Особенности дифференцировки B-лимфоцитов у женщин с преэклампсией и маркерами бактериального инфицирования

Преэклампсия (ПЭ) остается одной из актуальных проблем современного акушерства. Механизмы, ведущие к развитию ПЭ, до конца не ясны. Существует более 30 аргументированных этиопатогенетических теорий возникновения ПЭ, однако ни одна из них не может объяснить полностью разнообразие выявляемых при этой патологии морфофункциональных изменений и клинических проявлений [1]. Ученое сообщество сходится во мнении, что механизм развития ПЭ базируется на воспалении неинфекционного генеза, но в последние годы появились исследования, свидетельствующие о возможной триггерной роли инфекционного агента в патогенезе ПЭ [2]. Было выявлено, что для беременных с ПЭ характерна повышенная частота выявления маркеров активной уреаплазменной инфекции и вируса простого герпеса [3, 4]. Многоцентровые исследования показали, что повышенный риск развития преэклампсии связан с инфицированием Chlamydia trachomatis, но не с инфицированием вирусом простого герпеса и цитомегаловирусом [5]. В исследовании Е.Г. Сюндюковой и соавт. [6] отмечалась высокая частота развития генитальной инфекции у пациенток с ПЭ, начиная с I триместра беременности, причем в наибольшей степени это проявлялось у беременных с развившейся тяжелой ПЭ [6]. Указывается, что инфекционно-токсическое действие перенесенной инфекции может приводить к развитию системного воспалительного ответа и увеличивает риск возникновения осложнений беременности, в том числе ПЭ [2]. В ряде работ высказывается мнение о значении аутоиммунных реакций в различных органах-мишенях при гипертензии у беременных, рассматривается патогенетическая роль аутоантител и иммунных комплексов в повреждении эндотелия сосудов и развитии чрезмерного провоспалительного ответа [7]. По некоторым данным, аутоантитела различной специфичности встречаются у 94% женщин с ПЭ. Причем тяжелая ПЭ отличается наиболее выраженными сдвигами в содержании аутоантител [8]. Известно, что ряд бактериальных инфекционных агентов (Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis) могут инициировать аутоиммунные реакции [2].

Следует отметить, что во время беременности существует множество факторов, которые могут вызывать изменения в структуре и/или составе микробиома влагалища [9]. Было выявлено увеличение бактериальной массы Lactobacillus во влагалище беременных по сравнению с небеременными. По данным анализа методом полимеразной цепной реакции, у беременных было меньше шансов иметь положительный ответ на обнаружение молликутов и уреаплазм по сравнению с небеременными женщинами. Следует отметить, что послеродовый микробиом вновь становился более богатым и разнообразным, с меньшим количеством Lactobacillus spp. Это, по мнению авторов, является убедительным подтверждением того, что беременность оказывает временное влияние на микробное сообщество влагалища [10]. В то же время исследование биоптатов хориона в плацентах после кесарева сечения показало, что примерно 50% плацент содержит микроорганизмы в хорионической пластинке [10], и их состав в значительной степени отличается от вагинального [11]. Кроме того, было показано, что этиологическую роль в развитии ПЭ могут играть так называемые спящие микробы в крови и/или в тканях [4]. Наличие «невидимых» микробов остается клинически незамеченным, однако они могут быть истинной причиной заболеваний, ранее считавшихся неинфекционными [4]. Согласно данным литературы инфекция, даже бессимптомно протекающая, играет значительную роль в активации провоспалительных цитокинов, приводит к нарушениям системы гемостаза и иммунитета, что служит триггером в развитии многих акушерских осложнений, в том числе ПЭ [6]. Однако и при неосложненной беременности маркеры бактериального инфицирования встречаются достаточно часто, но при этом патологические реакции не развиваются [12]. Возможно, эти различия определяются индивидуальными особенностями иммунного ответа беременных на патогенную микрофлору.

В связи с изложенным цель исследования — изучить особенности дифференцировки и активации B-лимфоцитов у беременных с наличием маркеров бактериального инфицирования при неосложненном течении беременности и развитии ПЭ.

В условиях ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России на первом этапе было проведено обследование для выявления маркеров инфекции 144 беременных с ПЭ и без гипертензивных расстройств. Критериями исключения явились острые воспалительные заболевания и обострение хронических на момент обследования, аутоиммунные заболевания, онкозаболевания, многоплодная беременность.

В своей работе мы ориентировались на метод твердофазного иммуноферментного анализа, который позволяет выявить не только маркеры бактериального инфицирования (вне зависимости от их локализации в организме), но и остроту инфекционного процесса.

В сыворотке крови на микропланшетном ридере Multiscan (ThermoFisherScientific, Финляндия) с использованием тест-систем производства АО «ВЕКТОР-БЕСТ» (Россия) определяли наличие IgA, IgM, IgG к Ch. trachomatis; IgA, IgG к U. urealyticum; IgA, IgG к M. hominis. Наличие маркеров бактериального инфицирования выявили у 84 пациенток, имевших антитела (АТ) к этим возбудителям: у 40 пациенток без гипертензивных расстройств в течение беременности — группа сравнения, и у 44 беременных с ПЭ — основная группа. У 60 пациенток маркеры бактериального инфицирования не выявлены, и они были исключены из дальнейшего исследования. Для оценки относительного содержания лимфоцитов B₁ (CD20+, CD5+), B₂ (CD20+, CD5‒), B-клеток памяти (CD19+, CD27+), плазматических клеток (CD19+, CD20‒, CD38+) и регуляторных B-клеток (CD20+, IL-10+) в популяции B-клеток использовалась проточная цитофлуориметрия. Исследования проводили на проточном цитофлуориметре FACSCantoII в программе FACSDiva. Такой метод исследования доступен в учреждениях третьего уровня, а согласно приказу МЗ РФ №1130н от 20.10.20 «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология» «...наличие преэклампсии служит критерием для направления пациентки в стационар третьего уровня. Оценку сывороточного содержания иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM проводили методом иммуноферментного анализа (АО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия), циркулирующих иммунных комплексов — на фотоэлектрическом колориметре КФК-2 («ЗОМЗ», Россия) по стандартной методике.

Беременных с ПЭ обследовали в момент постановки диагноза, группу сравнения подбирали по сроку гестации от 24 до 40 нед беременности. Все обследования проводили однократно. Возраст обследуемых пациенток колебался от 20 до 47 лет, в основной группе он составил 28,5 [23; 34,75] года, в группе сравнения — 31,5 [27; 32] года. Обследуемые были сопоставимы по возрасту и социальному статусу (p>0,05). В обеих группах большинство женщин находились в браке (p>0,05). У беременных основной группы чаще отмечалось указание на табакокурение по сравнению с таковым в группе сравнения (p=0,03).

Клинически на момент обследования признаки инфекции у пациенток не выявлялись. Среди экстрагенитальной патологии наиболее часто встречались заболевания сердечно-сосудистой системы, воспалительные заболевания мочевыделительной системы, обменно-эндокринная патология. Варикозная болезнь нижних конечностей диагностирована у 14 (31,8%) пациенток основной группы, что было достоверно чаще, чем у пациенток группы сравнения — 2 (8%; p=0,04). У беременных с ПЭ достоверно чаще встречалась хроническая артериальная гипертензия (42,1%), мочекаменная болезнь (31,8%), хронический пиелонефрит (47,7%), чем у пациенток группы сравнения (p<0,05 во всех наблюдениях). Достоверных различий по частоте хронического цистита выявлено не было (p>0,05). Нарушение жирового обмена I, II и III степени достоверно чаще выявлялось у пациенток с гипертензивными расстройствами, чем у пациенток группы сравнения (p=0,039).

По данным семейного анамнеза, у 17 (38,6%) пациенток основной группы отмечено наличие сердечно-сосудистых заболеваний у родственников первой линии. В группе сравнения только 3 (12%; p=0,033) пациентки указали на наличие у их родственников заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Изучение акушерского анамнеза показало, что большинство пациенток основной группы составили повторнобеременные — 23 (52,2%), тогда как в группу сравнения преимущественно вошли первобеременные женщины — 18 (72%; p<0,05). Среди заболеваний репродуктивной системы у пациенток основной группы достоверно чаще встречались нарушения менструальной функции (31,8%), бесплодие (28,3%), самопроизвольные выкидыши (18,9%; p<0,05 во всех наблюдениях).

Ведущим осложнением настоящей беременности в I и II триместрах в группе с ПЭ по сравнению с таковым во 2-й группе была угроза прерывания беременности (54,5 и 22,7%; p=0,03). В III триместре у беременных с ПЭ достоверно чаще встречалась плацентарная недостаточность с нарушением маточно-плацентарного и/или плодово-плацентарного кровотоков (p<0,05 в обоих случаях). В основной группе (с ПЭ) число дней до родоразрешения составило в среднем 6,0 [3,0; 10,0] дня, беременность чаще завершалась преждевременными родами (p=0,001), при этом беременные имели наименьший гестационный срок на момент родоразрешения — 35,0 [33,2; 37,0] нед (p=0,001) по сравнению с таковыми в группе сравнения.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью прикладных лицензионных программ Microsoft Office 2010, Statistica for Windows 13.0. Количественное описание величин производилось в виде медианы с указанием 25-го и 75-го перцентилей — Me [Q1; Q3]. Проверку данных на нормальность распределения осуществляли с помощью критериев Колмогорова и Шапиро—Уилка. Достоверность различий между показателями оценивали по непараметрическому критерию U (Манна—Уитни). Для определения достоверности различий по частоте выявления маркеров инфекции использовали критерий χ², критерий Манна—Уитни (при p<0,05 различия считали статистически значимыми).

При обследовании на наличие маркеров инфекции мы не выявили достоверных различий по частоте определения антител к Ch. trachomatis, U. urealyticum, M. hominis у женщин с ПЭ и в группе с неосложненным течением беременности (p>0,05 во всех наблюдениях) (табл. 1). Это согласуется с данными других исследователей [12] о достаточно высокой частоте выявления маркеров инфицирования и при неосложненной беременности.

Таблица 1. Частота выявления специфических АТ к Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis у беременных основной группы и группы сравнения

В популяции B-лимфоцитов отмечалось достоверное повышение относительного содержания B₁-клеток (p=0,04) и, соответственно, закономерное снижение уровня B₂-клеток (p=0,004) в группе пациенток с ПЭ по сравнению с пациентками без гипертензивных расстройств (табл. 2). Предварительный анализ исследуемых показателей в зависимости от срока гестации — в 24—34 нед и более 34 нед, достоверных различий между группами не выявил (p>0,05).

Таблица 2. Особенности фенотипа B-лимфоцитов у беременных с маркерами бактериального инфицирования

Известно, что, с одной стороны, B₁-лимфоциты реагируют с распространенными бактериальными антигенами (липо- и полисахаридами), обеспечивая первую линию защиты от инфекции, а с другой стороны, могут служить источником патологических аутоиммунных реакций [13]. По данным литературы, B₁-клетки могут взаимодействовать с такими аутоантигенами, как ДНК, компоненты цитоскелета, фосфатилхолин, вырабатывать антитела к рецепторам 1-го типа ангиотензина II (АТ1P), AT1R-активирующие аутоантитела (AT1-AAs), антифосфолипидные антитела (АФА), антиэндотелиальные антитела (АЭАт), антигликановые антитела (АгАт) и т.д. [14]. Уровень аутоантител при ПЭ достоверно повышается. В то же время имеются данные о том, что некоторые бактериальные агенты могут изменять структуру мембраны инфицированных клеток, тем самым также обусловливая продукцию аутоантител [15]. Эти же факторы могли повлиять и на выявленное нами достоверное повышение относительного содержания плазматических клеток в группе пациенток с ПЭ (p=0,0007), и рост уровня клеток памяти (CD19+, CD27+) (p=0,004) по сравнению с группой пациенток с неосложненным течением беременности. Одним из причинных факторов повышения уровня клеток памяти у женщин с ПЭ могло быть более длительное течение инфекционного процесса. Достоверных различий по содержанию Breg в периферической крови женщин с ПЭ по сравнению с группой без гипертензивных расстройств не отмечалось (p=0,07).

Исследуя сывороточный уровень иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgA, IgM), мы установили, что в группе женщин с ПЭ сывороточное содержание IgM было достоверно ниже, чем при неосложненной беременности (p=0,002), тогда как содержание IgA и IgG было сопоставимо в обеих группах (p>0,05; табл. 3).

Таблица 3. Содержание иммуноглобулинов и ЦИК у беременных с маркерами бактериальной инфекции

При этом содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) было также сопоставимо в обеих группах (p>0,05). Отсутствие значительных изменений в сывороточном уровне IgG и снижение содержания IgM при наличии достоверного повышения содержания фенотипа B₁, B-клеток памяти, плазматических клеток позволяют предположить, что эти показатели не отражают истинного характера продукции иммуноглобулинов при ПЭ. Вероятно, продуцируемые антитела и иммунные комплексы у беременных с ПЭ фиксируются в тканях различных органов-мишеней [16]. Это может способствовать развитию патологических процессов на локальном уровне, повреждению эндотелия сосудов в виде набухания, пролиферации, разрыхления и отрыва эндотелия от базальной мембраны [17], а также ремоделированию почечной ткани [18].

Как известно, хламидиоз, уреаплазмоз и микоплазмоз имеют ряд общих патогенетических черт. Эти инфекции характеризуются тем, что, с одной стороны, возбудитель находится внутри клеток и вызывает иммунопатологические нарушения, а с другой стороны, инфекция протекает на фоне снижения иммунологической реактивности [19]. Бактерии рода Mycoplasma и Ureaplasma — мембранные паразиты, их отличает отсутствие клеточной стенки, персистенция на мембране клеток организма хозяина, малый размер генома, высокая скорость фенотипической и генотипической изменчивости [20, 21]. Считают, что доминирующим фактором, определяющим патогенность микоплазмы, является способность вступать в межмембранное взаимодействие с пораженной клеткой, при котором возможен обмен отдельными мембранными компонентами. В результате этого нарушается процесс распознавания антигенов и начинается выработка антител против собственных клеток [22, 23]. Аутоантитела, характерные для аутоиммунных процессов, часто обнаруживаются при микоплазменной инфекции [15]. В экспериментальных исследованиях было доказано, что U. urealyticum кроме прямого цитотоксического действия оказывает тератогенное и мутагенное влияние на хромосомный аппарат клетки [24]. Ch. trachomatis является безусловным патогеном, выживание и рост которого зависят от создания внутриклеточной ниши, откуда он может захватить множество питательных веществ в клетках-хозяевах и уклониться от иммунного ответа [25].

Учитывая некоторые различия патогенетических свойств этих бактерий, мы проанализировали характер изменений фенотипа B-лимфоцитов в группах в зависимости от вида инфицирования. У женщин с ПЭ и маркерами микоплазменной инфекции отмечалось только достоверное повышение содержание B₁-лимфоцитов (рисунок, а) по сравнению с таковым у пациенток без гипертензивных расстройств: группа сравнения — 9,6 [8; 11,6]%, основная группа — 16,1 [11,4; 21,9]%; p=0,002.

У пациенток с ПЭ и маркерами хламидийной инфекции отмечено достоверное повышение содержания плазматических клеток (группа сравнения — 0,8 [0,55; 1,25]%, основная группа — 3,9 [1,8; 5,4]%; p=0,007) (см. рисунок, б).

У пациенток с уреаплазменной инфекцией выявлено достоверное повышение содержания B-клеток памяти (CD19+, CD27+) в группе пациенток с ПЭ: группа сравнения — 23,45 [17,95; 29,17]%, основная группа — 45,45 [34; 59,12]%; p=0,007 (см. рисунок, в).

Содержание B₁-лимфоцитов (а), плазматических клеток (б) и B-клеток памяти (в) в периферической крови у пациенток с маркерами микоплазменной инфекции при неосложненной беременности (группа сравнения) и преэклампсии (основная группа).

Таким образом, иммунный ответ на исследуемые патогены при ПЭ значительно отличался от такового при неосложненном течении беременности. Проведенное исследование показало, что бактериальное инфицирование у женщин с ПЭ стимулирует чрезмерную активацию B-клеток и изменяет характер дифференцировки этой популяции лимфоцитов. Более высокий уровень B-клеток памяти и плазматических клеток у женщин с ПЭ, вероятно, определялся длительностью воздействия инфекционных агентов на фоне недостаточной компенсаторной функции регуляторных B-клеток. Такой характер иммунного ответа может способствовать поражению собственных тканей в различных органах-мишенях.

У женщин, имеющих маркеры бактериального инфицирования, развитие ПЭ сочетается с достоверным преобладанием относительного содержания пула B₁-лимфоцитов, ростом уровня B-клеток памяти и плазматических клеток.

Для женщин с ПЭ и наличием маркеров микоплазменной инфекции характерно достоверное повышение содержания B₁-лимфоцитов; с хламидийной инфекцией — плазматических клеток; с уреплазменной инфекцией — B-клеток памяти.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.И. Малышкина, А.В. Кудряшова, В.В. Парейшвили

Сбор и обработка материала — А.С. Панащатенко, И.А. Панова

Статистическая обработка — А.С. Панащатенко

Написание текста — А.С. Панащатенко, И.А. Панова, А.В. Кудряшова

Редактирование — А.В. Кудряшова, И.А. Панова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.