Введение

Лазерная коагуляция плацентарных анастомозов (ЛКПА) является патогенетическим способом коррекции синдрома фето-фетальной трансфузии (СФФТ) у монохориальных диамниотических двоен (МХДАД) в сроках беременности от 16 до 26 нед [1]. Несмотря на значительное улучшение неонатальных исходов до сих пор остается открытой проблема ранних и поздних осложнений для плодов, перенесших ЛКПА. Преждевременный разрыв плодных оболочек, хориоамнионит, рецидив СФФТ, а также синдром анемии—полицитемии являются наиболее частыми в структуре ранних осложнений хирургической коррекции синдрома [2, 3].

К поздним осложнениям относятся послеоперационные потери плода и высокая частота преждевременных родов. Известно, что роды при беременности двойней с СФФТ и ЛКПА, в среднем, происходят на 2—3 нед раньше, чем при монохориальной диамниотической двойне с неосложненным течением беременности [3—9].

Преждевременное излитие околоплодных вод (ПИОВ) занимает лидирующее место среди осложнений после проведения ЛКПА, на долю которого приходится от 15 до 35% [10—14].

Природа ПИОВ может быть связана непосредственно с проникновением фетоскопа в амниотическую полость и относится к медико-технологическим осложнениям, но также может быть следствием внутриутробного инфицирования плода и экстраэмбриональных структур, нейроэндокринной патологии, аутоиммунных процессов в системе «мать—плацента—плод», истмико-цервикальной недостаточности (ИЦН), различных форм экстрагенитальных заболеваний матери, связанных с урогенитальным трактом, верхними дыхательными путями, особенностями акушерско-гинекологического статуса пациенток с учетом полостных и внутриматочных манипуляций в анамнезе [15—18].

В ходе многоцентровых исследований было доказано, что основным триггером ПИОВ служит наличие инфекционного фактора в сочетании с ИЦН [19, 20]. По мнению А.В. Сергеевой и соавт. [19] и М.А. Кагановой и соавт. [20], основными микроорганизмами урогенитального тракта, способствующими развитию инфекционных осложнений, являются Streptococcus группы B, Escherichia coli, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Bacterioides spp., Ureaplasmaurealyticum. При этом дисбиоз влагалища и бактериальный вагиноз служат не основными, а предрасполагающими факторами для возникновения ПИОВ. Нормализация микрофлоры влагалища при беременности позволяет достоверно снизить частоту ПИОВ во все сроки беременности [18, 21].

Микробиоценоз урогенитального тракта напрямую зависит от состояния локального иммунитета, отвечающего за состав влагалищного микробиома. Представителями локальных факторов неспецифической защиты являются интерфероны (IFN-α, IFN-γ) — медиаторы межклеточных взаимодействий, регулирующие силу и длительность иммунного ответа. Обладая противовирусным, противоопухолевым и иммуномодулирующим свойствами, они оказывают антибактериальное действие как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов посредством повышения фагоцитарной активности, образования иммуноглобулинов, усиления цитотоксичности естественных киллеров [22, 23].

Таким образом, воспалительные заболевания влагалища и шейки матки оказывают неблагоприятное воздействие на течение беременности и развивающийся плод, особенно при внутриутробных фетоскопических вмешательствах.

Цель исследования — изучить состояние вагинальной микробиоты и локального иммунитета влагалища у пациенток с преждевременным излитием околоплодных вод после хирургической коррекции синдрома фето-фетальной трансфузии при монохориальной диамниотической двойне.

Материал и методы

На базе ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и детства» МЗ РФ проведено проспективное когортное исследование с участием пациенток с МХДАД.

В 1-ю группу вошли 60 пациенток с МХДАД, перенесшие ЛКПА с целью коррекции СФФТ II—IV степени по Квинтеро.

Во 2-ю группу включили 30 пациенток с МХДАД с неосложненным течением беременности.

В каждой группе выделена подгруппа с ПИОВ для детального анализа причин данного осложнения.

Для оценки иммунного статуса влагалища были взяты нормы IFN-α и IFN-γ здоровых небеременных женщин, полученные в ходе научного поиска и представленные в работе И.Н. Кононовой «Цервикальные интраэпителиальные неоплазии: прогнозирование, лечение, реабилитация» [24].

Пациентки основной и контрольной групп были сопоставимы по возрасту, сроку беременности, акушерско-гинекологическому анамнезу, характеру экстрагенитальной и гинекологической патологии.

Обследование включало сбор анамнеза, данные ультразвукового исследования, исследование микробиоценоза половых путей и оценки иммунного статуса влагалища. После родоразрешения проведены гистологическое и иммуногистохимическое исследования плацент и плодных оболочек.

Лабораторная диагностика включала бактериологическое исследование отделяемого из цервикального канала, определение микробиоценоза влагалища (Фемофлор 16); иммунный статус влагалища оценивали с помощью определения IFN-ɑ, IFN-γ.

Для определения интерферонов (IFN-α, IFN-γ), которые являются провоспалительными цитокинами, в смывах влагалища использовали метод иммуноферментного анализа на тест-системах Invitrogen с детекцией на универсальном анализаторе Wallac 1420 (VICTORIA2) WallacOy/Perkin Elmer Life Sciencts. Уровни IFN-α, IFN-γ у пациенток 1-й и 2-й групп сравнивали с нормами IFN-α, IFN-γ у здоровых небеременных женщин.

Исследование микробиоценоза влагалища проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с амплификацией и детекцией результатов в режиме реального времени на приборе «ДТлайт». Материалом для исследования служил соскоб эпителиальных клеток с заднебоковой стенки влагалища, который брали одноразовым стерильным урогенитальным зондом. Полученный материал помещали в пробирку 1,5 мл типа «Эппендорф», содержащую транспортную среду (1 мл). При оценке видов микробиоценоза влагалища ключевым критерием служило содержание в нем Lactobacillus spp. Если их доля превышала 80% от всех выявляемых бактерий, то микробиоценоз расценивали как нормоценоз, в противном случае — как дисбиоз. При нормоценозах помимо доли Lactobacillus spp., учитывают абсолютные количества микробов-ассоциантов. В зависимости от количества последних нормоценозы разделяют на абсолютные и условные [25].

Макроскопическое и микроскопическое исследования плацент и плодных оболочек проводили с морфометрическим измерением количества и толщины синцитиокапиллярных мембран при ×400. Определяли ряд патологических изменений ткани последа, характерных для материнской мальперфузии (центральные ишемические инфаркты, децидуальная васкулопатия, гипоплазия дистальных отделов ворсин), плодных стромально-сосудистых поражений (васкулопатия стволовых ворсин, патологическая незрелость ворсин, диссоциированное развитие котиледонов), компенсаторно-приспособительных и иммунопатологических процессов (массивные отложения фибриноида, лимфоплазмоцитарный децидуит). Для иммуногистохимического исследования использовали двухэтапный стрептавидинбиотинпероксидазный метод с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител.

Оценку экспрессии CD68+ и CD163+ проводили с учетом количества клеток, имеющих мембранное окрашивание при оценке не менее 10 полей зрения при × 400.

Обработку полученных данных проводили с использованием параметрических и непараметрических статистических методов в программе Excel 2010 с расчетом среднего значения (М), стандартного отклонения (s), медианы (Me) и интерпроцентильного размаха [10-й перцентиль; 90-й перцентиль], отношения шансов (ОШ), критерия t Стьюдента. Различия при p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

У пациенток 1-й группы (n=60) средний срок родоразрешения составил 30,4± 5,1 нед беременности, у пациенток 2-й группы (n=30) — 33,7± 1,9 нед беременности.

В 1-й группе родоразрешение до 22 нед произошло в 6,6% (4) наблюдений, в 22—28 нед — в 21,6% (13) наблюдений, в 29—32 нед — в 35,2% (21) наблюдений, более 32 нед — в 36,6% (22) наблюдений. Во 2-й группе родоразрешение произошло в сроках беременности 29—32 нед в 6,7% (2) наблюдений и более 32 нед — в 93,3% (28) наблюдений.

В результате исследования установлено, что среди пациенток 1-й группы (n=60) ПИОВ произошло у 35% (21), а во 2-й группе (n=30) — у 3,3% (1) женщин в сроке беременности 33,3±1,2 нед.

Нами проанализированы сроки завершения беременности на момент излития околоплодных вод у пациенток с ПИОВ 1-й и 2-й групп. ПИОВ у пациенток 1-й группы произошло в следующие сроки беременности: до 22 нед — в 19,2% (4) наблюдений, в 22—28 нед — в 42,8% (9) наблюдений, в 29—32 нед — в 38,0% (8) наблюдений, а во 2-й группе отмечен единственный случай ПИОВ (3,3%), который произошел в 33,0 нед беременности (p<0,05).

Для более детального анализа проведена оценка промежутка времени, прошедшего от момента внутриутробной коррекции СФФТ до момента ПИОВ. В течение 7 дней после ЛКПА ПИОВ произошло у 28,5% (6) пациенток, в период от 7 до 28 дней — у 14,4% (3), в период более 28 дней — у 57,1% (12).

Нами был проведен анализ анамнеза и акушерско-гинекологического статуса пациенток 1-й группы с ПИОВ и без ПИОВ, в ходе которого выявлено, что пациентки из подгруппы с ПИОВ значительно чаще страдали хроническими заболеваниями урогенитального тракта — 71,4% (15), инфекционным заболеваниям ЛОР-органов — 52,3% (11), и отличались бóльшим количеством эндоскопических и лапароскопических вмешательств в анамнезе — 23,8% (5; p<0,05).

Число пациенток с ИЦН в подгруппе с ПИОВ — 57,1% (12) — достоверно отличалось от такового в подгруппе без ПИОВ 1-й группы беременных — 35,8% (14; p<0,05).

Для определения причин ПИОВ после ЛКПА с целью коррекции СФФТ были проанализированы данные результатов бактериологических исследований отделяемого цервикального канала с использованием реагентов стандартного набора, локального иммунитета влагалища, иммуногистохимических и гистологических признаков воспалительного процесса в последе и плодных оболочках и клинико-анамнестического статуса пациенток.

При анализе полученных показателей микробиоценоза влагалища пациенток 1-й и 2-й групп была получена достоверная разница в количественном отношении Lactobacillus spp. — 75 и 100% (p<0,05) соответственно.

В 1-й группе пациенток чаще определялись следующие микроорганизмы: Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp. (16,6%), Eubacterium spp. (16,6%), Sneathia spp. (18,3%), Ureaplasma (urealyticum + parvum) (21,6%), грибы рода Candida (6,6%).

Во 2-й группе превалировала следующая микрофлора: Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp. (43,4%), Eubacterium spp. (50,0%), Megasphera/Veilonella/Dialister spp. (30,0%), Mobiluncus/Corynobacterium spp. (46,6%), Ureaplasma (urealyticum + parvum) (26,0%), грибы рода Candida (16,6%).

При оценке количественного соотношения условно-патогенных бактерий влагалища пациенток 1-й и 2-й групп мы получили достоверное преимущество Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp., Eubacterium spp., Megasphera/Veilonella/Dialister spp., Mobiluncus/Corynobacterium spp. (46,6%), Ureaplasma (urealyticum + parvum), грибы рода Candida во 2-й группе.

Дисбиоз влагалища в 1-й группе при ПИОВ зарегистрирован в 66,6% (14) наблюдений, а нормоценоз — в 33,4% (7). У пациенток без ПИОВ в 1-й группе дисбиоз выявлен у 43,6% (7) женщин, нормоценоз — у 56,4% (32). Во 2-й группе при ПИОВ (1) нормоценоз определялся в 100% наблюдений. У пациенток без ПИОВ (29) дисбиоз определялся в 3,4% (1) наблюдений. В нашем наблюдении мы получили достоверные данные о сочетании ПИОВ с дисбиозом влагалища (p<0,05).

При оценке микробного пейзажа подгрупп с ПИОВ и без ПИОВ 1-й группы были получены следующие данные: меньшая концентрация Lactobacillus spp. выявлена в подгруппе с ПИОВ — 66,6% (42) по сравнению с этим показателем в подгруппе без ПИОВ — 79,4% (78), но различия статистически незначимы (p>0,05).

В подгруппе с ПИОВ чаще встречались Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp. (19,0%), Eubacterium spp. (19,0%), Clostridium/Lachnobacterium/Clostridium spp. (14,2%), Ureaplasma (urealyticum + parvum) (14,2%), грибы рода Candida (14,2%). В подгруппе без ПИОВ в большей концентрации диагностированы Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp.) (15,3%), Eubacterium spp. (15,3%), Megasphera/Veilonella/Dialister spp.) (15,3%), Atopobiumvaginae (10,2%), Ureaplasma (urealyticum + parvum) (25,6%).

Таким образом, преждевременное излитие околоплодных вод в подгруппе ПИОВ 1-й группы было обусловлено преобладанием анаэробных бактерий.

В подгруппах с ПИОВ и без ПИОВ 2-й группы различия по количеству Lactobacillus spp. не выявлено. Большее количество представителей условно-патогенной микрофлоры определялось в подгруппе без ПИОВ: Gardnerella/Prevotella/Porpheromonas spp. (44,8%), Eubacterium spp. (51,7%), Megasphera/Veilonella/Dialister spp. (31,0%), Ureaplasma (urealyticum + parvum (27,5%). Данные микробиоценоза влагалища в подгруппе с ПИОВ 2-й группы нельзя расценивать как достоверные ввиду единичного наблюдения ПИОВ (n=1) 2-й группы.

В ходе обследования пациенток 1-й группы в бактериальных посевах отделяемого из цервикального канала выявлены следующие группы микроорганизмов: Enterococcusfaecalis (3,3%), Streptococcusagalactiae (1,6%), Escherichiacoli (1,6%). В бактериальных посевах пациенток 2-й группы данные микроорганизмы были представлены следующим образом: Enterococcus faecalis (10,0%), Staphylococcus haemophilus (6,6%), Staphylococcus epidermidis (10,0%), Streptococcus agalactiae (3,3%), Escherichia coli (3,3%). При анализе данных бактериальных посевов в 1-й и 2-й группах не выявлено статистически значимых различий по концентрации условно-патогенных микроорганизмов (p>0,05). В подгруппе с ПИОВ 1-й группы в посеве чаще выявлялся Enterococcus faecalis (4,7%), у пациентки с ПИОВ 2-й группы результаты посева были представлены Lactobacillus spp. В подгруппах с ПИОВ и без ПИОВ 1-й и 2-й групп не получено статистически значимых различий по концентрации условно-патогенных бактерий (p<0,05).

При анализе местного иммунитета у пациенток 1-й и 2-й групп выявлены следующие закономерности: содержание IFN-γ (3,2±5,2 нг/мл) у пациенток с МХДАД при неосложненном течении беременности и у пациенток с МХДАД, перенесших ЛКПА при СФФТ (2,8±5,5 нг/мл) — было статистически значимо ниже, чем в группе здоровых небеременных женщин — 18,8±2,2 нг/мл (p<0,05). Содержание IFN-α у пациенток 1-й группы (16,7±8,8 нг/мл) и 2-й группы (19,7±15,4 нг/мл) не отличалось от такового здоровых небеременных женщин — 14,6±1,8 нг/мл (p<0,05) [25]. Таким образом, мы подтвердили, что снижение иммунитета характерно для состояния беременности и является физиологическим процессом, направленным на создание и обеспечение необходимых условий для нормального развития плода.

В ходе нашего исследования статистически значимых различий по уровню IFN-γ, IFN-α у пациенток 1-й группы (IFN-γ 2,8±5,5 нг/мл; IFN-α 16,7±8,8) нг/мл) и 2-й группы (IFN-γ 3,2±5,2 нг/мл; IFN-α 19,7±15,4 нг/мл) не выявлено (p<0,05). Однако выявлено достоверное снижение уровня IFN-γ — 1,2±0,1 нг/мл и повышение уровня IFN-α — 20,5±9,0 нг/мл в подгруппе с ПИОВ 1-й группы пациенток.

В процессе изучения гистологических изменений в последах пациенток 1-й и 2-й групп выявлено, что гистологическая картина с признаками острого хориоамнионита, который определяется как материнская нейтрофильная реакция на бактериальную инфекцию с сопутствующим ответом со стороны плода или без ответа, диагностировалась только в 1-й группе — n=16 (13,3%). Хронический хориоамнионит, который служит признаком реакции материнского организма на компоненты плода и физиологической нормой, встречался в 52 (86,7%) наблюдениях (p<0,05).

При иммуногистохимическом анализе последов выявлен высокий уровень экспрессии CD163 — Me 198 [293; 69] и CD68 — Me 117 [156; 42] у пациенток 1-й группы по сравнению с пациентками 2-й группы: CD163 — Me 163 [203; 65] и CD68 — Me 71 [99; 37] (p<0,05); а также высокий уровень экспрессии CD163 — Me 139 [222; 21] и CD68 — Me 80 [138; 10] у пациенток 1-й группы по сравнению с этими показателями у пациенток 2-й группы — CD163 — Me 114 [142; 18] и CD 68 — Me 30 [68; 5] (p<0,05), что свидетельствует о наличии острого или хронического воспалительного процесса в тканях плаценты и плодных оболочек и наглядно иллюстрирует причины ПИОВ у беременных 1-й группы, обусловленные влиянием условно-патогенных анаэробных бактерий на экстраэмбриональные структуры.

Обсуждение

При неуклонном росте числа монохориальных многоплодных беременностей в популяции, связанном в том числе с применением программ вспомогательных репродуктивных технологий, увеличивается количество их осложнений, в частности СФФТ. Коррекция синдрома трансфузии и дальнейшее наблюдение пациенток до срока родоразрешения остается актуальной проблемой. В нашем исследовании был проведен анализ причин ПИОВ у пациенток (n=21) после ЛКПА.

По полученным данным, одной из причин, повышающих риск ПИОВ после ЛКПА, являются хронические заболевания урогенитального тракта, ЛОР-органов и наличие в анамнезе эндоскопических и полостных операций, сформировавшиеся на фоне беременности ИЦН. Результаты нашего исследования согласуются с данными литературы, посвященными изучению одноплодных беременностей и представленными в работах Ю.А. Шадеевой и соавт. [26].

C. Paules и соавт. [27] и K. Oh и соавт. [28] в своих работах указывают на корреляции между наличием инфекционного фактора во влагалище и/или цервикальном канале и развитием хориоамнионита, ИЦН, разрывами плодных оболочек и преждевременными родами при одноплодных беременностях [27, 28]. В нашем исследовании у пациенток при монохориальном многоплодии с ПИОВ после ЛКПА достоверно чаще встречались признаки ИЦН по сравнению с группой, в которой не было ПИОВ в сроках беременности 26,2±4,2 нед (p<0,05). Причиной укорочения цервикального канала у пациенток с ПИОВ могло быть не только выраженное многоводие плода-реципиента, но и угнетение местного иммунитета на фоне дисбиоза влагалища.

Снижение количества Lactobacillus spp. у пациенток с ПИОВ при монохориальном многоплодии сопоставимо с данными P. Bennett и соавт. [29], в которых авторы указывают на низкие уровни Lactobacillus spp. и высокие концентрации условно-патогенной и патогенной микрофлоры во влагалищном содержимом при одноплодных беременностях с ПИОВ и преждевременными родами [29]. В нашем исследовании меньшая концентрация Lactobacillus spp. выявилась в подгруппе с ПИОВ (66,6%, n=21) по сравнению с подгруппой без ПИОВ (79,4%, 5=39), но статистически значимых различий не получено (p>0,05).

В результате поиска литературы нами не найдено нормативов и критериев по оценке местного иммунитета влагалища у беременных. Обзоры литературы дают ссылки на референсные показатели IFN-γ, IFN-α в крови, используемые для оценки общего иммунного статуса пациенток.

По данным единичных наблюдений, в более 70% случаев ПИОВ инициаторами воспалительного процесса в условиях измененного иммунного ответа, обусловленного беременностью, служат представители условно-патогенной микрофлоры [30]. Это подтверждает наше исследование: дисбиоз влагалища в сочетании со снижением концентрации IFN-γ и повышением концентрации IFN-α, способствует увеличению риска возникновения ПИОВ после ЛКПА. Данное исследование проводилось впервые у пациенток с МХДАД после ЛКПА и по праву может считаться уникальным.

В работах Н.В. Низяевой [31] при ПИОВ выявлена взаимосвязь воспалительных изменений плаценты с наличием инфекционного агента. Однако выявление возбудителя (методом ПЦР) происходит менее чем в 50% случаев [31].

По нашему мнению, состояние дисбиоза не влечет за собой ПИОВ при МХДАД, но, вероятно, проведение инвазивной внутриутробной операции провоцирует воспалительную реакцию в плодных оболочках на фоне преобладания анаэробной микрофлоры. D. Zhao и соавт. [32] отмечают, что непосредственно СФФТ может быть фактором развития неспецифического внутриутробного воспаления, а его коррекция усугубляет данную ситуацию. Этому способствует большой диаметр фетоскопа — 3—4 мм, который обусловливает большую площадь травматизации плодных оболочек, а также использование лазеров с большей мощностью вызывает ятрогенный некроз плаценты и активирует факторы «материнского антифетального отторжения» [32].

Считаем, что дальнейшее изучение факторов, влияющих на вынашивание беременности двойней после ЛКПА, является интересным и перспективным направлением.

Заключение

При анализе показателей микробиоценоза влагалища у пациенток 1-й и 2-й групп выявлено меньшее число пациенток с нормоценозом в подгруппе с ПИОВ 1-й группы (p<0,05).

В ходе исследования установлено, что в подгруппе с ПИОВ 1-й группы преобладали пациентки с анаэробным дисбиозом — 66,6% (14; p<0,05).

Укорочение цервикального канала обусловлено не только выраженным многоводием у плода-реципиента при СФФТ, но и угнетением местного иммунитета на фоне дисбиоза влагалища.

По нашим данным, преждевременному излитию околоплодных вод способствует отягощенный гинекологический и соматический анамнез матери (очаги хронической инфекции матери и оперативные вмешательства в анамнезе).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В. Косовцова, Я.Ю. Поспелова, Т.В. Маркова, М.В. Павличенко, А.А. Гришкина

Сбор и обработка материала — Н.В. Косовцова, Я.Ю. Поспелова, Т.В. Маркова, М.В. Павличенко, А.А. Гришкина

Статистическая обработка — Я.Ю. Поспелова, Н.В. Косовцова, Т.В. Маркова

Написание текста — Н.В. Косовцова, Я.Ю. Поспелова, Т.В. Маркова, М.В. Павличенко, А.А. Гришкина

Редактирование — Н.В. Косовцова, Т.В. Маркова, М.В. Павличенко, Я.Ю. Поспелова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — N.V. Kosovtsova, Ya.Yu. Pospelova, T.V. Markova, M.V. Pavlichenko, A.A. Grishkina

Data collection and processing — N.V. Kosovtsova, Ya.Yu. Pospelova, T.V. Markova, M.V. Pavlichenko, A.A. Grishkina

Statistical processing of the data — Ya.Yu. Pospelova, N.V. Kosovtsova, T.V. Markova

Text writing — N.V. Kosovtsova, Ya.Yu. Pospelova, T.V. Markova, M.V. Pavlichenko, A.A. Grishkina

Editing — N.V. Kosovtsova, T.V. Markova, M.V. Pavlichenko, Ya.Yu. Pospelova

Authors declare lack of the conflicts of interests.