Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Демкин В.В.

ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»;
ООО «НаноДиагностика»

Пустотина О.А.

ЧОУ ДПО «Академия медицинского образования им. Ф.И. Иноземцева»

Казаков А.А.

ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»;
ООО «НаноДиагностика»

Вершинина Е.А.

ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Терехов М.А.

ЧОУ ДПО «Академия медицинского образования им. Ф.И. Иноземцева»

Одинаева Ф.М.

ГБУЗ г. Москвы «Московский многопрофильный клинический центр «Коммунарка»»Москва, Росси

Гуськова О.Ш.

ГБУЗ МО «Одинцовская областная больница»

Караева Д.Р.

ГБУЗ г. Москвы «Городская клиническая больница №67 им. Л.А. Ворохобова»

Лактобактерии и бактериальный вагиноз. Типирование видов и анализ уровней содержания в микробиоме

Авторы:

Демкин В.В., Пустотина О.А., Казаков А.А., Вершинина Е.А., Терехов М.А., Одинаева Ф.М., Гуськова О.Ш., Караева Д.Р.

Подробнее об авторах

Прочитано: 200 раз


Как цитировать:

Демкин В.В., Пустотина О.А., Казаков А.А., и др. Лактобактерии и бактериальный вагиноз. Типирование видов и анализ уровней содержания в микробиоме. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2025;43(2):43‑50.
Demkin VV, Pustotina OA, Kazakov AA, et al. Lactobacilli and bacterial vaginosis. Species typing and analysis of content levels in the microbiome. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2025;43(2):43‑50. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/molgen20254302143

Рекомендуем статьи по данной теме:
Ви­до­вое раз­но­об­ра­зие лак­тоф­ло­ры в ва­ги­наль­ном мик­ро­би­оме рос­сий­ских жен­щин. Мо­ле­ку­ляр­ная ге­не­ти­ка, мик­ро­би­оло­гия и ви­ру­со­ло­гия. 2024;(2):25-31
Ком­плексный под­ход к об­сле­до­ва­нию эн­до­мет­рия при пов­тор­ных не­уда­чах в цик­лах вспо­мо­га­тель­ных реп­ро­дук­тив­ных тех­но­ло­гий: пи­лот­ное ис­сле­до­ва­ние. Проб­ле­мы реп­ро­дук­ции. 2024;(4):51-58
Бак­те­ри­аль­ный ва­ги­ноз: сов­ре­мен­ные пред­став­ле­ния. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2025;(3):261-268

Введение

Бактериальный вагиноз (БВ) — одно из самых распространенных заболеваний среди женщин репродуктивного возраста, представляющее собой полимикробный синдром, возникающий в результате нарушения баланса микрофлоры влагалища. Это заболевание представляет серьезную угрозу для здоровья женщин репродуктивного возраста, их детей и партнеров, поскольку БВ является причиной неблагоприятных последствий для репродуктивного здоровья, таких как воспалительные заболевания органов малого таза, выкидыши, преждевременные роды, развитие инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) [1—3]. Вагинальная микробиота представляет собой сложную экосистему, состоящую из различных микроорганизмов, включая бактерии, грибы и вирусы, которые колонизируют влагалище женщины. Ключевую роль в поддержании стабильности и здоровья вагинального микробиоценоза играют лактобактерии, которые используют различные механизмы, обеспечивающие колонизационную устойчивость микробиоценоза влагалища, тем самым снижая риск развития ИППП и БВ [1—4]. Клинические проявления БВ включают обильные серовато-белые выделения, часто сопровождающиеся неприятным «рыбным» запахом. Однако важно отметить, что БВ может протекать бессимптомно и выявляется только при лабораторном обследовании. Частота бессимптомного БВ может достигать 50% случаев в зависимости от исследуемой выборки, и зависит от этнической принадлежности, социально-экономического статуса, сексуальной активности женщин и других факторов [5—8]. Бессимптомный БВ нередко рассматривается как пограничное состояние, которое в дальнейшем способно привести к самостоятельному восстановлению нормоценоза или вызвать заболевание. Причины изменений в микробиоте влагалища, приводящие к БВ, остаются предметом обсуждения. Исторически БВ диагностировали с помощью шкалы Нюджента и/или клинических критериев Амселя [9, 10]. Шкала Нюджента основана на оценке мазка по Граму, где учитывается наличие различных морфотипов бактерий по шкале от 0 до 10. Балл ≥7 указывает на положительный диагноз. Критерии Амселя основываются на клинических симптомах: наличие трех из четырех симптомов («рыбный» запах, обильные серо-белые выделения, pH выше 4,5 и наличие ключевых клеток в вагинальном мазке) также подтверждает диагноз. Однако эти методы сложно стандартизировать, и они подвержены межсубъектной вариативности, поскольку оценка диагностических критериев зависит от навыков и опыта врача. Молекулярно-генетические методы, в частности ПЦР, представляют собой современный подход к диагностике бактериального вагиноза. Метод ПЦР позволяет выявлять и количественно определять генетический материал различных микроорганизмов, важных для вагинального биоценоза. Данный метод обеспечивает высокую точность и скорость диагностики, позволяя более эффективно влиять на состояние здоровья женщин. Молекулярные методы позволяют не только выявлять наличие бактерий, но и определять их количественное соотношение. Это важно для диагностики БВ, так как заболевание связано с дисбалансом между лактобактериями и другими видами бактерий, колонизирующими вагинальную экологическую нишу. На основании данных высокопроизводительного секвенирования вагинального микробиома было описано 5 основных групп бактериальных экосистем, обозначенных как I, II, III, IV и V, 4 из которых (I, II, III и V) характеризуются доминированием одного из видов лактобактерий, а один (IV) — доминированием бактерий, относящихся к другим родам, прежде всего к анаэробам [11, 12]. В настоящее время считают, что видовой спектр вагинальных лактобактерий преимущественно представлен четырьмя видами: Lactobacillus crispatus, L. jensenii, L. gasseri и L. iners, доминирование одного из них и определяет принадлежность к одной из вагинальных экосистем, упомянутых выше.

Лактобактерии считаются одним из наиболее значимых индикаторов развития БВ, поскольку на микробиологическом уровне это состояние описывают как резкое снижение или даже отсутствие лактобактерий при соответствующем многократном увеличении количества факультативно- или облигатно-анаэробных микробов, таких, как Gardnerella, Prevotella, Atopobium, Mobiluncus, Bifidobacterium, Sneathia, Leptotrichia и др. [3, 6, 7, 13]. Ранее мы использовали метод количественной ПЦР для изучения распространения и количественного состава различных видов вагинальных лактобактерий у женщин России с различными физиологическими и дисбиотическими состояниями микробиоценоза влагалища без акцента на ту или иную патологию или нормоценоз [14].

Целью исследования явилось изучение особенностей изменения лактобактериального компонента вагинального микробиоценоза при БВ и определение частоты встречаемости отдельных видов лактобацилл.

Материал и методы

Проспективное рандомизированное исследование проводили на базе 4 женских консультаций г. Москвы в период с 15.03.2023 по 28.09.2024 в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации и другими законодательными и нормативными документами РФ. В основную группу вошло 40 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет с жалобами на патологические выделения из половых путей и установленным диагнозом БВ (далее группа БВ). Диагноз БВ устанавливали на основании критериев Амселя при наличии трех из четырех перечисленных признаков: гомогенного жидкого выделения из половых путей бело-серого цвета; аминного или «рыбного» запаха выделений; pH влагалища ³4,5; обнаружения «ключевых клеток» при микроскопии нативного или окрашенного по Граму вагинального мазка. Контрольную группу составили 22 условно здоровые пациентки с отсутствием жалоб на выделения из половых путей (далее группа УЗ). Все пациентки были обследованы на наличие возбудителей ИППП: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis. Наличие любого из перечисленных возбудителей являлось основанием для исключения пациентки из исследования. Другими критериями невключения были: онкологические заболевания за последние 3 года, острые воспалительные заболевания органов малого таза, урогенитальные расстройства, связанные с менопаузой, ВИЧ-инфекция в анамнезе, любые операции за последние 3 мес, психиатрические заболевания в анамнезе, тяжелые соматические/ гинекологические заболевания или любые факторы, которые, по мнению врача, могут препятствовать включению пациента в исследование, гиперчувствительность к любому компоненту используемых препаратов; прием системных или местных антимикробных препаратов, глюкокортикоидов и иммуномодуляторов в течение 1 мес до включения в исследование. Перед включением в исследование все пациентки подписали информированное добровольное согласие.

Вагинальные мазки брали в транспортную среду «Прямая ПЦР» для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Россия), обеспечивающую сохранность ДНК в течение, по крайней мере, 30 дней при +4 ◦C. В большинстве случаев ДНК из проб с вагинальными мазками выделяли в пределах 7 дней после забора.

ДНК из клинического материала выделяли в соответствии со следующим протоколом: к объему биоматериала в транспортной среде добавляли равный объем лизирующего буфера «Прямая ПЦР» для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Россия). К смеси добавляли 1 единицу протеиназы K, перемешивали на вортексе и термостатировали при 55 ◦C 15 мин и затем при 95 ◦C еще 15 мин. После инкубации пробу перемешивали на вортексе, центрифугировали 2 мин при 12500 об/мин, и аликвоты по 5 мкл использовали в реакции ПЦР.

Определение общего содержания бактерий (общая бактериальная масса, ОБМ) и общего содержания лактобактерий проводили методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием мультиплексной тест-системы «Лактоиндекс В rplK» для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Россия). Относительное содержание лактобактерий оценивали с помощью лактобактериального индекса (ЛИ), который отражал отношение общего количества лактобактерий к ОБМ. ЛИ в процентах рассчитывали по формуле:

ЛИ=100*2^(K-(Cq2-Cq1)),

при условии, что Cq2-Cq1>K, где Cq1 и Cq2 — пороговые значения для лактобактериальной и панбактериальной линий флуоресценции соответственно; К=2,5 — эмпирически определенный коэффициент, учитывающий поправку на разницу копий генов rplK и 16S рРНК и различий в эффективности амплификации этих генов.

Детекцию и дифференциацию отдельных видов лактобактерий проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием мультиплексной тест-системы для научного применения «Лактоспектр 4_rplK» (ООО «Нанодиагностика», Россия). Тест-система «Лактоспектр 4_rplK» позволяет определять в одной реакции 5 видов лактобактерий (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri/ L. johnsonii — два последних вида без дифференциации), потенциально способных колонизировать вагинальный микробиоценоз.

ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием амплификатора BioRad CFX 96. Программа амплификации: 95 ◦C в течение 5 мин, затем 40 циклов по 15 с при 95 ◦C, 25 с при 60 ◦C, 10 с при 72 ◦C. Каждую пробу исследовали как минимум в двух независимых постановках.

Статистическую обработку проводили с использованием ресурсов Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Лактобактериальный индекс

У всех женщин с БВ были обнаружены лактобактерии, однако их количество варьировало в диапазоне четырех порядков: от 0,01 до 100% по отношению к ОБМ. Распределение проб с разными показателями ЛИ сформировало гистограмму с тремя максимумами, что позволяет разделить пациенток с БВ на 3 подгруппы (рисунок, а). Первую подгруппу, доля которых составляла до трети от общего количества проб (32,5%), составили женщины с низким уровнем ЛИ (<20), с пиком ЛИ менее 10%. При этом значения ЛИ в категории <20 варьировали от 0,01 до 10,6% с ЛИсредн=2,0% (табл. 1). Вторую подгруппу составили женщины с промежуточными значениями ЛИ (от 30 до 80%), доля которых в общей выборке была 50%, а распределение показателей ЛИ формировало достаточно пологий пик в средней части гистограммы (см. рисунок, а). Третий пик располагался на другом конце гистограммы и соответствовал подгруппе женщин с показателем ЛИ, близким к 100%; доля в выборке 15% (см. табл. 1). Такое распределение в целом согласуется с делением степени вагинального микробиоценоза на такие категории, как выраженный дисбиоз, умеренный дисбиоз, условный нормоценоз и нормоценоз [15, 16], или дисбиоз, мезоценоз (промежуточный микробиоценоз), физиологический микробиоценоз [17]. Однако для применения подобных классификаций требуется унификация терминологии и разработка четких диагностических критериев для каждой из категорий. Важно отметить, что значение ЛИ=100 не означает отсутствие других бактерий, а указывает на то, что их количество по сравнению с лактобактериями не превышает 1%. Следует также учитывать погрешности, связанные с невозможностью точного расчета ЛИ из-за различного количества копий гена 16S рРНК у разных бактерий (включая вагинальные лактобактерии), используемых для оценки ОБМ. Так, оценка количества лактобактерий проводится по однокопийному гену rplK [18], а оценка ОБМ проводится по гену 16S рРНК, число копий которого только у вагинальных лактобактерий может варьировать от 4 до 6.

Распределение значений ЛИ в группах БВ и УЗ.

Таблица 1. Показатели превалирования лактобактерий у пациенток с БВ и УЗ

Группа

Группа по ЛИ

ЛИсредн±σ размах n доля %

Число видов ЛБ в пробе

Доля в группе по ЛИ, %

ЛИ

ЛИсредн±σ размах n

БВ

<20

2,0±3,4

0,01 —10,6

n=13

32,5%

1

76,9

2,7±3,4

0,02—14,1

n=10

2

23,1

6,8±5,9

0,03—19,2

n=3

>80

93,1±7,9

84—100

n=6

15%

1

65,0

94,9±7,2

83,8—100

n=5

2

0

n=0

3

7,5

84

84

n=1

УЗ

<20

7,0±8,4

0,7—16,5

n=3

13,6%

1

100

7,0±8,4;

0,7 — 16,5

n=3

>80

99,5±1,9

93—100

n=13

59,1%

1

29,4

98,3±3,3

93,3—100

n=4

2

64,7

100±0

100—100

n=8

3

5,9

100

100

n=1

Примечание. σ — среднеквадратичное отклонение. В таблице приведены данные только по подгруппам с наиболее низкими (<20%) и наиболее высокими (>80%) показателями ЛИ.

В контрольной группе женщин (УЗ) в вариационном ряду ЛИ наблюдался только один ярко выраженный пик в зоне, близкой к ЛИ=100%, доля которых составляла 59,1% (см. рисунок, б). Показатели ЛИ в пробах с низкими значениями находились в диапазоне от 0,7 до 16,5%, что было значительно выше аналогичных значений в группе БВ с ЛИ<20. Наличие пациенток с пониженным ЛИ в группе УЗ может быть обусловлено тем, что отбор в эту группу проводили на основе отсутствия выделений и других клинических признаков БВ. Следовательно, не исключено, что в группу УЗ могли попасть лица с бессимптомным течением БВ или с микробиотой влагалища без доминирования лактобактерий [11, 12].

Неожиданным результатом стало обнаружение заметной доли женщин с БВ с высоким уровнем ЛИ, что по этому признаку должно рассматриваться как нормоценоз. Считается, что снижение доли лактобактерий является одним из основных микробиологических признаков БВ [1—4, 7, 13]. В нашем исследовании мы наблюдаем, что при наличии выделений и других характерных признаков БВ по критериям Amsel показатель ЛИ (т.е. уровень содержания лактобактерий) у 15% женщин остается в пределах нормы, а у 50% женщин этот показатель превышает 50%. Это позволяет предположить, что существуют. как минимум две формы БВ: одна из которых характеризуется резким снижением количества лактобактерий и их вытеснением другой флорой; другая форма сохраняет доминирование лактобактерий, что не препятствует развитию клинической картины БВ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о значительной вариабельности количественного состава лактобактерий у женщин с БВ, что подчеркивает сложность и изменчивость реакции вагинальной микробиоты на развитие этого состояния.

Видовое разнообразие лактобактерий

Для определения видов лактобактерий была использована мультиплексная тест-система, которая позволяла идентифицировать пять видов вагинальных лактобактерий: L. iners, L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri/L. johnsonii. Выбор этих видов в качестве диагностических мишеней основывался на результатах масштабного исследования, проведенного ранее среди российской популяции женщин [14]. В этом исследовании было протестировано более 800 вагинальных мазков от женщин, обращавшихся в гинекологические учреждения нескольких городов России как с различными жалобами, так и без них. Результаты показали, что только четыре вида лактобактерий — L. iners, L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri — представляли видовое разнообразие вагинальных лактобактерий у 95% женщин.

Тестирование вагинальных мазков в настоящем исследовании показало, что в обеих группах — при БВ и у женщин без жалоб на выделения (УЗ) — были идентифицированы все четыре вида лактобактерий: L. iners, L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri/L. johnsonii (табл. 2). При интерпретации результатов тестирования L. gasseri/L. johnsonii, которые данная тест-система определяет как единый маркер, положительные результаты были интерпретированы в пользу L. gasseri на основании данных предыдущего исследования, в котором все такие пробы были идентифицированы как L. gasseri с помощью другой системы типирования — «Лактоспектр_tuf» [14].

Таблица 2. Частота выявления отдельных видов лактобактерий в группах БВ и УЗ

Вид ЛБ

Всего, n (%)

Доминирующий + дополнительный вид среди ЛБ, n

Единственный вид ЛБ,

n

БВ

УЗ

БВ

УЗ

БВ

УЗ

L. crispatus

18 (45)

11 (50)

13+5

10+1

9

4

L. iners

25 (62,5)

8 (36,4)

21+4

5+3

15

2

L. jensenii

8 (20)

6 (27,3)

4+4

3+3

2

0

L. gasseri/L. johnsonii

6 (15)

10 (45,5)

1+5

4+6

1

4

Не было проб, в которых не был бы выявлен хотя бы один из этих видов. Наиболее часто встречались L. crispatus и L. iners как при БВ, так и в группе УЗ: образцы хотя бы с одним из этих двух видов составили 92,5% при БВ и 77,3% в группе УЗ. При этом L. crispatus и L. jensenii выявлялись с примерно равной частотой в обеих группах, тогда как L. iners обнаруживали приблизительно в 1,5 раза чаще при БВ, а L. gasseri/L. johnsonii более чем в 3 раза чаще в группе УЗ (см. табл. 2).

В большинстве случаев при БВ у одной и той же женщины наблюдали наличие одного вида лактобактерий (65—77%), реже — двух видов (23—27,5%), независимо от общего количества лактобактерий (см. табл. 1). В группе УЗ с высоким содержанием лактобактерий была отмечена обратная тенденция: было меньше образцов с одним видом (29%), и чаще выявляли два вида лактобактерий (65%). Одновременно три вида лактобактерий в невысокой пропорции обнаруживали только при высоком показателе ЛИ (>80) в обеих группах — как у женщин с БВ, так и у женщин с нормальной микрофлорой (см. табл. 1). Возможно, что при низком содержании лактобактерий концентрация дополнительных видов была ниже предела определения. При одновременном определении двух видов лактобактерий их соотношение могло варьировать в широких пределах: например, 87 и 13% или 63 и 37% при БВ; или 99 и 1% или 57 и 43% в группе УЗ. При наличии трех видов их содержание могло быть близким (например, 43 и 37 и 21%) или с явным доминированием одного из видов (например, 73 и 23 и 4%) (см. табл. 2).

Кроме того, мы проанализировали распределение видов лактобактерий в группах с разными индексами лактобактерий: при крайне низком их количестве (ЛИ<10), при максимально высоком (ЛИ>90) и промежуточном (50<ЛИ<70). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Частота выявления разных видов лактобактерий в пробах с разными ЛИ

Вид ЛБ

ЛИ<10

50<ЛИ<70

ЛИ>90

n

%

n

%

n

%

Всего образцов

13

2-

11

4

L. crispatus

3

23,1

7

63,6

3

75,0

L. iners

11

84,6

5

45,5

1

25,0

L. jensenii

1

7,7

3

27,3

0

0,0

L. gasseri/L. johnsonii

1

7,7

2

18,2

0

0,0

Анализируя данные табл. 3, можно отметить, что распределение частот встречаемости отдельных видов лактобактерий демонстрирует те же закономерности, что и на популяционном уровне без связи с БВ [14]. Так, основными доминирующими видами являются L. crispatus и L. iners, однако не исключается доминирование других видов, таких как L. jensenii и L. gasseri/L. johnsonii. При низких концентрациях чаще преобладает L. iners, тогда как с увеличением концентрации лактобактерий начинает доминировать L. crispatus. Также следует отметить увеличенные частоты выявления L. jensenii и L. gasseri/L. johnsonii при переходных концентрациях и их исчезновение из вагинального ландшафта при высоких концентрациях лактобактерий.

Эти данные согласуются с данными других авторов, которые подчеркивают особую роль L. crispatus и L. iners как ключевых видов в составе биоценоза влагалища [1—4, 7, 13], а также указывают на взаимосвязь их доминирования с концентрацией лактобактерий и, вероятно, с другими компонентами микробиоты.

Заключение

При общей тенденции к снижению уровня ЛИ при БВ пациентки могут быть разделены на три подгруппы. Первая подгруппа включает женщин с высоким показателем ЛИ (80—100%), вторая — с умеренно сниженным уровнем (20—80%), и третья — с низким показателем ЛИ (менее 20%), в которой можно дополнительно выделить значительное количество проб с очень низкими значениями ЛИ (менее 1%). Такое распределение позволяет предположить о наличии, по крайней мере, двух форм БВ: одна из форм, общепризнанная, характеризуется снижением представительства лактобактерий с замещением их другими бактериями; другая — сохраняет доминирование лактобактерий при наличии клинических проявлений БВ.

Полученные данные согласуются с отмеченной ранее в литературе корреляционной зависимостью между преобладанием определенных видов лактобактерий и степенью дисбиоза. Положительная корреляция наблюдается для L. iners, в то время как для L. crispatus установлена отрицательная корреляция. Эта зависимость, на наш взгляд, не отражает прямые причинно-следственные связи в отношении БВ, поскольку корреляции наблюдаются не столько с клиническими проявлениями заболевания, сколько с концентрацией лактобактерий. В некоторых случаях клиническая картина БВ может развиваться даже при сохранении доминирования лактобактерий.

Благодарности. При выполнении работы частично использовалось оборудование Ресурсного центра клеточных и генных технологий НИЦ «Курчатовский институт».

Финансирование. Исследование проведено при поддержке научно-образовательного проекта «Экспертология». Авторы сообщают об отсутствии иного финансирования при разработке и проведении исследования — сборе, анализе и интерпретации данных; а также в подготовке, рассмотрении или утверждении рукописи.

Соблюдение этических стандартов. Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическими стандартами институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.