Идентификация микроорганизмов на основе эффекта гигантского рамановского рассеивания

Методы экспресс-диагностики заболеваний и процессов микробной природы до недавнего времени развивались преимущественно на основе классических схем микробиологического анализа: выделение в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации по биохимическим, тинкториальным, антигенным и другим специфическим свойствам. Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность, практически исключает экспрессность диагностики и не удовлетворяет требованиям эпидемиологической и клинической практики, диагностики (по месту лечения).

Поэтому разработка и внедрение в клиническую практику цифровых экспресс-методов лазерной раман-флюоресцентной диагностики, позволяющих получать результаты исследования в максимально короткие сроки (минуты, часы), возможности проведения и завершения анализа без выделения искомого организма в чистой культуре, использования только нативного материала и/или привлечения элективных биосред для быстрого накопления возбудителей, высокой чувствительности и специфичности, производительности метода, его простоты, доступности и воспроизводимости анализов крайне необходима [3, 4].

При этом существующие лабораторные технологии ЛФД (лазерная флюоресцентная диагностика) не позволяют проводить видовую идентификацию микробов (ЛЭСА, Спектролюкс, Флюол) и не обладают достаточной аналитической чувствительностью (10⁸—10¹¹ КОЕ/мл, что не соответствует инициальным стадиям развития воспалительного процесса, объективной оценке эффективности его лечения и реабилитации) и специфичностью, относительно длительны (часы, сутки) и трудоемки [5].

В связи с этим основной целью нашего исследования было повышение эффективности ЛКД микробов на основе эффекта гигантского рамановского рассеивания и флюоресценции и цифровых технологий на их основе с высокой аналитической чувствительностью (10×4—10×5 КОЕ/мл) адекватной начальным стадиям воспалительного процесса и его реабилитации.

Задачи исследования

1. Разработать блок-схему АПК, алгоритм его программного продукта и экспресс-методику индикации микробов на основе эффекта гигантского рамановского рассеивания и флюоресценции.

2. Оценить аналитическую чувствительность разработанной методики.

3. Провести сравнительную характеристику рамановских спектров различных клинических штаммов, микробов и их изменение при действии на микроб антисептиков.

4. Оценить возможности и перспективы разработанной экспресс-методики индикации микробов в клинической стоматологии.

Материал и методы

Для исследования использовали суточные культуры B. subtillis, Candida, E. faecalis, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, S. haemoliticus, S. saprophyticus. Культуры выращивали на простых (МПА, МПБ) питательных средах с помощью нефлюоресцирующей подложки (представляет собой мембранный микробиологический фильтр, состоящий из смеси нитрата и ацетата целлюлозы, размер пор 0,45 мкм). Последние использовали для повышения эффективности индикации и выявления различий в спектрах микробов, исключения влияния флюоресцирующих пигментов питательной среды на результаты исследования спектров микробов.

Перед измерением спектров подложку с культурой помещали на предметное стекло и с помощью АПК ИнСпектр (рис. 1),

Рис. 1. Внешний вид АПК ИнСпектр различного назначения (с насадками и со световодом).

регистрировали спектр ЛКД (рамановского рассеивания и флюоресценции), проводили его оцифровку, анализ и интерпретацию. Аналогично проводили исследования спектров в виде мазков или взвеси микробов, помещенных на металлические наноструктурированные подложки (рис. 2),

Рис. 2. Подложка с металлическими наношариками серебра с электронного микроскопа.

усиливающие интенсивность спектра, исследуемого объекта в 10×6 раз. Такой методологический подход соответствовал и задачам исследования.

Схематически раман-люминесцентный комплекс ИнСпектр изображен на рис. 3.

Рис. 3. Структурная блок-схема раман-люминесцентного АПК комплекса ИнСпектр.

Он включает лазер с лазерным фильтром (1); систему зеркал и линз (2); систему, собирающую сигнал, рассеянный исследуемым объектом и Edge-фильтр (3); спектрометр с CCD-камерой и контроллером, который обеспечивает обратную связь управлением лазером и запись сигнала рамановского рассеяния и люминесценции (4); персональный компьютер (5), на который устанавливается специализированное программное обеспечение с необходимой базой данных.

Результаты

1. Разработка методики лазерной конверсионной диагностики (рамановская, флюоресцентные составляющие) основывалась на следующей блок-схеме исследования (рис. 4).

Рис. 4. Схема получения рамановского излучения. 1 — лазерный луч, возбуждающий образец; 2 — рассеивание луча во всех направлениях; 3 — частичное попадание света на детектор, который регистрирует раман-спектр; 4 — на спектре представлен свет на начальной частоте лазера (или рэлеевской) и спектральные особенности, характерные для каждого уникального образца.

2. Результаты исследования раман и/или раман-флюоресцентных спектров микробов представлены на рис. 5—12.

Рис. 6. Сравнение спектров различных клинических штаммов стафилококка. Красный и голубой спектры — спектры Staphylococcus haemolyticus от разных больных. Синий и зеленый спектры — спектры Staphylococcus aureus от разных больных. Фиолетовый и желтый спектры — спектры Staphylococcus saprophyticus от разных больных.

Рис. 7. Сравнение спектров P. aeruginosa и S. aureus.

Рис. 8. Спектры люминесценции суспензий Pseudomonas aeruginosa при разных объемных концентрациях.

Рис. 10. Спектры B. subtilis, Candida и E. faecalis.

Рис. 11. Сравнение спектров люминесценции E. coli (7 сут), S. aureus (3 сут), E. coli (3 сут).

Рис. 12. Определение чувствительности микробов к антимикробным препаратам.

Рис. 5, а. Спектры флюоресценции микробов при концентрации одного порядка (10×8 КОЕ/мл); б — сравнительные рамановские спектры S. aureus и каротина.

Из исследования видно, что спектры разных стафилококков различны, но одинаковы внутри одного вида.

На этих спектрах видны отличительные линии для каждой бактерии (фиолетовый спектр — B. subtilis, зеленый спектр — E. coli).

Для бактерии B. subtilis индивидуальны линии — 657 см^–1, 726 см^–1, 1248 см^–1, 1377 см^–1, 1466 см^–1, 1617 см^–1.

Для E. coli индивидуальны линии — 1140 см^–1, 1551 см^–1.

Метод раман-флюоресцентной диагностики также позволяет экспрессно выявлять низкие концентрации микробов по флюоресценции их порфиринов, выявляемых при использовании практически не флюоресцирующего детергента мирамистина (0,2% раствор) (см. рис. 13).

Рис. 13. Выявление низких коцентрации E. coli (150 КОЕ/мл) по флюоресценции их порфиринов, после детергентного воздействия раствора мирамистина (проводили без использования SERS-подложек).

Более того представленный биоотклик микробов отмечается только для их вегетативных форм (достоверно выраженное увеличение интенсивности раман-флюоресцентного сигнала) и отсутствует у убитых бактерий (например, кипячением).Такой методический прием в клинике позволит определять эффективность лечения ран (при гнойном воспалении), осуществлять адекватный выбор антимикробной терапии.

Из представленных результатов исследования следует, что исследования спектров микробов на подложке или без таковых практически не изменяет амплитудно-спектральной характеристики объекта исследования. Более того выявлены видовые различия в спектрах исследуемых структур за счет проявления их специфических рамановских спектров. Показано, что спектры ЛКД (рамановского рассеивания и флюоресценции) исследованных культур зависят от возраста культур. Спектры моментно изменяются, а их специфические рамановские линии сохраняются. Такая вариабельность свидетельствует о том, что видовая идентификация микробов проводится только при регистрировании рамановских спектров. При сравнительном изучении чувствительности и специфичности микробов методом ЛКД (ИнСпектр) показано (при повторении измерений по 100 раз для каждого вида микробов), что она составляет соответственно практически 100% в обоих случаях показано, что при этом аналитическая чувствительность достигала предела концентрации микробов — 150 КОЕ/м—10×4 КОЕ/мл. (что практически по аналитической чувствительности соответствует бактериологическому методу — 10×4—10×5 КОЕ/мл).

В отдельном эксперименте изучали возможность использования экспресс-ЛКД технологии для определения экспресс-чувствительности к антимикробным препаратам. Из рисунка следует, что при создании смеси хлорамин—микроб (P. aeruginosa) в водной среде микроб (точнее его амплитудно-спектральные характеристики) распадается и его специфические амплитудно-спектральные характеристики исчезают (объект разрушен и не идентифицируется) в отличие от контрольных объектов сравнения (хлорамин—водный раствор). Время исследования составило 2—3 мин.

Таким образом, применение технологии ЛКД гигантского рамановского рассеивания и флюоресценции, как новой технологии открывает возможность ее для экспресс-индикации микробов, определение их видовой специфичности, чувствительности микробов к антимикробным препаратам и в других областях клинической микробиологии на основе принципиальных требований современной медицины «диагностика по месту лечения». Дальнейшее совершенствование программного продукта, базы данных и методик ЛКД в интересах больного и врача, качества и эффективности диагностики и лечения пациентов позволит внедрить ее в повседневную клиническую практику.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Все авторы в равной степени принимали участие в подготовке материала.

*e-mail: edita@mail.ru