Биологическая и геномная характеристика фага Ec2-7 с антимикробной активностью против STEC-штаммов Escherichia coli

Шигатоксин-продуцирующие бактерии E. coli (STEC) являются одной из основных причин бактериальных заболеваний пищевого происхождения, проявляющихся от легкой диареи до тяжелых форм, таких как гемолитико-уремический синдром (ГУС) [1]. STEC может быть частью нормальной микрофлоры некоторых животных, например, крупного рогатого скота, и передаваться людям через сырое или недожаренное мясо, а также загрязненную пищу и воду [2]. По данным ФАО и ВОЗ, ежегодно регистрируется более 1,2 млн случаев заражения бактериями STEC через пищу, что приводит к смертельным исходам и потере многих лет жизни с учетом инвалидности (DALY) [3].

Проблема антибиотикорезистентности продолжает набирать остроту, особенно в случаях инфекций, вызванных патогенными штаммами E. coli, такими как STEC [4]. С увеличением применения антибиотиков в медицинской и ветеринарной практике, а также в сельском хозяйстве, наблюдается рост устойчивости E. coli к различным классам антибактериальных препаратов. Это приводит к снижению эффективности традиционного лечения инфекций, вызванных этими штаммами, что представляет угрозу для общественного здравоохранения [5—7].

Дефицит новых антибиотиков способствует активному поиску альтернативных методов лечения, и в последние годы исследователи все чаще обращаются к использованию бактериофагов, как альтернативе традиционным антибактериальным препаратам [8, 9].

Целью настоящего исследования было охарактеризовать новый бактериофаг Ec2-7 с помощью биологических и молекулярно-генетических методов, провести филогенетический анализ и получить оценку его антимикробной активности in vitro в отношении STEC.

Бактериофаг Ec2-7, выделенный из сточных вод Московской области, был выбран объектом исследования благодаря его высокой специфичности и эффективности в отношении патогенных штаммов Escherichia coli, включая STEC штаммы. Бактериофаг выращивали на ГМФ-агаре (НИЦФ, Россия) с использованием непатогенного штамма E. coli M7 (141 ST) по описанной методике [10] и суспендировали в 0,9% NaCl. Средний титр фага составлял ≥10¹⁰ БОЕ/мл.

Адсорбцию фага Ec2-7 оценивали по количеству неадсорбированного вируса. Экспоненциально растущие клетки штамма-хозяина смешивали с фагом (MOI=0,01) и инкубировали при 37 °C. Через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 и 20 мин отбирали по 100 мкл смеси, добавляли 850 мкл SM-буфера и 50 мкл хлороформа. Образцы центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин при 4 °C. Титр фага в начальный момент принимали за 100%.

Латентный период и урожайность. Культуру (5 мл) инкубировали при 37 °C до середины экспоненциальной фазы (OD600=0,4), затем центрифугировали (7000 об/мин, 5 мин, 4 °C). Осадок ресуспендировали в 4,5 мл бульона ГМФ (НИЦФ, Россия) и добавляли фаг (MOI=0,01). После 5-минутной адсорбции при 37 °C смесь центрифугировали (12 000 об/мин, 2 мин) для удаления неабсорбированных фагов. Осадок ресуспендировали в 10 мл бульона ГМФ и инкубировали при 37 °C. Образцы (100 мкл) отбирали каждые 10 мин в течение 80 мин, добавляли в 850 мкл SM-буфера и 50 мкл хлороформа, затем определяли титр. Урожайность рассчитывали как отношение среднего максимального количества высвободившихся фагов к среднему числу частиц в латентный период. Результаты представлены как средние значения±стандартное отклонение (n=3).

Для оценки pH-стабильности 100 мкл бактериофага Ec2-7 (1×10⁶ БОЕ/мл) инкубировали 1 ч в бульоне ГМФ с pH 3—10, после чего измеряли титр. Термостабильность оценивали путем инкубации 1,5 мл фаговой суспензии (1×10⁶ БОЕ/мл) при 30—80 °C в течение 1 ч в термостате «Гном» (ДНК-технологии, Россия). Аликвоты (100 мкл) анализировали методом двойных агаровых слоев. Все эксперименты проводили в трех повторах.

Оценку спектра литической активности определяли в отношении 13 STEC штаммов методом spot-теста (табл. 1).

Таблица 1. Штаммы STEC, использованные для определения спектра литической активности бактериофага Ec2-7

Бактериофаг с титром ≥10⁹ БОЕ/мл фильтровали через насадку с диаметром пор 0,22 мкм и обрабатывали DNase I (NEB, США). ДНК выделяли с использованием набора К-Сорб (ООО «НПФ Синтол», Россия) по инструкции производителя, затем фрагментировали ультразвуком (Bioruptor UCD-200, Diagenode, Бельгия). Библиотеки для секвенирования готовили с набором NEBNext (NEB, США) и баркодами Ion XpressTM (Thermo Fisher Scientific, США). Длину фрагментов и концентрацию оценивали на Bioanalyzer 2100 с набором Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США). Клональную амплификацию проводили с набором Ion PI Template OT2 200 Kit v3 (Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование выполняли на Ion Proton с использованием Ion PI Sequencing 200 Kit v3 и чипа Ion PI Chip Kit v2 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколам производителя.

Сборку геномов осуществляли с использованием программного обеспечения Newbler (Roche/454 GS-FLX). Сравнение собранных геномов бактериофагов с геномами известных аннотированных бактериофагов проводили при помощи алгоритма blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI.

Аннотацию генома фага проводили с использованием RAST [11]. Гены вирулентности и устойчивости к антибиотикам оценивали с помощью VirulenceFinder v2.0 и ResFinder v2.4 на платформе Centre for Genomic Epidemiology (CGE) с порогом идентичности 95%. Открытые рамки считывания (ORF) предсказывали с использованием ORFFinder с параметрами по умолчанию (www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).

Филогенетический анализ проводили для оценки сходства фага Ec2-7 с фагами из базы данных NCBI. Собранный геном загружали в ViPTree [12] с настройками по умолчанию (дцДНК, хозяева: прокариоты). Для построения филогенетического дерева отобрали 13 геномов фагов с идентичностью 95,3—97%. Полученные данные использовали для таксономической классификации с применением VIRIDIC [13] с порогом вида 95% и порогом рода 70%.

Культуру бактерий выращивали в 10 мл бульона ГМФ (НИЦФ, Россия) при 37 °C в течение 18 ч. Затем методом десятикратных разведений доводили концентрацию до ~10⁶ КОЕ/мл. Фаг Ec2-7 (10⁷ БОЕ/мл) в количестве 100 мкл добавляли к 4 мл бактериального раствора. Для контроля в 4 мл бактериального раствора добавляли тот же объем 0,9% NaCl. Опытные и контрольные образцы инкубировали при комнатной температуре, а количество бактерий определяли через 0, 2, 4 и 6 ч инкубации, проводя посев 100 мкл на агар Мак-Конки (HiMedia, Индия).

Статистическую обработку результатов проводили в программе BioStat 2009 («AnalystSoft, Inc.», США). Оценку нормальности распределения проводили с помощью теста Шапиро—Уилка для малых выборок. Статистический анализ значимых различий между опытной и контрольной группами проводили с использованием дисперсионного анализа и U-критерия Манна—Уитни для независимых выборок (p<0.05).

Бактериофаг Ec2-7, выделенный из сточных вод в Московской области в 2019 г., при культивировании на индикаторной культуре Escherichia coli M7 образует прозрачные колонии диаметром 0,5—1 мм (рис. 1). Детальная характеристика бактериофага представлена в табл. 2.

Рис. 1. Морфология негативных колоний бактериофага Ec2-7.

Таблица 2. Краткое описание характеристик бактериофага Ec2-7

Протеомное дерево фага Ec2-7 построено на основе полных геномных последовательностей близкородственных фагов, отобранных из общего протеомного дерева в Viptree. Дерево построено на основе матриц геномных расстояний и укоренено в средней точке. Длины ветвей логарифмически масштабированы от корня протеомного дерева, а числа сверху отображают логарифмически масштабированные длины ветвей на основе значений SG (по нормализованным оценкам tBLASTx).

Филогенетический анализ протеома фага с помощью ViPTree показал, что бактериофаг принадлежит к группе хозяев Pseudomonadota, как показано на филогенетическом дереве на рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_034_add.zip. VIRIDIC показал межгеномное сходство между исследуемым фагом и другими близкородственными фагами из базы данных NCBI (рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_034_add.zip). Фаг Ec2-7 показал 89,3% межгеномного сходства с Escherihia phage ESCO5, ранее выделенного для борьбы с колибактериозом птиц и обладающим литической активностью против патогенного штамма Cp6Salp3 [14].

В соответствии с руководством Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) [15], данные сравнительного геномного анализа указывают на то, что фаг Ec2-7 является новым представителем класса Caudoviricetes, подсемейства Stephanstirmvirinae и рода Phapecoctavirus. Род Phapecoctavirus был описан I.H.E. Korf и соавт. [16] на основе фага phAPEC8 [17], выделенного из воды для птицы в 2012 г. Широкий спектр источников фагов этого рода (вода, компост, фекалии человека, фермерские куры и птицы) [14, 18] свидетельствует о способности инфицировать E. coli различного происхождения, что делает их перспективными кандидатами для биоконтроля E. coli в пищевых продуктах, а также для фаготерапии, при лечении инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами E. coli в медицине или ветеринарии.

Оценку антимикробной активности бактериофага Ec2-7 проводили с использованием штамма STEC №158 (eae+, stx2+), выделенного от поросят с клиническими признаками кишечной инфекции. Штамм был предоставлен лабораторией диагностики и мониторинга антибиотикорезистентности возбудителей клинически значимых инфекционных болезней животных Всероссийского института экспериментальной ветеринарии (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН).

Антимикробную активность Ec2-7 против STEC 158 оценивали в питательном бульоне ГМФ. По данным проведенного исследования, обработка фагом Ec2-7 приводила к статистически значимому снижению численности STEC штамма. Через 4 ч после инкубации с бактериофагом наблюдалось уменьшение количества бактериальных клеток на 92,5% по сравнению с контролем. К 6-му часу эксперимента антибактериальный эффект усиливался, достигая снижения 99,7% (табл. 3).

Таблица 3. Антимикробная эффективность бактериофага Ec2-7 invitro

Примечание: n=3; M±Sd; * p<0.05)

Результаты исследования подтверждают, что фаг Ec2-7 является новым представителем рода Phapecoctavirus, обладающим высокой скоростью адсорбции и коротким латентным периодом. Фаг демонстрирует устойчивость к различным неблагоприятным факторам окружающей среды и эффективно лизирует штаммы STEC. Геномный анализ показал отсутствие генов антибиотикорезистентности, вирулентности и токсинов, что делает Ec2-7 перспективным кандидатом для использования в качестве альтернативного средства контроля E. coli.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.