Современные методы диагностики становятся более совершенными благодаря внедрению в практическую медицину метаболомических исследований для ранней диагностики соматических заболеваний [1, 2]. В результате совершенствования методов обнаружения и количественной оценки в области геномики, протеомики и метаболомики ротовая жидкость стала содержательным источником для выявления маркеров заболеваний, поскольку доказана корреляционная связь смешанной слюны с аналогичными показателями крови [2]. Тот факт, что слюна дает представление не только о физиологии органов полости рта, но и других систем органов организма человека, побудил некоторых исследователей выступать за использование слюны и ротовой жидкости в клинической диагностике [3—5].
Протеомные методы диагностики на основании изучения белковых маркеров ротовой жидкости являются предпочтительными, в том числе вследствие того, что в отличие от крови, мочи или спинномозговой жидкости, образцы слюны можно получать неинвазивно, легко и без применения дорогостоящего оборудования [6]. Уже опубликован ряд убедительных исследований, в которых доказано, что слюна может быть использована для раннего выявления ряда стоматологических заболеваний, а также онкологических заболеваний органов полости рта, легких, поджелудочной железы, молочной железы, а также вирусных инфекций и неврологических заболеваний [4, 5, 7, 8].
Однако в отличие от протеома слюны, метаболом слюны еще недостаточно изучен [9, 10]. В 2002 г. было впервые опубликовано исследование по изучению метаболома слюны методом ЯМР-спектроскопии для идентификации 63 и количественного определения 11 метаболитов [2, 11]. Для закрепления имеющихся знаний о метаболоме слюны и расширения диагностических возможностей ротовой жидкости была предпринята попытка изучения возможности использования метаболитов ротовой жидкости для диагностики цереброваскулярных заболеваний.
Цель исследования — оценить возможность использования ротовой жидкости для диагностики хронических форм нарушения мозгового кровообращения, учитывая показатели стоматологического статуса и параметрических данных спектров ЯМР 1H и 31P ротовой жидкости пациентов с цереброваскулярной патологией.
Материал и методы
Для реализации поставленной цели проведено обследование 50 пациентов в возрасте от 44 до 74 лет, которые были распределены на две исследуемые группы в соответствии с поставленным диагнозом. В основную группу исследования включены 29 пациентов с диагнозом по МКБ-10 I67.8 «хроническая ишемия мозга» в стадии декомпенсации. В контрольную группу вошел 21 пациент без соматической патологии в анамнезе. План клинического обследования состоял из сбора анамнеза, внешнего осмотра и осмотра полости рта с использованием стандартного набора одноразовых стоматологических инструментов. Для оценки стоматологического статуса был использован индекс КПУ, а также индекс гигиены полости рта ИГР-У (упрощенный индекс гигиены рта) по Greene—Vermillion. Ротовую жидкость пациенты самостоятельно собирали в пробирки типа эппендорф объемом 15 мл в течение 5—7 мин. До проведения спектрального анализа пробирки замораживали при температуре –4 °C.
Полученные образцы ротовой жидкости исследовали методом ядерной магнитной резонансной спектроскопии с изучением ядер изотопа водорода-1 (1H). При подготовке образцов ротовой жидкости к анализу пробирки размораживали при комнатной температуре и биологическую жидкость переносили с помощью автоматической пипетки в ЯМР-ампулы (D=5 мм) на высоту 50—60 мм. Затем в ампулы добавляли тяжелую воду (D2O) в количестве 5% от общего объема. Для получения спектров ЯМР 1H и 31P был использован спектрометр высокого разрешения AVANCE-300 (Bruker, Германия) по стандартной одноимпульсной программе, с предварительным насыщением сигналов воды в программе ZGPR. Для оценки взаимосвязи между дисциркуляторной энцефалопатией и состоянием полости рта был рассчитан коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Статистическая обработка данных была выполнена с использованием пакета программ SPSS 22.
Результаты и обсуждение
В ходе стоматологического обследования было выявлено, что у 72,6% пациентов с подтвержденным диагнозом нарушения мозгового кровообращения отмечаются жалобы на сухость полости рта. На этапе внешнего осмотра было выявлено, что у 81% пациентов с цереброваскулярными заболеваниями наблюдались опущение углов рта и сглаженность носогубных складок. Следует отметить, что в большинстве клинических случаев поражения отмечались только на одной половине лица. Были выявлены признаки девиации языка при проведении диагностических тестов. Значительные межгрупповые различия были отмечены при расчете индекса КПУ. Было установлено, что у пациентов с цереброваскулярной патологией индекс КПУ составил 19,17±1,68 и соответствовал высокому уровню интенсивности кариозного процесса (табл. 1).
Таблица 1. Показатели индекса КПУ в основной и контрольной группах исследования
| Группа | n | Компоненты индекса, n | Индекс КПУ, M±m | ||
| К | П | У | |||
| Основная | 23 | 24 | 42 | 138 | 19,17±1,68 |
| Контрольная | 19 | 15 | 22 | 105 | 14,55±2,37 |
При изучении результатов определения индекса гигиены рта было установлено, что в основной группе у 17,39% пациентов наблюдался хороший уровень гигиены, у 30,4% — удовлетворительный, у 39,1% — неудовлетворительный, 13% — плохой уровень гигиены. Было выявлено наличие пародонтальных карманов глубиной от 4 мм и более у 65,2% пациентов (рис. 1).
Рис. 1. Уровень гигиены полости рта у пациентов с хронической ишемией головного мозга и пациентов без соматической патологии.
По результатам ЯМР-спектроскопии было выявлено, что у пациентов с цереброваскулярной патологией сигналы органических молекул сильно различаются по величинам и пиковым интенсивностям. На рис. 2 и 3 приведены спектры ЯМР 1H образцов ротовой жидкости пациентов с цереброваскулярной патологией, а также интегральные интенсивности суммарного сигнала, принятого за 100%.
Рис. 2. Растянутый спектр ЯМР 1H органической части образца слюны пациента основной группы.
В верхней части спектра указаны химические сдвиги протонов (м.д. или ppm).
Рис. 3. Растянутый спектр ЯМР 1H органической части образца слюны пациента основной группы.
В верхней части спектра указаны химические сдвиги протонов (м.д. или ppm).
Детальную идентификацию сигналов в спектрах ЯМР 1H органических молекул ротовой жидкости проводили с использованием многомерных методов корреляционной спектроскопии ЯМР 1H и 13C. Было выявлено, что в ротовой жидкости основной исследуемой группы наблюдалось увеличение уровня молочной кислоты (сигнал протонов метила 1,41 м.д.) и снижение концентрации пировиноградной (сигнал протонов метила 2,29 м.д.). Полученные данные могут быть связаны с процессами окисления глюкозы в реакциях анаэробного гликолиза, что зачастую является отражением энергетических процессов головного мозга [9].
Известно, что практически важным и целесообразным для медицинских исследований является использование ЯМР-спектроскопии на ядрах 31P. На рис. 4 приведено семейство ЯМР 31P-спектров с широкополосным подавлением протонов — образцов ротовой жидкости условно здоровых пациентов и образцов смешанной слюны пациентов с диагнозом цереброваскулярного заболевания — дисциркуляторная энцефалопатия, декомпенсация. У контрольной группы пациентов химические сдвиги практически совпадают (+1,69 и +1,75 м.д.), а химические сдвиги сигналов у пациентов основной группы на 0,5÷0,7 м.д. меньше (+1,23 и +1,10 м.д.) относительно контрольной группы. Согласно данным литературы группы (PO4)n ротовой жидкости входят в состав структурированных жидких пленочных полимерных структур разной толщины, а величина n изменяется от 1 и более в зависимости от состояния здоровья или стадии болезни пациента [2]. Полученные данные позволяют предположить, что в образцах ротовой жидкости пациентов без соматических заболеваний толщина пленок меньше по сравнению с данными пациентами с цереброваскулярной патологией. Согласно исследованиям, существующая в составе смешанной слюны пленка выполняет в том числе защитную функцию [7]. Полученные показатели соответствуют представлению о том, что в результате действия защитных механизмов в ротовой жидкости больных с хронической формой нарушения мозгового кровообращения происходит утолщение биополимерной пленки, которая является одним из источников неорганического фосфора, необходимого для функционирования фосфорилазы, катализирующей добавление фосфатной группы к акцептору. Однако при увеличении толщины пленки повышается скорость образования минерализованных зубных отложений, что негативно сказывается на состоянии тканей пародонта и ухудшает гигиенический статус полости рта пациентов с цереброваскулярной патологией.
Рис. 4. Обзорные спектры ЯМР 31P с широкополосным подавлением протонов 1H образцов слюны здоровых людей (№1 и №2) и образцов слюны пациентов с хроническими формами нарушения мозгового кровообращения (№3 и №4).
Таким образом, по результатам проведенного исследования была установлена прямая корреляционная связь (R=0,98) между высокими значениями индекса КПУ (19,17±1,68), неудовлетворительным уровнем гигиены полости рта и изменениями спектров ЯМР 31P, 1H и 13C в образцах ротовой жидкости.
Заключение
Установлено изменение интенсивности сигналов протонов метильных групп ротовой жидкости пациентов с цереброваскулярной патологией (при 1,41 м.д. и при 2,29 м.д.), что характеризуется повышением концентрации молочной кислоты и снижением концентрации пировиноградной кислоты. У пациентов с нарушениями мозгового кровообращения выявлено уменьшение химического сдвига 31P на 0,5÷0,7 м.д. (+1,23 и +1,10 м.д.). Данные ЯМР-спектроскопии свидетельствуют о потенциальной возможности использования ротовой жидкости для диагностики цереброваскулярной патологии, что требует дальнейших научно-клинических исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.