Аномальное метилирование ряда генов при гиперплазии эндометрия на фоне хронического эндометрита

Большинством исследователей [1, 2, 5, 11, 14] хроническое воспаление рассматривается в качестве предрасполагающего фактора для последующего развития гиперпластических и неопластических заболеваний. В процессе хронизации воспалительная реакция теряет эволюционно выработанное защитно-приспособительное значение, направленное на элиминацию патогенного фактора и устранение повреждения ткани [2]. При этом молекулярные механизмы, способствующие нарушению тканевого и клеточного гомеостаза с возникновением гиперпластических изменений при длительно текущей местной воспалительной реакции в эндометрии, изучены недостаточно.

На основании иммуногистохимического исследования установлено изменение экспрессии генов, ответственных за апоптоз, пролиферацию, неоангиогенез и ремоделирование межклеточного матрикса при гиперплазии эндометрия (ГЭ) в зависимости от ее морфологического варианта, а также наличия сопутствующих гиперпластических заболеваний матки (миомы матки, аденомиоза) [7, 9, 15]. Для различных гистологических вариантов ГЭ характерно абсолютное либо относительное преобладание экспрессии маркеров пролиферации над апоптозом, повышение экспрессии маркеров неоангиогенеза, измененный рецепторный статус по сравнению с морфологически неизмененным эндометрием фазы пролиферации [7, 9, 15]. Так, простая ГЭ развивается как результат увеличения продолжительности жизни клеток эндометрия за счет резкого угнетения апоптоза на фоне низкой пролиферации, а также гипертрофии эпителия и стромообразования [7]. Комплексная ГЭ возникает в результате гиперплазии эпителиальных клеток эндометрия и снижения стромообразования с подключением механизмов стимуляции неоангиогенеза, нехарактерных для нормального эндометрия фазы пролиферации [7].

Инактивация генов, ответственных за апоптоз, репарацию ДНК, адгезию и контактное торможение клеток, вследствие метилирования CpG-островков промоторных активирующих и регуляторных областей этих генов является важнейшим событием модификации генома в процессе гипер- и неопластической трансформации ткани [6, 8].

Цель настоящего исследования - определение участия аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, CDH1, Р21^WAF1 и CD44 в развитии ГЭ на фоне хронического эндометрита (ХЭ).

В исследование включены 52 женщины с морфологически верифицированной ГЭ: простой ГЭ без атипии (41 больная), сложной ГЭ без атипии (9), сложной ГЭ с атипией (2). Средний возраст пациенток составил 37,9±3,8 года.

В зависимости от наличия гистологических признаков ХЭ пациенты разделены на две группы: 1-ю составили 27 женщин с ГЭ без признаков ХЭ; 2-ю - 25 - с сочетанием ГЭ и ХЭ. Геномную ДНК выделяли из операционного материала (образцов эндометрия), полученного при выскабливании стенок полости матки больных, методом фенолхлороформной экстракции [6]. Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяли метод метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали ДНК из эндометрия и лимфоцитов периферической крови, предварительно гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) либо HhaI (GCGC) [16]. Для этого 1 мкг геномной ДНК обрабатывали 10 ед. акт. рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение 12 ч. Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывалось наличие внутренних сайтов узнавания для используемых рестриктаз в амплифицируемом участке, который содержал не менее 3-4 сайтов узнавания для HpaII или HhaI. В случае модификации цитозинов в метилцитозин гидролиз ДНК не происходит, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не определяется. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР были указаны в ранее опубликованных работах [6].

Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования были разработаны мультилокусные ПЦР для трех пар праймеров, один фрагмент принадлежал исследуемому гену, а два других служили в качестве положительного и отрицательного контроля. Для оценки полноты гидролиза ДНК проводилась МЧ-ПЦР фрагмента гена ING1-1b, содержащего сайты узнавания для рестриктаз HpaII и HhaI. В качестве внутреннего контроля ПЦР был выбран фрагмент экзона 8 гена EXT2, не содержащий сайтов узнавания для указанных рестриктаз. Продукты ПЦР разделяли в 8% полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра [6].

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Statistica 6.0.

Для изучения возможной связи между метилированием каждого из исследуемых генов и ХЭ использовали сравнение групп с помощью критерия χ². Индекс метилирования (ИМ) для каждой из выделенных групп рассчитывали по формуле: отношение числа метилированнных генов в каждом образце к общему числу исследуемых генов. Сравнение ИМ проводили при помощи критерия Манна-Уитни.

Исследовано метилирование генов RASSF1A, CDH1, Р21^WAF1 и CD44 в образцах гиперплазированного эндометрия, не имеющих морфологических признаков ХЭ и с наличием ГЭ на фоне ХЭ. Частота метилирования и ИМ отражены в таблице.

Статистически достоверных различий по частоте метилирования гена RASSF1A в двух группах не отмечено. В каждой группе гиперметилирование гена RASSF1A встречалось как при ГЭ с атипией, так и при ГЭ без атипии (по одному случаю соответственно).

Ген CDH1, кодирующий Е-кадгерин, характеризовался отсутствием метилирования во всех клинических наблюдениях. Обращало на себя внимание повышение частоты гиперметилирования гена Р21^WAF1 при ГЭ, развившейся на фоне ХЭ. Кроме того, ГЭ отличалась повышенной частотой метилирования CD44: 68,0% наблюдений во 2-й группе при сочетании ГЭ с ХЭ и 14,8% в 1-й группе в случае монопатологии слизистой оболочки матки. ИМ во 2-й группе оказался выше, чем в 1-й группе.

В различных исследованиях было убедительно показано, что хроническое воспаление сопровождается повышенным уровнем метилирования различных генов, в том числе относящихся к генам-супрессорам опухолевого роста.

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия II и III степени, а также морфологически неизмененные ткани в районе интраэпителиальной неоплазии демонстрируют аномальное метилирование генов Р16, MLH1, NM33 и др. [6]

Различные морфологические варианты ГЭ (простая ГЭ без атипии, сложная ГЭ без атипии, сложная ГЭ с атипией) и дифференцированная аденокарцинома эндометрия рассматриваются как прогрессирующие изменения гисто- и цитоархитектоники ткани с накоплением нозоспецифических молекулярно-генетических изменений клеток [4, 22, 23].

Важную роль в данном процессе играет метилирование генов, ответственных за апоптоз, репарацию ДНК, адгезию, ремоделирование межклеточного матрикса, ингибирование пролиферации [6, 8, 12, 13, 16, 17]. В нормальном эндометрии подобных изменений обнаружено не было. В то же время известно, что метилирование генов является одним из наиболее ранних изменений, происходящих в клетке до морфологического проявления заболевания [6]. Метилирование ряда ключевых генов, ответственных за функциональное ремоделирование ткани, значительно влияет на появление морфологических признаков гиперпластического процесса [6].

При ХЭ наблюдается снижение экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии, что, однако, нередко сочетается с очаговой ГЭ, аденомиозом и миомой матки и позволяет рассматривать данное заболевание как фактор риска гиперпластических заболеваний матки [3, 4].

RASSF1A как ген-супрессор опухолевого роста полифункционален. С одной стороны, RASSF1A участвует в регуляции RAS-киназного каскада и клеточного цикла (негативная регуляция) и, с другой стороны, - апоптоза и стабильности цитоскелета (позитивная регуляция) [6]. Ген с высокой частотой метилирован в злокачественных опухолях эпителиального происхождения, в том числе в опухолях эндометрия [16]. Мы не обнаружили достоверных различий по частоте метилирования гена RASSF1A в 1-й и 2-й группах, что свидетельствует об отсутствии влияния эпигенетической инактивации гена на развитие ХЭ. При этом частота метилирования гена RASSF1A при ГЭ в обеих группах оказалась повышенной, что согласуется с данными литературы [8, 15] о повышении частоты его метилирования при переходе от простой ГЭ к атипической ГЭ и аденокарциноме эндометрия.

Р21^WAF1 является первичной мишенью активации транскрипции Р53 и регулятором клеточной кинетики. Р21 не только ингибирует активность циклинзависимых киназ, что препятствует вступлению клеток в S-фазу клеточного цикла, но и напрямую участвует в регуляции генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла, апоптоза и старения [6]. Р21 редко метилирован в опухолях, таковое обнаружено только в злокачественных опухолях предстательной железы, желудка, головы и шеи, рабдомиосаркомах, при остром лимфолейкозе и лимфоме Беркита [20].

При гиперпластических процессах и опухолях внутренних гениталий у женщин эпигенетический вариант инактивации Р21 ранее не был описан. Выявленное нами повышение частоты метилирования гена-супрессора P21 при ГЭ на фоне ХЭ позволяет предположить возможный механизм стимуляции пролиферативного сигнала, точнее отсутствие его подавления, в эндометрии на фоне хронического воспаления.

Особого внимания заслуживает выявленное повышение частоты метилирования гена CD44 в обеих группах больных с ГЭ, особенно во 2-й группе (сочетание ГЭ и ХЭ), что свидетельствует о роли данного гена в развитии ГЭ и о кофакторной роли хронического воспаления слизистой оболочки матки в данном процессе. CD44 принадлежит к семейству трансмембранных гликопротеинов, ответственных за межклеточное взаимодействие между эпителиальными клетками, эпителиальными и стромальными клетками, и является рецептором гиалуроновой кислоты [19, 21]. Отсутствие экспрессии в результате метилирования гена CD44 часто обнаруживается в различных типах злокачественных опухолей на самых ранних стадиях канцерогенеза. Гиперметилирование CD44 выявлено при локализованном и метастатическом раке предстательной железы, независимо от стадии и степени дифференцировки, а также при раке молочной железы [24], нейробластоме и различных вариантах лимфом [10]. При гиперпластических процессах и опухолях внутренних гениталий у женщин метилирование гена также ранее выявлено не было.

Отсутствие метилирования CDH1 в нашем исследовании, в том числе в 2 случаях атипической ГЭ, согласуется с данными литературы [17, 18] о связи между снижением экспрессии Е-кадгерина и развитием инвазивных форм аденокарциномы эндометрия.

На основании полученных данных можно судить об избирательном потенцировании некоторых механизмов развития ГЭ в условиях хронического воспаления слизистой оболочки матки, а именно, об отсутствии ингибирования пролиферации клеток эндометрия по Р21-зависимому механизму и о нарушении связи клеток эндометрия с межклеточным матриксом посредством метилирования гена CD44.