Введение
В настоящее время осложнения беременности, обусловливающие высокую пре- и постнатальную заболеваемость и смертность, выделены и объединены в группу больших акушерских синдромов (great obstetrical syndromes): преждевременные роды (ПР), привычное невынашивание беременности, преэклампсия (ПЭ), задержка роста плода (ЗРП), преждевременный разрыв плодных оболочек (ПРПО) [1—4]. Объединить их в одну группу позволяет относительная общность ряда патогенетических звеньев. К основным этиологическим факторам больших акушерских синдромов относятся дефектная плацентация в связи с различной степенью нарушения ремоделирования спиральных артерий, оксидантный, эндотелиальный, нитрозативный стресс, иммунологическая дизреактивность, гормональный дисбаланс, генетические и эпигенетические факторы. Однако в каждом случае вариант осложнения беременности имеет собственную клиническую картину, определенные молекулярные субстраты патологических воздействий и особенностей ответа биологической системы мать—плацента—плод на эти воздействия.
Среди регуляторов, выполняющих сигнальные функции в меж- и внутриклеточной коммуникации, важная роль принадлежит транскрипционным факторам, связанным с фундаментальными клеточными процессами, особенно интенсивно протекающими в период гестации (апоптоз, ангиогенез, дифференциация и пролиферация). К их числу относится ядерный фактор каппа B (NF-κB — nuclear factor κB). Он модулирует экспрессию более 150 генов, вовлеченных в указанные реакции [5, 6]. Под влиянием NF-κB меняется продукция цитокинов, индуцибельных ферментов, молекул клеточной адгезии [7, 8]. Указанный транскрипционный фактор представляет собой гетеродимерный комплекс белков, причем наиболее часто встречается комбинация субъединиц p50 и p65, именно последняя ответственна за проявление специфической активности NF-κB.
Активность NF-κB модифицируется в ответ на ряд эндогенных факторов. В их числе рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом (peroxysome proliferations activating receptors, PPAR), также являющиеся транскрипционными факторами [9, 10]. В свою очередь PPAR, имеющие представительство во многих тканях и органах [11, 12], влияют на процессы воспаления, роста, дифференцировки клеток, апоптоза, ангиогенеза, на все виды метаболизма, энергетический гомеостаз, иммунную коррекцию, ремоделирование сосудов эндотелия. Кроме того, они регулируют редокс-реакции, соотношение про- и антиоксидантов [13].
Роль указанных транскрипционных факторов особенно велика в плаценте, лишенной иннервации [14, 15]. Влияние этих факторов во время гестации во многом может осуществляться на уровне структуры и свойств ядерных белков, постгеномные (посттрансляционные) изменения которых по принципу обратной связи отражаются на функционировании самих ядерных факторов. В числе посттрансляционных модификаций белков большое значение имеют их циклозависимое фосфорилирование и окислительное карбонилирование с достаточно широким спектром регулируемых ими клеточных функций. С участием этих ферментов контролируются многие важные процессы, в том числе пролиферация, рецепция, внутриклеточный транспорт, каналообразование, пластические и трофические функции белков. Субстратами указанных ферментов являются многочисленные протеины, к числу которых, прежде всего, относятся белки хроматина.
С учетом изложенного в данной работе изучены содержание транскрипционных факторов роста NF-κB и PPAR в плаценте и околоплодных водах, а также интенсивность посттрансляционных изменений плацентарных ядерных белков при различных осложнениях беременности с целью уточнения общих (с позиции единого генеза) и специфических молекулярных механизмов для определенной акушерской патологии.
Материал и методы
В проспективное исследование включены 93 беременные в возрасте 24—30 лет. Из исследования исключали женщин с инфекционными заболеваниями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, аутоиммунной патологией и не давших информированного согласия на расширенный протокол исследования. Из числа обследованных в контрольную группу вошли 19 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родами в срок (39—40 нед). Основная группа состояла их 4 подгрупп: 1-я — 18 пациенток с ПР, у которых спонтанная родовая деятельность развилась в 34—37 нед, 2-я — 20 беременных с ПЭ средней степени тяжести в соответствии с международной классификацией болезней (МКБ-10), код О14.0. Клинические признаки ПЭ появились у них после 24—26 нед гестации: артериальная гипертензия (артериальное давление — АД 140—160 мм рт.ст.), протеинурия (выше 0,3 г/сут, но ниже 2 г/сут), беременность у женщин этой подгруппы, а также 3-й и 4-й подгрупп завершилась родами в срок 39—40 нед. В 3-ю подгруппу были включены 19 пациенток с плацентарной недостаточностью (ПН), в 4-ю — 17 пациенток, у которых беременность осложнилась ЗРП на фоне ПН, верифицированной после родов. Диагноз ПН был поставлен на основании результатов комплексного функционально-биохимического обследования, включающего гормональные, ультразвуковые, допплерометрические исследования, определение специфических плацентарных изоферментов щелочной фосфатазы и глутаматдегидрогеназы [16], патоморфологический анализ плаценты после родов. Согласно оценочной шкале, используемой в неонатальной практике (приказ МЗ России от 10.05.17 №203н «Об утверждении критериев оценки качества медицинской помощи»), новорожденным 4-й подгруппы был установлен диагноз ЗРП I степени с учетом гестационного возраста при рождении. Масса и длина тела этих новорожденных составили 2606,41±208,32 г и 45,15±1,53 см соответственно, весоростовой коэффициент — 57,73±2,31. У детей контрольной группы данные показатели были равны 3414,32±273,25 г (p=0,020) и 52,24±3,05 см (p=0,035) соответственно, весоростовой коэффициент — 65,36±3,05 (p=0,04). Масса плацент в 4-й подгруппе составила 452±30 г, в контрольной группе — 562±41 г (p<0,03).
Материалом исследования служили плаценты, полученные после родов при соблюдении холодового режима. Из ткани плаценты стандартным методом дифференциального ультрацентрифугирования в солевом растворе, содержащем 0,25 М сахарозы при 12 000 g 10 мин получали осадок, из которого после ресуспендирования в среде, содержащей 2,5 М сахарозы, и центрифугирования при 80 000 g 30 мин выделяли ядра. Чистоту фракции определяли микроскопически. Из ядер после изоосмотического лизиса методом центрифугирования (16 000 g 10 мин) выделяли общие гистоны и негистоновые белки хроматина [17].
Циклонуклеотидзависимое фосфорилирование ядерных белков оценивали по включению в них [g-32p] АТФ, добавляя в субстратные смеси цАМФ или цГМФ при определении активности соответствующих ферментов их воздействия — протеинкиназ (цАМФ ПК и цГМФ ПК). О степени окислительной модификации белков судили по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков (карбонильных производных) с 2,4-динитрофенилгидразином, конечные продукты которой регистрировали при длине волны 363 нм.
Об интенсивности продукции транскрипционного фактора NF-κB судили по ДНК-связывающей активности его субъединицы p65, которую оценивали с помощью наборов и выражали в оптических единицах (опт. ед.) на 1 мг общего белка. Определение рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-наборов в соответствии с инструкцией фирмы-разработчика. Транскрипционные факторы наряду с плацентой определялись в околоплодных водах в первом периоде родов при вскрытии плодного пузыря.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы StatSoft Inc.). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. Корреляционный анализ выполнен с использованием критерия Пирсона и расчетом коэффициента корреляции r. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования свидетельствуют о посттрансляционных изменениях структуры белков хроматина при осложненной беременности. Для реакций фосфорилирования интенсивность изменения зависит от акушерской патологии, циклического нуклеотида, регулирующего протеинкиназную активность, фракции белков хроматина (табл. 1). Степень снижения активности цАМФ-ПК и цГМФ-ПК при всех изученных осложнениях гестации при исследовании гистонов превышает физиологические показатели, особенно при ПР (на 40,8 и 30,8%; p<0,001) и при ЗРП (в среднем на 30,0%; p<0,001). Аналогичная направленность изменений имеется и для негистоновых белков, однако степень их при указанных патологических состояниях более выражена: в среднем на 45% (p<0,001), очевидно, вследствие их повышенной лабильности. Что касается ПЭ, то снижение процессов фосфорилирования белков обеих фракций при этом осложнении беременности составляет 18,0 и 20,7% (p<0,001) соответственно. Промежуточное положение занимает ПН: активность цАМФ-ПК и цГМФ-ПК при ней уменьшается на 26,4—29,5% (p<0,01).
Таблица 1. Интенсивность посттрансляционных модификаций белков хроматина в плаценте при физиологической и осложненной беременности (M±m)
| Течение беременности | Гистоны | Негистоновые белки | ||||
| активность, имп/с/мг белка | карбонильные производные, мкмоль/г белка | активность, имп/с/мг белка | карбонильные производные, мкмоль/г белка | |||
| цАМФ-ПК | цГМФ-ПК | цАМФ-ПК | цГМФ-ПК | |||
| Физиологическая беременность | 24,31±1,52 | 29,36±2,03 | 1,50±0,11 | 57,52±5,12 | 39,41±3,02 | 1,91±0,13 |
| Плацентарная недостаточность | 17,14±1,16** | 23,05±1,55* | 2,18±0,13** | 40,65±2,81** | 29,03±2,21** | 2,37±0,12** |
| Преждевременные роды | 14,39±1,23*** | 20,32±1,38*** | 2,47±0,15*** | 31,18±2,43*** | 25,18±1,49*** | 2,59±0,18** |
| Задержка роста плода | 16,83±1,02*** | 22,16±1,47*** | 2,32±0,13*** | 32,25±2,51*** | 27,22±1,67*** | 2,47±0,16** |
| Преэклампсия | 19,27±1,45* | 24,11±1,13* | 1,86±0,12* | 44,62±3,21* | 31,23±2,32* | 2,29±0,12* |
Примечание. Здесь и в табл. 2 — статистическая значимость различий при физиологической и осложненной беременности: * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001.
Такое изменение фосфорилирования гистонов и негистоновых белков, несомненно, оказывает выраженное влияние на функционирование плаценты в связи с их участием в регуляции матричной активности хроматина и, как следствие, интенсивности синтеза нуклеиновых кислот [18]. Данные белки, являясь также регуляторами биологической активности ДНК (процессов репликации и транскрипции), могут усиливать пролиферативные процессы, высокая интенсивность которых характерна для плацентарной ткани [19]. Кроме того, модификация негистонов, служащих акцепторными участками хроматина для стероид-рецепторных комплексов, очевидно, способствует гормональному дисбалансу в фетоплацентарной системе.
Важным звеном в общей цепи метаболических повреждений в плаценте при осложненной беременности является свободнорадикальная модификация белков, проявляющаяся в увеличении количества карбонильных производных, которые образуются при окислении белковых молекул. Как показали наши исследования, карбонилирование негистоновых белков при физиологической беременности превышает аналогичный показатель у гистонов на 27,3%, p<0,01 (см. табл. 1). В то же время степень изменения содержания карбонильных производных при всех изученных акушерских осложнениях более выражена для гистонов. Наиболее значимое изменение (увеличение), как и при фосфорилировании белков, развивается при ПР (на 64,6%; p<0,001) и ЗРП (на 54,5%; p<0,001), затем в убывающем порядке следуют изменения при ПН (на 45,3%; p<0,01) и ПЭ (на 24,0%; p<0,05). Увеличение окислительной деструкции негистоновых белков менее выражено, хотя относительная интенсивность отклонений при разных осложнениях гестации аналогична таковой у гистонов: от 42,5% (p<0,001) при ПР до 19,9% (p<0,05) при ПЭ.
Известно, что карбонильные производные образуются в условиях хронической гипоксии и гиперпродукции активных форм кислорода, обусловленной нарушением баланса про- и антиоксидантов. В связи с тем что высокая степень этих процессов особенно характерна для ПР и ЗРП, такое распределение характера изменений весьма объяснимо. Выявленное усиление окислительной модификации ядерных белков плаценты может сопровождаться нарушением различных уровней структуры белков и дестабилизацией белковой молекулы [20—22].
На постгеномные изменения белков хроматина, нарушающие их регуляторные воздействия, влияют продукция и активность ядерных транскрипционных факторов, функционирование которых зависит от этих изменений.
ДНК-связывающая активность (табл. 2) субъединицы p65 NF-κB в плаценте при ПН повышается на 33,5% (p<0,001), при ЗРП на 40,0% (p<0,001), при ПЭ на 26,1% (p<0,001). Максимальные изменения возникают при ПР, когда активность этого фактора возрастает на 43,0% (p<0,001). По данным авторов [23], активированный NF-κB увеличивает экспрессию ферментов, участвующих в метаболизме арахидоновой кислоты и синтезе простагландинов, усиливая процессы преждевременного родовозбуждения.
Таблица 2. Содержание транскрипционных факторов в плаценте и околоплодных водах при физиологической и осложненной беременностях (M±m)
| Течение беременности | Плацента | Околоплодные воды | ||
| фактор NF-κB, ед/мг белка | фактор PPAR-g, нг/мг белка | фактор NF-κB, ед/мг белка | фактор PPAR-g, нг/мг белка | |
| Физиологическая беременность | 7,25±0,39 | 0,23±0,02 | 4,62±0,28 | 2,62±0,21 |
| Плацентарная недостаточность | 9,68±0,59*** | 0,30±0,02* | 3,28±0,25*** | 1,94±0,16** |
| Преждевременные роды | 10,36±0,81*** | 0,34±0,03*** | 3,36±0,24*** | 1,39±0,14*** |
| Задержка роста плода | 10,20±0,74*** | — | 3,12±0,29*** | — |
| Преэклампсия | 9,14±0,54** | — | 3,45±0,25** | — |
Кроме того, фактор NF-κB способен взаимодействовать с рецептором прогестерона и уменьшать его контактные возможности, что приводит к ослаблению эффектов самого прогестерона. Повышение продукции и активности субъединицы p65 NF-κB может также сопровождаться изменением его транслокации в ядро и модификацией внутриядерных процессов, в частности, экспрессией различных генов.
Не менее важен в метаболическом отношении транскрипционный фактор PPAR, особенно его форма PPARγ, распространенная более широко, чем формы α и β, в репродуктивных тканях. Абсолютные величины концентрации этого фактора в плаценте значительно ниже, чем активность NF-κB, с которым он находится во взаимозависимых отношениях [9]. Однако направленность и степень изменения этих факторов одинаковые. При ПН содержание PPAR повышается на 30,4% (p<0,05), а при ПР увеличение составляет 47,8% (p<0,001; см. табл. 2). Такая однонаправленность динамики транскрипционных факторов в плаценте, по-видимому, усиливает их воздействие прежде всего на белковый компонент клеток, ферментативные реакции всех видов обмена веществ и в целом на метаболический и функциональный гомеостаз в фетоплацентарной системе.
Несомненный вклад в функционирование данной системы вносят околоплодные воды — важное звено в параплацентарном обмене между матерью и плодом [24, 25]. При изученных акушерских осложнениях концентрации обоих факторов в околоплодных водах, в отличие от плацентарной ткани, достоверно снижаются. Причины такого снижения недостаточно ясны, что требует проведения дополнительных исследований. Для NF-κB степень снижения наиболее выражена при ЗРП (на 32,4%; p<0,001), что, возможно, свидетельствует об активной роли плода в динамике этого компонента после его секреции плацентой. К сожалению, содержание фактора PPAR представлялось возможным изучить только при двух патологических состояниях: ПН и ПР. Причем степень снижения (см. табл. 2) во втором случае относительно физиологической величины была значительно больше (47,1%; p<0,001 при ПР против 26,1%; p<0,001 при ПН). Изменение уровней NF-κB и PPAR как в плаценте, так и в околоплодных водах свидетельствует не о локальном, а о системном характере их модификаций.
Важно отметить, что между степенью посттрансляционных изменений плацентарных ядерных белков и величиной транскрипционных ядерных факторов обнаруживается прямая корреляция. Коэффициенты корреляции между уровнем фосфорилирования белков хроматина и факторов NF-κB (r) при четырех осложнениях беременности находятся в пределах от 0,86 до 0,81 (p=0,045—0,039), а между степенью карбонилирования белков и указанным фактором коэффициенты r равны 0,089—0,085 (p=0,047—0,042). Для фактора PPAR при двух осложнениях беременности коэффициент корреляции с фосфорилированием белков составляет 0,086—0,083 (p=0,046—0,041), а с карбонилированием — 0,086—0,084 (p=0,043—0,041).
В целом, оценивая модификацию белков хроматина в плаценте и отклонения в содержании и активности транскрипционных факторов в плаценте и околоплодных водах, следует отметить, что разные осложнения беременности на фоне однонаправленных изменений многофункциональных молекулярных компонентов отличаются степенью этих повреждений; последнее, несомненно, влияет на особенности клинических проявлений той или иной акушерской патологии.
Заключение
Полученные данные свидетельствуют, что при разных осложнениях беременности, объединенных, по современным представлениям, в группу больших акушерских синдромов, происходят усиление посттрансляционных модификаций плацентарных ядерных белков и нарушение продукции транскрипционных факторов в плаценте и околоплодных водах. Эти отклонения приводят к повреждению различных уровней структуры белков хроматина. Такие изменения с учетом того, что они происходят на трансляционном уровне регуляции протеосинтеза, служат молекулярной основой метаболических и, как следствие, функциональных нарушений в плаценте и фетоплацентарном комплексе в целом. Разная степень этих изменений при различных патологических состояниях может в значительной мере определять их клиническую картину.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Погорелова, В.О. Гунько
Сбор и обработка материала — А.А. Михельсон, В.О. Гунько, А.А. Никашина
Статистическая обработка данных — В.О. Гунько, Н.В. Палиева
Написание текста — Т.Н. Погорелова, А.А. Михельсон
Редактирование — Н.В. Палиева, А.А. Никашина
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — T.N. Pogorelova, V.O. Gun’ko
Data collection and processing — A.A. Mikhel’son, V.O. Gun’ko, A.A. Nikashina
Statistical processing of the data — V.O. Gun’ko, N.V. Palieva
Text writing — T.N. Pogorelova, A.A. Mikhel’son
Editing — A.A. Nikashina, N.V. Palieva
Authors declare lack of the conflicts of interests.