Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Станоевич И.В.

Кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета

Землякова В.В.

Лаборатория молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Фен И.

Кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета

Аброкова Б.С.

Кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета

Залетаев Д.В.

Лаборатория молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Аномальное метилирование ряда генов при гиперплазии эндометрия на фоне хронического эндометрита

Авторы:

Станоевич И.В., Землякова В.В., Фен И., Аброкова Б.С., Залетаев Д.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2012;12(1): 20‑23

Просмотров: 330

Загрузок: 4

Как цитировать:

Станоевич И.В., Землякова В.В., Фен И., Аброкова Б.С., Залетаев Д.В. Аномальное метилирование ряда генов при гиперплазии эндометрия на фоне хронического эндометрита. Российский вестник акушера-гинеколога. 2012;12(1):20‑23.
Stanoevich IV, Zemliakova VV, Fen I, Abrokova BS, Zaletaev DV. Abnormal methylation of a number of genes in endometrial hyperplasia in the presence of chronic endometritis. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2012;12(1):20‑23. (In Russ.).

?>

Большинством исследователей [1, 2, 5, 11, 14] хроническое воспаление рассматривается в качестве предрасполагающего фактора для последующего развития гиперпластических и неопластических заболеваний. В процессе хронизации воспалительная реакция теряет эволюционно выработанное защитно-приспособительное значение, направленное на элиминацию патогенного фактора и устранение повреждения ткани [2]. При этом молекулярные механизмы, способствующие нарушению тканевого и клеточного гомеостаза с возникновением гиперпластических изменений при длительно текущей местной воспалительной реакции в эндометрии, изучены недостаточно.

На основании иммуногистохимического исследования установлено изменение экспрессии генов, ответственных за апоптоз, пролиферацию, неоангиогенез и ремоделирование межклеточного матрикса при гиперплазии эндометрия (ГЭ) в зависимости от ее морфологического варианта, а также наличия сопутствующих гиперпластических заболеваний матки (миомы матки, аденомиоза) [7, 9, 15]. Для различных гистологических вариантов ГЭ характерно абсолютное либо относительное преобладание экспрессии маркеров пролиферации над апоптозом, повышение экспрессии маркеров неоангиогенеза, измененный рецепторный статус по сравнению с морфологически неизмененным эндометрием фазы пролиферации [7, 9, 15]. Так, простая ГЭ развивается как результат увеличения продолжительности жизни клеток эндометрия за счет резкого угнетения апоптоза на фоне низкой пролиферации, а также гипертрофии эпителия и стромообразования [7]. Комплексная ГЭ возникает в результате гиперплазии эпителиальных клеток эндометрия и снижения стромообразования с подключением механизмов стимуляции неоангиогенеза, нехарактерных для нормального эндометрия фазы пролиферации [7].

Инактивация генов, ответственных за апоптоз, репарацию ДНК, адгезию и контактное торможение клеток, вследствие метилирования CpG-островков промоторных активирующих и регуляторных областей этих генов является важнейшим событием модификации генома в процессе гипер- и неопластической трансформации ткани [6, 8].

Цель настоящего исследования - определение участия аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, CDH1, Р21WAF1 и CD44 в развитии ГЭ на фоне хронического эндометрита (ХЭ).

Материал и методы

В исследование включены 52 женщины с морфологически верифицированной ГЭ: простой ГЭ без атипии (41 больная), сложной ГЭ без атипии (9), сложной ГЭ с атипией (2). Средний возраст пациенток составил 37,9±3,8 года.

В зависимости от наличия гистологических признаков ХЭ пациенты разделены на две группы: 1-ю составили 27 женщин с ГЭ без признаков ХЭ; 2-ю - 25 - с сочетанием ГЭ и ХЭ. Геномную ДНК выделяли из операционного материала (образцов эндометрия), полученного при выскабливании стенок полости матки больных, методом фенолхлороформной экстракции [6]. Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяли метод метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали ДНК из эндометрия и лимфоцитов периферической крови, предварительно гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) либо HhaI (GCGC) [16]. Для этого 1 мкг геномной ДНК обрабатывали 10 ед. акт. рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение 12 ч. Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывалось наличие внутренних сайтов узнавания для используемых рестриктаз в амплифицируемом участке, который содержал не менее 3-4 сайтов узнавания для HpaII или HhaI. В случае модификации цитозинов в метилцитозин гидролиз ДНК не происходит, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не определяется. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР были указаны в ранее опубликованных работах [6].

Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования были разработаны мультилокусные ПЦР для трех пар праймеров, один фрагмент принадлежал исследуемому гену, а два других служили в качестве положительного и отрицательного контроля. Для оценки полноты гидролиза ДНК проводилась МЧ-ПЦР фрагмента гена ING1-1b, содержащего сайты узнавания для рестриктаз HpaII и HhaI. В качестве внутреннего контроля ПЦР был выбран фрагмент экзона 8 гена EXT2, не содержащий сайтов узнавания для указанных рестриктаз. Продукты ПЦР разделяли в 8% полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра [6].

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Statistica 6.0.

Для изучения возможной связи между метилированием каждого из исследуемых генов и ХЭ использовали сравнение групп с помощью критерия χ2. Индекс метилирования (ИМ) для каждой из выделенных групп рассчитывали по формуле: отношение числа метилированнных генов в каждом образце к общему числу исследуемых генов. Сравнение ИМ проводили при помощи критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Исследовано метилирование генов RASSF1A, CDH1, Р21WAF1 и CD44 в образцах гиперплазированного эндометрия, не имеющих морфологических признаков ХЭ и с наличием ГЭ на фоне ХЭ. Частота метилирования и ИМ отражены в таблице.

Статистически достоверных различий по частоте метилирования гена RASSF1A в двух группах не отмечено. В каждой группе гиперметилирование гена RASSF1A встречалось как при ГЭ с атипией, так и при ГЭ без атипии (по одному случаю соответственно).

Ген CDH1, кодирующий Е-кадгерин, характеризовался отсутствием метилирования во всех клинических наблюдениях. Обращало на себя внимание повышение частоты гиперметилирования гена Р21WAF1 при ГЭ, развившейся на фоне ХЭ. Кроме того, ГЭ отличалась повышенной частотой метилирования CD44: 68,0% наблюдений во 2-й группе при сочетании ГЭ с ХЭ и 14,8% в 1-й группе в случае монопатологии слизистой оболочки матки. ИМ во 2-й группе оказался выше, чем в 1-й группе.

В различных исследованиях было убедительно показано, что хроническое воспаление сопровождается повышенным уровнем метилирования различных генов, в том числе относящихся к генам-супрессорам опухолевого роста.

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия II и III степени, а также морфологически неизмененные ткани в районе интраэпителиальной неоплазии демонстрируют аномальное метилирование генов Р16, MLH1, NM33 и др. [6]

Различные морфологические варианты ГЭ (простая ГЭ без атипии, сложная ГЭ без атипии, сложная ГЭ с атипией) и дифференцированная аденокарцинома эндометрия рассматриваются как прогрессирующие изменения гисто- и цитоархитектоники ткани с накоплением нозоспецифических молекулярно-генетических изменений клеток [4, 22, 23].

Важную роль в данном процессе играет метилирование генов, ответственных за апоптоз, репарацию ДНК, адгезию, ремоделирование межклеточного матрикса, ингибирование пролиферации [6, 8, 12, 13, 16, 17]. В нормальном эндометрии подобных изменений обнаружено не было. В то же время известно, что метилирование генов является одним из наиболее ранних изменений, происходящих в клетке до морфологического проявления заболевания [6]. Метилирование ряда ключевых генов, ответственных за функциональное ремоделирование ткани, значительно влияет на появление морфологических признаков гиперпластического процесса [6].

При ХЭ наблюдается снижение экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии, что, однако, нередко сочетается с очаговой ГЭ, аденомиозом и миомой матки и позволяет рассматривать данное заболевание как фактор риска гиперпластических заболеваний матки [3, 4].

RASSF1A как ген-супрессор опухолевого роста полифункционален. С одной стороны, RASSF1A участвует в регуляции RAS-киназного каскада и клеточного цикла (негативная регуляция) и, с другой стороны, - апоптоза и стабильности цитоскелета (позитивная регуляция) [6]. Ген с высокой частотой метилирован в злокачественных опухолях эпителиального происхождения, в том числе в опухолях эндометрия [16]. Мы не обнаружили достоверных различий по частоте метилирования гена RASSF1A в 1-й и 2-й группах, что свидетельствует об отсутствии влияния эпигенетической инактивации гена на развитие ХЭ. При этом частота метилирования гена RASSF1A при ГЭ в обеих группах оказалась повышенной, что согласуется с данными литературы [8, 15] о повышении частоты его метилирования при переходе от простой ГЭ к атипической ГЭ и аденокарциноме эндометрия.

Р21WAF1 является первичной мишенью активации транскрипции Р53 и регулятором клеточной кинетики. Р21 не только ингибирует активность циклинзависимых киназ, что препятствует вступлению клеток в S-фазу клеточного цикла, но и напрямую участвует в регуляции генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла, апоптоза и старения [6]. Р21 редко метилирован в опухолях, таковое обнаружено только в злокачественных опухолях предстательной железы, желудка, головы и шеи, рабдомиосаркомах, при остром лимфолейкозе и лимфоме Беркита [20].

При гиперпластических процессах и опухолях внутренних гениталий у женщин эпигенетический вариант инактивации Р21 ранее не был описан. Выявленное нами повышение частоты метилирования гена-супрессора P21 при ГЭ на фоне ХЭ позволяет предположить возможный механизм стимуляции пролиферативного сигнала, точнее отсутствие его подавления, в эндометрии на фоне хронического воспаления.

Особого внимания заслуживает выявленное повышение частоты метилирования гена CD44 в обеих группах больных с ГЭ, особенно во 2-й группе (сочетание ГЭ и ХЭ), что свидетельствует о роли данного гена в развитии ГЭ и о кофакторной роли хронического воспаления слизистой оболочки матки в данном процессе. CD44 принадлежит к семейству трансмембранных гликопротеинов, ответственных за межклеточное взаимодействие между эпителиальными клетками, эпителиальными и стромальными клетками, и является рецептором гиалуроновой кислоты [19, 21]. Отсутствие экспрессии в результате метилирования гена CD44 часто обнаруживается в различных типах злокачественных опухолей на самых ранних стадиях канцерогенеза. Гиперметилирование CD44 выявлено при локализованном и метастатическом раке предстательной железы, независимо от стадии и степени дифференцировки, а также при раке молочной железы [24], нейробластоме и различных вариантах лимфом [10]. При гиперпластических процессах и опухолях внутренних гениталий у женщин метилирование гена также ранее выявлено не было.

Отсутствие метилирования CDH1 в нашем исследовании, в том числе в 2 случаях атипической ГЭ, согласуется с данными литературы [17, 18] о связи между снижением экспрессии Е-кадгерина и развитием инвазивных форм аденокарциномы эндометрия.

Выводы

На основании полученных данных можно судить об избирательном потенцировании некоторых механизмов развития ГЭ в условиях хронического воспаления слизистой оболочки матки, а именно, об отсутствии ингибирования пролиферации клеток эндометрия по Р21-зависимому механизму и о нарушении связи клеток эндометрия с межклеточным матриксом посредством метилирования гена CD44.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail