подгруппе 2А с ПЭ, возникшей de novo (p=0,03). Статистически значимой связи между возрастом матерей и тяжестью гипертензивных расстройств не выявлено (p=0,15). Все беременные состояли на диспансерном учете в женской консультации. У 94,5% беременных с гипертензивными расстройствами было 8 посещений женской консультации или более. В I триместре беременности, при постановке на учет в женской консультации, в подгруппах с гипертензивными расстройствами отмечалось статистически значимо более высокое среднее артериальное давление (СрАД): 101,17 [93,3; 106,75] мм рт.ст. — в подгруппе с ХАГ, 95,4 [86,6; 97,6] мм рт.ст. — во всей группе с ПЭ, 93,3 [83,75; 96,6] мм рт.ст. в подгруппе 2А и 96,7 [93,33; 113] мм рт.ст. в подгруппе 2Б по сравнению с таковым в контрольной группе, где оно составило 86,6 [80,0; 93,3] мм рт.ст. (p=0,000 во всех группах). В подгруппах с ХАГ независимо от наличия ПЭ уровень среднего АД был самым высоким, превышая данный показатель в подгруппе 2А с ПЭ, возникшей de novo, различной степени тяжести (p=0,000 во всех наблюдениях).

Экстрагенитальная патология выявлена у 81,6% пациенток с ПЭ (p=0,002), у 66,7% пациенток подгруппы 2А — с ПЭ, возникшей de novo (p=0,001), у всех (100,0%) пациенток в подгруппах с ХАГ (p=0,000), что достоверно отличалось от этого показателя в контрольной группе (45,8%). Избыточная масса тела и ожирение связаны с повышенным риском развития ПЭ. При постановке на диспансерный учет во всех подгруппах с гипертензивными расстройствами имелся повышенный средний индкс масы тела (ИМТ): 32,7 [28,0; 33,4] кг/м² в подгруппе с ХАГ, 29,7 [25,5; 33,3] кг/м² в подгруппе с ПЭ в целом, 31,2 [27,49; 36,54] кг/м² в подгруппе 2А, 30,4 [27,3; 35,6] кг/м² в подгруппе 2Б, что статистически значимо выше, чем у пациенток контрольной группы (23,0 [21,0; 25,2] кг/м²; p=0,01). Ожирение достоверно чаще диагностировалось у пациенток с ХАГ (31,7%), ПЭ (20,7%), ПЭ, возникшей de novo (18,8%) и у пациенток с ХАГ и присоединившейся ПЭ (23,1%) в отличие от пациенток контрольной группы, у которых данная патология встречалась в 6,3% наблюдений (p=0,004, p=0,003 и p=0,004 соответственно).

В структуре осложнений беременности в III триместре задержка роста плода, по данным ультразвукового исследования, и нарушения маточно-плацентарного кровотока, по данным ультразвуковой допплерографии, диагностировались чаще в обеих подгруппах с ПЭ по сравнению с таковой в контрольной группе (p<0,001). При поступлении в стационар СрАД во всей подгруппе с ПЭ составило 111,3 [106,3; 120,0] мм рт.ст., в подгруппе 2А с ПЭ, возникшей de novo — 109,3 [105,0; 120,0] мм рт.ст., в подгруппе 2Б с ХАГ и присоединившейся протеинурией — 116,6 [108,0; 120,8] мм рт.ст. В настоящем исследовании выявлена статистически значимая связь преждевременных родов с наличием ПЭ. Частота преждевременных родов и, соответственно, рождение недоношенных детей в группе с ПЭ составили 56,3% (p<0,001).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программного пакета Statistica for Windows 6.0 (StatSoft Inc., США). Определение статистически значимых различий величин, отличных от нормального распределения, осуществляли при помощи U-критерия Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Полученные данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха МЕ [Q₁; Q₃]. Наличие признака представлено в формате n (число наблюдений в группе) и распространенности признака (%). Для корреляционного анализа вычисляли коэффициент корреляции Спирмена (r).

При сравнительном анализе содержания тромбоцитов в периферической крови пациенток обследуемых групп различия в значениях данного показателя не выявлены (p>0,05) (табл. 1).

Таблица 1. Показатели тромбоцитов у беременных с различными формами гипертензивных расстройств, ME [Q₁; Q₃]

Примечание.Здесь и в табл. 2:p₁ — для различий при сравнении с контрольной группой; p₂ — для различий при сравнении с 1-й подгруппой (с ХАГ).

Индивидуальный анализ показал, что сниженное количество тромбоцитов отмечено у 4,9% женщин с ХАГ, у женщин с ПЭ, возникшей de novo, низкое количество тромбоцитов выявлено в 14,6% наблюдений, что в 3 раза чаще, чем у женщин с ХАГ (р₂=0,01), в подгруппе 2Б (с ПЭ на фоне ХАГ), низкое количество тромбоцитов имели 7,7% пациенток. Показатель MPV у беременных с ПЭ был статистически значимо выше, чем у пациенток контрольной группы и подгруппы с ХАГ (p₁=0,007 и p₂=0,005 соответственно), аналогичные изменения отмечены в подгруппе 2А с ПЭ, возникшей de novo (p₁=0,01 и p₂=0,01 соответственно) и в подгруппе ПЭ, развившейся на фоне ХАГ (p₁=0,046 и p₂=0,028 соответственно).

Анализ биохимических показателей в лизатах тромбоцитов выявил их различия у обследованных женщин. Уровни биохимических маркеров в изучаемых группах представлены в табл. 2.

Таблица 2. Биохимические показатели в лизатах тромбоцитов у беременных с гипертензивными расстройствами, ME [Q₁; Q₃]

Примечание. p₃ — для различий между подгруппами с ПЭ возникшей de novo и ПЭ на фоне ХАГ.

По нашим данным, у пациенток с ХАГ достоверных различий биохимических показателей в лизатах тромбоцитов по сравнению с таковыми контрольной группы не выявлено (p>0,05).

У пациенток с ПЭ уровни лактата (p₁=0,0012 и p₂=0,0015), ЛДГ (p₁=0,0008 и p₂=0,016) в бесплазменных, богатых тромбоцитами лизатах, и креатинкиназы (p₁=0,014 и p₂=0,019) в лизатах обогащенной тромбоцитами плазмы были статистически значимо выше, чем в контрольной группе и группе с ХАГ, а уровни магния в бесплазменной среде (p₁=0,0031) были также статистически значимо выше, чем в контрольной группе.

В группе с ПЭ, возникшей de novo, было статистически значимо выше содержание ЛДГ (p₁=0,00018 и p₂=0,0032), лактата (p₁=0,0012 и p₂=0,019), магния (p₁=0,0033 и p₂=0,049) в бесплазменных лизатах тромбоцитов, а в лизатах обогащенной тромбоцитами плазмы — уровня креатинкиназы (p₁=0,0073 и p₂=0,0096) по сравнению с таковыми в контрольной группе и подгруппе с ХАГ.

У пациенток с ПЭ, возникшей на фоне ХАГ, отмечалось статистически значимо более высокое, чем в контрольной группе, содержание ЛДГ (p₁=0,049), лактата (p₁=0,025) и магния (p₁=0,039) в бесплазменных лизатах тромбоцитов.

При этом уровни ЛДГ и креатинкиназы были статистически значимо ниже, чем в группе с ПЭ, возникшей de novo (p₃=0,031 и p₃=0,015).

Установлены различия в показателях в зависимости от степени тяжести ПЭ. В группе с тяжелой ПЭ было статистически значимо более высокое содержание креатинкиназы (p=0,028) и магния (p₁=0,049) по сравнению с показателями при умеренной ПЭ (табл. 3).

Таблица 3. Биохимические показатели в лизатах тромбоцитов у беременных с преэклампсией разной степени тяжести ME [Q₁; Q₃]

Анализ корреляций выявил, что во всех группах беременных уровень ЛДГ лизатов тромбоцитов положительно коррелировал с выраженностью протеинурии (r=0,20; p=0,013) и MPV (r=0,33; p=0,0001) и отрицательно — с уровнем тромбоцитов (r= –0,33; p=0,0001). Уровни лактата в лизатах тромбоцитов были корреляционно взаимосвязаны с уровнем тромбоцитов (r= –0,20; p=0,0012), MPV тромбоцита (r=0,31; p=0,0001), ЛДГ тромбоцитов (r=0,34; p=0,0001), уровнем АД (r=0,24; p=0,002), выраженностью протеинурии (r=0,20; p=0,015). Уровни креатинкиназы в лизатах тромбоцитов коррелировали с уровнем АД (r=0,21; p=0,015) и протеинурией (r=0,22; p=0,012). Количество тромбоцитов было отрицательно взаимосвязано со средним объемом тромбоцита (r= –0,45; p=0,0001).

Результаты проведенного исследования подтверждают данные о наличии метаболических особенностей тромбоцитов при гипертензивных расстройствах у беременных. У пациенток с ПЭ повреждение эндотелия повышает его чувствительность к вазоактивным веществам, что приводит к вазоспазму, гиперкоагуляции, гипоксии и снижению доставки кислорода тканям. На фоне гипоксии метаболические изменения в тромбоцитах могут влиять на их энергетику и функциональное состояние. Ранее показана взаимосвязь между метаболическим дисбалансом в тромбоцитах и рецепторной активностью клеток, определяющей степень адгезии и агрегации тромбоцитов [8].

Одним из ключевых ферментов гликолиза, который катализирует взаимопревращение пирувата и лактата, является ЛДГ. По данным опубликованных работ, общий уровень ЛДГ в сыворотке крови беременных служит надежным и доступным маркером ПЭ, отражающим ее тяжесть и прогрессирование [14, 15]. Установлено, что высокие уровни ЛДГ коррелируют с высоким АД, а также с неблагоприятными материнскими и перинатальными исходами [16]. Однако есть противоположные суждения по этому вопросу. Ряд авторов отмечают отсутствие доказательства диагностической эффективности ЛДГ при гипертензивных расстройствах у беременных [17]. По нашим данным, в лизатах тромбоцитов в группах женщин с ПЭ имелось повышение уровней ЛДГ, максимально выраженное при ПЭ, возникшей de novo, по сравнению с показателями контрольной группы. Возможная причина таких изменений — усиление процессов анаэробного гликолиза, который активно протекает при высокой активности тромбоцитов в условиях гипоксии, повышенной циркуляции тканевого фактора и активности гемостаза при этой патологии, которые являются одними из важных факторов патогенеза этого осложнения [18, 19].

При активировании тромбоцитов их метаболические пути — гликолиз и окислительное фосфорилирование — значительно изменяются. Активация тромбоцитов является энергозависимым процессом, переход тромбоцитов из покоящегося состояния в активированное сопровождается усилением гликолиза [20]. Даже в инактивированных тромбоцитах гликолиз обеспечивает почти 65% необходимого АТФ [21], метаболизируя глюкозу анаэробным путем с образованием лактата [22]. Накопление лактата отражает активность гликолитического пути в тромбоцитах, а увеличение его концентрации коррелирует с падением pH [9, 23, 24]. Выявленные нами повышенные уровни лактата и ЛДГ в лизатах тромбоцитов беременных с ПЭ указывают на усиление анаэробного гликолиза. Можно предположить снижение выживаемости тромбоцитов у беременных с ПЭ, поскольку этот параметр тромбоцитов обратно коррелирует с уровнями лактата [24]. При этом уровни ЛДГ и креатинкиназы у пациенток с ПЭ, возникшей de novo, были статистически значимо выше, чем в группе с ПЭ, возникшей на фоне ХАГ, что подтверждает высокую активность тромбоцитов, которые, по-видимому, более интенсивно обновляются у беременных с ПЭ, возникшей de novo.

По нашим данным, уровни лактата в лизатах тромбоцитов коррелируют с уровнем ЛДГ тромбоцитов, MPV тромбоцита, уровнем АД и выраженностью протеинурии. Такие изменения метаболизма тромбоцитов формируются на фоне системной дисфункции эндотелия, которая имеется у беременных с ПЭ, и способствуют ее прогрессированию. Следует отметить, что уровни лактата и ЛДГ в тромбоцитарных лизатах беременных отрицательно коррелировали с количеством тромбоцитов в крови, что можно объяснить их усиленным потреблением в системе микроциркуляции. Кроме того, уровни лактата и ЛДГ в тромбоцитарных лизатах беременных положительно коррелировали с показателем MPV тромбоцита, что подтверждает связь метаболических особенностей тромбоцитов с их размерами и активностью.

В последние годы появились доказательства того, что высокий уровень креатинкиназы усиливает прессорные реакции и связан с АГ, обеспечивая сокращение сосудов, противодействует влиянию оксида азота и способствует задержке натрия в почках, является независимым предиктором неэффективности антигипертензивной терапии [25]. В нашем исследовании уровни креатинкиназы в лизатах тромбоцитов у беременных были повышены и коррелировали с уровнем АД и протеинурией. Учитывая данные литературы и собственные данные об увеличении уровней креатинкиназы в плазменных лизатах тромбоцитов у беременных с ПЭ, можно предположить ее участие в механизмах формирования гипертензии при этой патологии.

Кофактором ферментативных реакций, включая гликолиз, окисление жирных кислот, синтез циклического аденозинмонофосфата (АМФ), производство энергии, транспорт ионов через клеточные мембраны, является внутриклеточный магний (Mg). Находясь в комплексах с АТФ, магний обеспечивает высвобождение энергии через активность Mg-зависимых АТФаз [26] и контроль АД [27]. Дефицит магния вносит существенный вклад в нарушение тромбоцитарного гомеостаза и резистентность к антигипертензивной терапии [28]. Показана связь развития ПЭ с уровнями кальция и магния в сыворотке крови [29]. По данным одних авторов, выявлены значительно более низкие уровни магния в сыворотке крови у пациенток с гипертензией и ПЭ, особенно тяжелой степени, чем у пациенток без ПЭ [30—32]. По другим данным, у беременных с ПЭ наблюдалась гипермагниемия, что, по-видимому, было связано с нарушением функции почек, поскольку это состояние почти всегда наблюдается у пациенток со значительно сниженной функцией почек [33—35]. Магний, по существу, является внутриклеточным катионом, что более важно, чем плазменный магний, он содержится в плотных гранулах тромбоцитов [28], играет важную роль в сохранении функциональных свойств тромбоцитов [36]. В то же время внеклеточный Mg ингибирует агрегацию тромбоцитов дозозависимым образом [37]. Согласно данным литературы, внутриклеточная концентрация магния в тромбоцитах значительно ниже в группе больных с АГ, чем в группе с нормальным АД [27].

Мы не регистрировали изменений магния в лизатах тромбоцитов у беременных с ХАГ. В условиях, описанных нами (в лизатах отмытых тромбоцитов), медиана уровня магния составляла 0,13 ммоль/л в контрольной группе и повышалась в группе женщин с ПЭ до 0,16 ммоль/л. Повышенные уровни магния в лизатах тромбоцитов у беременных с ПЭ сочетаются с повышенными уровнями лактата. Это можно объяснить тем, что лактат мобилизует внутриклеточный магний и действует как активатор высвобождения Mg²⁺ из эндоплазматического ретикулума [38]. Увеличение содержания магния также может быть связано с повышенной циркуляцией больших форм тромбоцитов, которые богаты гранулами и магнием, что подтверждается повышенными показателями MPV тромбоцитов. Ранее нами выявлены повышенные показатели больших форм тромбоцитов, MPV и средней сухой массы тромбоцитов у беременных с ПЭ, которые косвенно указывают на содержание в них гранул [39]. Повышение содержания внутриклеточного магния также может быть связано с его усиленным поступлением или с ингибированием оттока из клетки, а также присутствием в системном кровотоке тромбоцитов, богатых гранулами. Учитывая полученные нами данные, можно предположить, что у беременных с ПЭ циркулируют тромбоциты с повышенной метаболической активностью, что определяет их функциональные свойства при создании протромбогенного статуса на фоне системной дисфункции эндотелия и гиперкоагуляции при такой патологии.

Изучение метаболических особенностей лизатов тромбоцитов при гипертензивных расстройствах у беременных показало, что наиболее выраженные нарушения метаболического статуса тромбоцитов, которые лежат в основе изменения их функции, отмечены при ПЭ. У беременных с ПЭ отмечается увеличение среднего объема тромбоцита, повышение уровней ЛДГ и лактата в циркулирующих в кровеносном русле и тромбоцитах за счет усиления процессов анаэробного гликолиза, уровня внутриклеточного магния в лизатах тромбоцитов в бесплазменной среде, а также повышение уровня креатинкиназы в богатых тромбоцитами лизатах плазмы. Тромбоциты беременных с ПЭ и ПЭ на фоне ХАГ изменяют свой метаболический статус в ответ на патологические изменения, характерные для этой патологии. Метаболический дисбаланс в тромбоцитах может оказывать влияние на рецепторную активность клеток и способствовать развитию нарушений гемостаза, наиболее выраженном у беременных с ПЭ, и может быть связан с изменениями чувствительности тромбоцитов к антиагрегантам.

Таким образом, изучение метаболических особенностей лизатов тромбоцитов при гипертензивных расстройствах у беременных свидетельствует о повышенной метаболической активности тромбоцитов у женщин с ПЭ, расширяет представления о механизмах развития этого осложнения беременности, что будет способствовать созданию новых методов диагностики, дифференциальной диагностики ПЭ и может выявить новые мишени для лекарственнолй терапии при лечении пациенток с протромботическими тенденциями при ПЭ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.Н. Кузьменко, И.А. Панова

Сбор и обработка материала — А.А. Агеев, Г.Н. Кузьменко, М.М. Клычева

Статистическая обработка — Г.Н. Кузьменко, И.А. Панова, А.А. Агеев

Написание текста — Г.Н. Кузьменко, И.А. Панова, С.Б. Назаров

Редактирование — Г.Н. Кузьменко, И.А. Панова, М.М. Клычева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of the authors:

Concept and design of the study — G.N. Kuz’menko, I.A. Panova

Data collection and processing — A.A. Ageev, G.N. Kuz’menko, M.M. Klycheva

Statistical processing of the data — G.N.Kuz’menko, I.A. Panova, A.A. Ageev

Text writing — G.N. Kuz’menko, I.A. Panova, S.B. Nazarov

Editing — G.N. Kuz’menko, I.A. Panova, M.M. Klycheva

Authors declare lack of the conflicts of interests.

¹lysis (греч.) — разложение, растворение, распад; лизат — продукт лизиса.